Methodenartikel

Beeldvorming van levende cellen van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose

DOI:

10.3791/69495

⸱

14 november 2025

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Heart Institute, Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een live-cel beeldvormingsmethode voor het monitoren van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose, met behulp van fluorescerende sondes die veranderingen in de integriteit en verzuring van het lysosomale membraan detecteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necroptose, een vorm van gereguleerde necrose, culmineert in celmembraanruptuur. Ons laboratorium en anderen hebben ontdekt dat lysosomale membraanpermeabilisatie (LMP) een vroege en cruciale gebeurtenis is in dit proces, voorafgaand aan membraanruptuur. Snelle LMP maakt krachtige lysosomale enzymen, met name proteasen, vrij in het cytosol, waardoor celdood actief wordt bevorderd. Live-cell beeldvorming is een hulpmiddel van onschatbare waarde voor het in realtime detecteren van LMP tijdens necroptose. Verschillende fluorescerende kleurstoffen zijn zeer effectief: (1) pH-gevoelige LysoTracker-kleurstoffen volgen veranderingen in de lysosomale pH. Een afname van het fluorescentiesignaal duidt op een verlies van de lysosomale pH-gradiënt, een primair teken van lysosomale disfunctie, dat een voorloper of direct gevolg van LMP kan zijn. (2) Fluoresceïne-gelabelde dexternekorrels worden geïnternaliseerd en hopen zich op in lysosomen. Hun afgifte in het cytosol signaleert volledige LMP en ladinglekkage. Hier zagen we een progressief verlies van Lysotracker-fluorescentie, met diffuse Dextran-fluorescentie in het cytosol na necroptose-inductie. De beeldvormingsmethodologie voor levende cellen stelt onderzoekers dus in staat om de timing en omvang van lysosomale disfunctie nauwkeurig te volgen, wat bijdraagt aan een beter begrip van necroptose-mechanismen en potentiële therapeutische interventies verlicht.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Necroptose is een caspase-onafhankelijke vorm van gereguleerde celdood die betrokken is bij veel ontstekingsziekten, neurodegeneratieve aandoeningen, long-, lever- en hartaandoeningen 1,2,3. Deze route wordt gemedieerd door een complexe cascade van reacties die culmineren in de activering van receptor-interagerend proteïnekinase 1 (RIPK1), dat interageert met receptor-interagerend proteïnekinase 3 (RIPK3) via hun homotypische RIP-interactiemotief (RHIM) domeinen 4,5,6. RIPK3 rekruteert op zijn beurt kinase-achtig eiwit (MLKL) om het necrosoom 7,8 te vormen. Fosforylering van MLKL door RIPK3 leidt tot oligomerisatie en daaropvolgende polymerisatie. MLKL-polymeren verplaatsen zich vervolgens naar de celmembranen, wat uiteindelijk leidt tot celmembraanruptuur en celdood 9,10,11. De mechanismen waarmee MLKL-polymeren naar de membraancompartimenten transloceren en membraanverstoring induceren, worden echter niet volledig begrepen.

Lysosomen zijn organellen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak en recycling van cellulaire materialen. In het lumen bevinden zich proteasen, lipasen, nucleasen en hydrolasen die verantwoordelijk zijn voor het verteren van macromoleculen, waardoor de cellulaire homeostase behouden blijft12,13. Daarom is het behoud van de lysosomale integriteit en een goede functie essentieel voor het waarborgen van effectieve cellulaire klaring, aanpassingen aan stress en de algehele celoverleving 14,15,16. Recente studies wijzen op een verband tussen necroptose en lysosomale membraanpermeabilisatie (LMP)17,18,19.

Onze recente waarnemingen hebben aangetoond dat LMP een vroege en belangrijke gebeurtenis is in het necroptoseproces, voorafgaand aan de uiteindelijke breuk van het celmembraan19. In het bijzonder induceert MLKL-polymerisatie op het lysosomale membraan snelle LMP om krachtige lysosomale enzymen, met name proteasen, waaronder cathepsine B, in het cytosol vrij te maken. Deze proteasen splitsen vervolgens vitale eiwitten om celdood te bevorderen. Belangrijk is dat het remmen van CTSB-activiteit sterk beschermt tegen celdood 19,20. Deze gegevens suggereren dat LMP een cruciale modulator is van de necroptoseroute. Daarom is het monitoren van de timing van LMP tijdens necroptose essentieel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen en het identificeren van potentiële therapeutische doelen.

Veel conventionele LMP-detectiemethoden, zoals immunokleuring, transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) of flowcytometrie, vereisen vaste monsters of leveren anderszins alleen eindpuntinformatie 21,22,23, waardoor het dynamische proces van lysosomale verstoring niet kan worden vastgelegd, met name in de context van snelle progressie van necroptose. De live-cell beeldvormingsmethode daarentegen maakt real-time visualisatie van LMP met hoge resolutie mogelijk tijdens necroptose. In dit protocol hebben we twee complementaire lysosomale markers gecombineerd en necroptose in HT-29-cellen geïnduceerd om de integriteit van het lysosomale membraan in realtime te analyseren19. Deze techniek biedt een robuust en aanpasbaar platform voor het bestuderen van LMP, niet alleen bij necroptose, maar mogelijk ook bij andere vormen van celstress waarbij de lysosomale integriteit in het gedrang komt, met name in de context van ziekten of het gebruik van lysosoomgerichte therapieën 24,25,26.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celcultuur - dag 0

  1. Plaat 5.000 cellen in 2 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline en streptomycine (P/S) in een steriele schaal met glazen bodem.
  2. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 °C met 5% CO2 .

2. Dextran bead loading - dag 1

  1. Verdun dextran groene korrels tot 25 μg/ml in verse DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S door 20 μl van de 2,5 mg/ml stockoplossing toe te voegen.
  2. Verwijder het oude medium en vervang het door 2 ml kralenhoudende DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S.
  3. Incubeer de cel gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2 om de internalisatie van de kralen in lysosomen mogelijk te maken.

3. Lysotracker kleuring - dag 2 (experimentdag)

  1. Bereid het kleurmedium voor door 2 μL 1 mM Lysotracker stockoplossing toe te voegen aan 2 ml verse DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S om een eindconcentratie van 1 μM te verkrijgen. Vervang het oude medium door deze kleuringsoplossing.
  2. Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2 uur, volgens de aanbevolen incubatietijd (30 minuten tot 2 uur) die is vermeld in de Guidelines for Use from Molecular Probes by Life Technologies27. In onze experimenten resulteerde 2 uur incubatie in HT-29-cellen in robuuste puncta-kleuring met sterke colokalisatie met dextan-kralen, wat wijst op een stabiele kleurstoffluorescentie.
    NOTITIE: Schakel de confocale microscoop 30 minuten voor beeldvorming van levende cellen in.

4. Confocale microscoopopstelling

  1. Schakel de confocale systeemcomponenten in de volgende volgorde in: PC-microscoop; scanner kracht; laservermogen; laseremissie; Leica-kracht.
  2. Zet de omgevingsregelaars aan: De Cube - temperatuurregelaar; De Brick - CO2 gasmenger controller. Open CO2 en O2 toevoer.
  3. Gasparameters instellen:
    1. Stel de temperatuurregelaar (de kubus) in op 37 °C.
    2. Stel de gas- en vochtigheidsregelaar (de steen) in op 5% CO2 en 95% luchtvochtigheid.
  4. Zet de beeldkamer in elkaar zoals weergegeven in afbeelding 1.
  5. Stel de confocale doelstelling in:
    1. Gebruik een 63x/1.40 NA olie-immersief.
    2. Stel de excitatielasers in op 488 nm (groene fluorofoor) en 555 nm (rode fluorofoor).
    3. Selecteer voor de 488 nm-laser een hybride (HyD) detector en voor de 555 nm-laser een PMT-detector.
      OPMERKING: Fluorescentieoverspraak werd geminimaliseerd door gebruik te maken van vooraf gedefinieerde poorten in de confocale software, die bevestigden dat er geen overspraak tussen de kanalen was.

5. Preparaat na het kleuren (na incubatie van LysoTracker)

  1. Was de cellen drie keer zorgvuldig met 2 ml PBS.
  2. Voeg 2 ml verse DMEM toe, aangevuld met 10% FBS en 1% P/S.
  3. Breng een druppel onderdompelingsolie aan op de objectieflens voordat u beeldvorming maakt.
  4. Monteer de schaal op de microscooptafel.
  5. Pas de laserintensiteit en achtergrond aan.
    1. Pas de laserintensiteit aan tot 3%, maar niet meer dan 5%.
    2. Pas de detectorversterking aan in de microscoopsoftware om het signaal te optimaliseren.
    3. Als u de achtergrond wilt minimaliseren, past u de contrastbalk aan.
  6. Verkrijg basislijnbeelden van onbehandelde cellen (vóór T/S/Z-toevoeging), die dienen als controleconditie.
  7. Plaats de plaat terug in de laminaire stromingskap en voeg 1 ml DMEM toe, aangevuld met 10% FBS en 1% P/S, met 100 ng/ml TNF-α (T), 500 nM SMAC-mimeticum (S) en 100 μM Z-VAD-FMK (Z).
  8. Ga door met beeldvorming op de confocale microscoop.
    OPMERKING: T/S/Z zijn opzettelijk toegevoegd in hogere concentraties dan de standaardprotocollen. Deze keuze is gemaakt om LMP en celdood te versnellen, waardoor vroege gebeurtenissen betrouwbaarder kunnen worden vastgelegd in real-time beeldvorming.

6. Instellingen voor beeldacquisitie

  1. Stel in de acquisitiesoftware de volgende parameters in: modus: xyt; formaat: 512 x 512; snelheid: 400; zoom: 3; lijn gemiddelde: 1; lijn accumulatie: 3; frame accumulatie: 1; tijdsinterval: 3 min; Duur: 8 uur; Autofocus inschakelen.
  2. Klik op Start om de time-lapse-acquisitie te starten.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De procedures die in dit protocol worden beschreven, maken het mogelijk om live-celbeelden te verkrijgen met behulp van confocale microscopie om LMP in realtime te volgen. Figuur 1 illustreert een schematische weergave van het experimentele protocol, van celbeplating tot beeldacquisitie. Op dag 0 werden 5.000 HT-29-cellen geplateerd en gedurende 24 uur geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2. Na 24 uur (dag 1) werden de cellen geïncubeerd met fluoresceïne-gelabelde dextraankorrels (25 μg/ml) gedurende nog eens 24 uur onder dezelfde omstandigheden. Deze kralen worden geïnternaliseerd door endocytose en verkeer naar de lysosomen, waar ze zich ophopen en verschijnen als heldere puncta. Op dag 2 (experimentdag) werden de cellen gedurende 2 uur behandeld met pH-gevoelige LysoTracker-kleurstof (1 μM) bij 37 °C en 5% CO2. LysoTracker concentreert en vertoont sterke fluorescentie in zure compartimenten, zoals late endosomen en lysosomen. Dertig minuten voor de beeldvorming werd het confocale microscoopsysteem ingeschakeld en gestabiliseerd, inclusief temperatuur-, gas- en vochtigheidsregelaars, zoals beschreven in stap 4 van het protocol. De beeldkamer werd in elkaar gezet, zoals te zien is in figuur 2. Er werd gebruik gemaakt van de lasers van 488 nm (groen) en 555 nm (rood).

Na incubatie met LysoTracker werden de cellen drie keer zorgvuldig gewassen met PBS en werd 2 ml verse DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S toegevoegd. De plaat werd overgebracht naar de microscoop en een druppel dompelolie werd aangebracht op het 63x/1.40 NA olie-immersieobjectief. De laserintensiteit en achtergrondniveaus werden vervolgens aangepast om de beeldvormingsomstandigheden te optimaliseren, zoals beschreven in stap 5.5. van het protocol. Onze eerste beelden bevestigden de aanwezigheid van stabiele puncta van de Lysotracker en fluoresceïne-gelabelde dextran, wat wijst op intacte lysosomen (Figuur 3). De basislijnbeelden werden vóór T/S/Z verkregen en als controle gebruikt. Er werd geen voertuig toegepast.

Na het vaststellen van de eerste beeldvormings- en microscopie-instellingen, werd de plaat teruggebracht naar de laminaire stromingskap en werd 1 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S, bevattende 100 ng/ml TNF-α (T), 500 nM SMAC-mimeticum (S) en 100 μM Z-VAD-FMK (Z) toegevoegd. De beeldvorming werd voortgezet op de confocale microscoop met behulp van de beeldvormingsacquisitieparameter die wordt beschreven in stap 6 van het protocol. Zoals te zien is in Figuur 3, Aanvullende film S1 en Aanvullende film S2, diende de progressieve afname van de LysoTracker-fluorescentie in met T/S/Z behandelde cellen als een vroege indicator van lysosomale verandering. Dit verlies werd gevolgd door, en trad af en toe gelijktijdig op, de uitstroom van fluoresceïne-gelabeld dextran van de lysosomen in het cytosol (punctaat-naar-diffuse verschuiving), wat wijst op LMP. Om 8 uur verdween bijna al het Lysotracker-signaal, maar veel cellen behielden nog steeds groene puncta met een cytosolisch groen signaal, wat suggereert dat verlies van lysosomale pH-gradiënt voorafgaat aan volledige LMP en vrijgave van lading.

Figuur 1
Figuur 1: Schematische weergave van het experimentele protocol. (Gemaakt in BioRender.com) Aanvankelijk werden 5.000 cellen geplateerd (0 uur) en gedurende 24 uur geïncubeerd; daarna werden Dextran-korrels (25 μg/ml) toegevoegd en nog eens 24 uur geïncubeerd. Om 48 uur werd LysoTracker (1 μM) toegevoegd en gedurende 2 uur geïncubeerd. De cellen werden driemaal gewassen met PBS (stap 1), gevolgd door de toevoeging van 2 ml verse DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S (stap 2). De microscopie-instellingen werden aangepast (stap 3) en de cellen werden behandeld met TNF-α (T), SMAC-mimetisch (S) en pan-caspaseremmer Z-VAD-FMZ (Z) (stap 4), voordat ze levende cellen beeldacquisitie (stap 5). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Schema van de opstelling van de beeldkamer. (A) De monsterhouder, (B) de gasincubatiekamer en (C) het bovenste deksel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Representatieve beelden van HT29-cellen voor en na T/S/Z-behandeling. De cellen werden gekleurd met rode en Dextran groene bolletjes van Lysotracker en behandeld met TNF-α (T), SMAC-mimeticum (S) en pan-caspaseremmer Z-VAD-FMZ (Z). Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Aanvullende film S1: Time-lapse van HT29-cellen geïncubeerd met Dextran groene kralen en behandeld met T/S/Z. De cellen werden gedurende meer dan 6 uur gevolgd om de cellulaire respons te beoordelen. Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullende film S2: Time-lapse van HT29-cellen geïncubeerd met LysoTracker rood en behandeld met T/S/Z. De cellen werden gedurende meer dan 6 uur gevolgd om de cellulaire respons te beoordelen. Klik hier om deze film te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol toonde aan dat de combinatie van zowel LysoTracker als fluoresceïne-gelabelde dextraankorrels gelijktijdige monitoring van de lysosomale pH en de afgifte van lading in realtime mogelijk maakt. De representatieve resultaten (Figuur 3, Aanvullende film S1 en Aanvullende film S2) bevestigen dat onbehandelde cellen een stabiel puncta-signaal behouden voor beide markers. Daarentegen duidt T/S/Z-behandeling op een progressief verlies van Lysotracker-intensiteit en een verschuiving van dextran van puncta naar diffuse cytosolische distributie, consistent met LMP.

Een cruciale eerste stap in dit protocol is het selecteren van de cellen voor beeldacquisitie. Onze eerdere gegevens tonen aan dat T/S/Z-behandeling de dood van ongeveer 80% van de HT-29-cellen binnen 24 uur veroorzaakt, terwijl de resterende 20%er 19 overleeft. Aangezien LMP niet aanwezig is aan het begin van het experiment, worden cellen in eerste instantie geselecteerd op basis van morfologie en hun dubbele positieve signaal voor zowel LysoTracker- als Dextran-kralen. Hoewel deze methode niet kan voorspellen welke specifieke cellen LMP zullen ondergaan, hebben we consequent vastgesteld dat ongeveer 60% van de gemonitorde populatie uiteindelijk LMP vertoont tijdens de beeldvormingsperiode van 8 uur. Een andere uitdaging komt voort uit de inherente aard van sequentiële beeldvorming. Een lichte afwijking in de Z-positie van de cel, die optreedt tijdens het verkrijgen van beelden om de 3 minuten, verhindert het continu volgen van hetzelfde puncta-signaal gedurende het hele experiment. Bovendien migreren de cellen en ondergaan ze morfologische veranderingen als reactie op T/S/Z-behandeling28. Bijgevolg is het onmogelijk om de dynamiek van individuele lysosomen gedurende de beeldvormingsperiode te volgen. Bij beeldvorming van levende cellen op lange termijn is de mogelijke bijdrage van fototoxiciteit als mediator van celdood een belangrijke overweging. Continue excitatie tijdens langdurige sessies kan reactieve zuurstofsoorten genereren en de levensvatbaarheid van cellen aantasten29, waardoor de echte necroptotische respons mogelijk wordt verstoord. Om dit effect te minimaliseren, hebben we een laag laservermogen en korte belichtingstijden toegepast. Bovendien werd een vijfvoudige concentratie van T/S/Z toegediend om het celdoodproces te versnellen. We kunnen de bijdrage van door licht geïnduceerde stress aan de waargenomen lysosomale veranderingen echter niet volledig uitsluiten.

Een belangrijk voordeel van dit live-cell beeldvormingsprotocol is de mogelijkheid om lysosomale pH-verandering en LMP in realtime te volgen, waarbij dynamische gebeurtenissen worden vastgelegd die worden gemist door eindpuntanalyses, zoals TEM, flowcytometrie en immunokleuring. Hoewel TEM structureel inzicht in hoge resolutie biedt, kan het de temporele progressie van LMP niet vastleggen. Alternatieve methoden voor levende cellen, zoals acridine orange relocation assays30 of galectine-puncta formation31, zijn ook waardevolle hulpmiddelen voor het monitoren van de lysosomale integriteit, maar elk heeft beperkingen wanneer ze afzonderlijk worden gebruikt. De acridine-sinaasappeltest rapporteert de herverdeling van kleurstof van zure organellen naar het cytosol, die wordt beïnvloed door zowel lysosomale pH-veranderingen als membraanpermeabilisatie, en daarom niet direct correleert met het vrijkomen van lading. Evenzo weerspiegelt de vorming van galectine-puncta de blootstelling van luminale glycanen aan het cytosol en markeert dus lysosomale membraanbeschadiging31,32, maar het maakt geen onderscheid tussen gedeeltelijke permeabilisatie en volledige lysosomale ruptuur.

De kernkracht van dit protocol ligt in het combineren van LysoTracker en dextraankorrels, waardoor gelijktijdig onderzoek naar lysosomale verzuring en lekkage van lading mogelijk is. Dit zorgt voor een unieke, dubbele uitlezing van zowel de lysosomale functionaliteit als de structurele integriteit. LysoTracker-vervaging fungeert als een indicator van een verandering in de lysosomale pH, terwijl de afgifte van dextran direct de fysieke lekkage van lysosomale inhoud rapporteert. Door deze twee markers samen te gebruiken, verbeteren we de detectie van zowel gedeeltelijke als volledige LMP aanzienlijk. Daarom is deze strategie voor live-cell imaging breed toepasbaar. Onderzoekers kunnen het aanpassen voor gebruik met andere celtypen en verschillende fluorescerende sondes om de lysosomale integriteit te bestuderen onder verschillende experimentele omstandigheden, waaronder farmacologische of genetische verstoringen. Dit vermogen is de sleutel tot het vergroten van ons begrip van necroptosemechanismen en het identificeren van mogelijke therapeutische interventies.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onderzoek in het laboratorium van Dr. Zhigao Wang wordt ondersteund door NIH-subsidies R35GM158455 en R01GM147474.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HT-29 cellenATCCHTB-38Colonkankercellen
35 mm glazen bodemschaalMatTek CorporationP35G-1.5-14-C-GRD
CO2 IncubatorPHCBIMCO-170AICUVL
Confocal MicroscoopLeicaSP8WLL
Dextran groene kralenThermoFisherD1820Dextran, Fluorescein, 10.000 MW, Aanionisch, Lysine Fixable
Dulbecco`s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)Corning 10-013-CV
Fetaal bovien serum (FBS)Cytiva SH30910.03
LysoTracker Red DND-99InvitrogenL7528
Olie-immersie type HFElectron Microscopy Sciences16915-01
Penicilline en Streptomycine (P/S) Sigma-AldrichP4333
Fosfaatbuffer oplossing (PBS)Corning21-040-CV
Smac mimetic (S)BV6, ApexBio, CatalogB4653Eindconcentratie, 1 mM
The Brick Life imaging services13685Gas Mixer CO2 Controller
The CubeLife imaging servicesCBO2ATemperatuurregeling Kamer microscopen
Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-α - T)Peprotech30001A100UGEindconcentratie, 20 ng/ml
z-VAD-FMK (Z)ApexBioA1902Eindconcentratie, 20 mM

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. Necroptosis in development and diseases. Genes Dev. 32, 327-340 (2018).
  2. Kang, K., Park, C., Chan, F. K. Necroptosis at a glance. J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).
  3. Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death. Mol Cell. 84, 170-179 (2024).
  4. Zhang, D. W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325, 332-336 (2009).
  5. He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
  6. Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
  7. Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
  8. Zhao, J., et al. Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).
  9. Chen, X., et al. Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death. Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).
  10. Cai, Z., et al. Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis. Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).
  11. Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).
  12. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).
  13. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).
  14. Aits, S., Jaattela, M. Lysosomal cell death at a glance. J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).
  15. Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges. Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).
  16. Alu, A., et al. The role of lysosome in regulated necrosis. Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).
  17. Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).
  18. Vanden Berghe, T., et al. Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features. Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).
  19. Liu, S., et al. MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis. Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).
  20. Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications. Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).
  21. Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death. Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).
  22. Barral, D. C., et al. Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function. Traffic. 23, 238-269 (2022).
  23. Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines. STAR Protoc. 5, 103309(2024).
  24. Ferrari, V., et al. Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases. Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).
  25. Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions. Biomedicines. 13, (2025).
  26. Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications. Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).
  27. Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).
  28. Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways. Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).
  29. Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity. J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).
  30. Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange. Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).
  31. Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).
  32. Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes. Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mechanismen van necroptoselysosomale dysfunctiefluorescente probesLysoTracker kleurstoffendextran beadsconfocale microscopietime lapse beeldvorminginductie van celdood

Gerelateerde artikelen