Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Experimentele benaderingen voor biochemische analyse van gliale fibrillaire zure eiwitten en de ziekte-geassocieerde varianten

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69523

⸱

28 november 2025

 , 
1Institute of Molecular Medicine, College of Life Sciences and Medicine, National Tsing Hua University

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie beschrijft experimentele methoden om GFAP en de ziekteverwekkende mutaties biochemisch te karakteriseren, met de nadruk op filamentassemblage, aggregatie en posttranslationele modificatie. Hoogzuivere GFAP-eiwitten werden geanalyseerd, wat inzicht gaf in de mechanismen van de ziekte van Alexander die een kader kunnen bieden voor het bestuderen van potentiële therapeutische doelwitten en het begrijpen van GFAP-mutaties en gerelateerde aandoeningen.

Samenvatting

Gliale Fibrilliaire Zure Eiwitten (GFAP) is een belangrijk intermediair filamentproteïne dat cruciaal is voor het behouden van de structurele integriteit en functie van astrocyten in het centrale zenuwstelsel. Mutaties in GFAP zijn de hoofdoorzaak van de ziekte van Alexander (AxD), een zeldzame en vaak dodelijke neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door een verhoging van GFAP-niveaus en ophoping van GFAP in de vorm van Rosenthalvezels. Hier schetsen we een uitgebreide set experimentele benaderingen voor de biochemische karakterisering van GFAP en de ziekteverwekkende varianten daarvan. Met behulp van geoptimaliseerde expressie en geavanceerde zuiveringstechnieken bereikten we hoge opbrengsten en zuiverheid van zowel wildtype- als mutant GFAP-eiwitten. Biochemische assays werden gebruikt om de effecten van pathogene mutaties op filamentassemblage, oplosbaarheid en aggregatie te evalueren. Daarnaast onderzochten we de rol van abnormale posttranslationele modificaties in GFAP-aggregatie en hun impact op filamenteigenschappen. Dit werk vergroot ons begrip van de rol van GFAP in AxD en legt een basis voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën gericht op GFAP-disfunctie. Bovendien dienen de hier gepresenteerde methodologieën als waardevolle instrumenten voor het onderzoeken van de biochemische gevolgen van GFAP-mutaties en het bevorderen van interventies voor GFAP-gerelateerde aandoeningen.

Inleiding

De ziekte van Alexander (AxD) is een genetische aandoening die het gevolg is van dominante mutaties in het gen dat codeert voor gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP)1, een type III intermediair filament (IF) eiwit dat voornamelijk voorkomt in volwassen astrocyten. AxD wordt gekenmerkt door GFAP-upregulation2, reactieve astrogliose3 en de ophoping van Rosenthalvezels, die eiwitinsluitsels zijn die voornamelijk uit GFAP bestaan, samen met bijbehorende eiwitten zoals αB-crystalline4 en ubiquitine5. Mutaties in het GFAP-gen verstoren de normale filamentassemblage6, wat leidt tot abnormale aggregatie, het inductie van cellulaire stressreacties7 en verdere destabilisatie door aberrante posttranslationele modificaties (PTM's) zoals fosforylering8, oxidatie9 en ubiquitinatie10.

Ondanks de centrale rol van GFAP in de AxD-pathologie, blijven de moleculaire mechanismen waarmee mutant GFAP filamentassemblage verstoort, aggregatie bevordert en cellulaire stress induceert, slecht begrepen. Deze kenniskloof belemmert de ontwikkeling van gerichte therapieën om GFAP-aggregatie en toxiciteit aan te pakken. Het bestuderen van de biochemische eigenschappen van GFAP en de AxD-geassocieerde varianten is cruciaal om de moleculaire mechanismen achter de ziekteprogressie te ontrafelen. De aggregatiegevoelige eigenschap van GFAP en het veranderde assemblagegedrag in ziekte-geassocieerde varianten vormen echter unieke uitdagingen voor experimentele analyse. Gecontroleerde biochemische studies vereisen gezuiverde GFAP, verkregen uit diermodellen of via recombinante expressie, om de effecten van AxD-mutaties op filamentassemblage, aggregatie en pathologische modificaties te onderzoeken.

De experimentele benaderingen die in deze studie worden gepresenteerd, bieden verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve technieken. Zo bieden celgebaseerde modellen11 en immunohistochemische studies12 waardevolle inzichten in GFAP-expressie en lokalisatie, maar ze slagen er vaak niet in de precieze biochemische mechanismen van filamentassemblage en aggregatie te vatten vanwege de complexiteit van cellulaire omgevingen. Daarentegen maken de hier beschreven methoden, zoals in vitro filamentassemblage-assays, sedimentatieanalyses en PTM-karakterisering, gecontroleerd onderzoek mogelijk van de intrinsieke biochemische eigenschappen van GFAP en de ziekte-geassocieerde varianten. Deze benaderingen stellen onderzoekers in staat om filamentassemblage- en aggregatiegedrag te ontleden in een vereenvoudigd systeem, wat de identificatie van moleculaire mechanismen achter GFAP-disfunctie vergemakkelijkt. Eerdere studies hebben het nut aangetoond van dergelijke biochemische technieken voor de analyse van IF-eiwitten, waaronder desmin13 en keratines14, wat hun toepasbaarheid op GFAP-onderzoek onderstreept.

Daarnaast biedt dit manuscript informatie om lezers te helpen bepalen of de beschreven methoden geschikt zijn voor hun specifieke toepassingen. Onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van biochemische eigenschappen van GFAP, het assemblagegedrag ervan, of PTM's, zullen deze technieken bijzonder nuttig vinden voor het onderzoeken van ziekte-gerelateerde varianten en hun pathologische effecten. Door deze biochemische benaderingen te integreren met andere experimentele systemen, zoals celgebaseerde studies of diermodellen, kunnen onderzoekers een meer volledig begrip krijgen van GFAP-disfunctie in AxD en andere gerelateerde astrocytopathie.

Het algemene doel van deze methode is het presenteren van experimentele benaderingen voor de biochemische analyse van GFAP en zijn AxD-geassocieerde varianten, waaronder eiwitzuiveringstechnieken, in vitro filamentassemblage-assays, sedimentatie-analyses en PTM-karakterisering. Deze methoden bieden cruciale inzichten in de moleculaire basis van GFAP-disfunctie bij AxD, en effenen zo de weg voor therapeutische ontwikkeling. Bovendien zal de toepassing van deze experimentele technieken ons begrip van GFAP-biochemie in AxD vergroten en bijdragen aan het bredere veld van IF-onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dieren die in deze studie worden gebruikt, zijn AxD-modelratten met de R237H knock-in mutatie11. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het College of Life Sciences and Medicine aan de National Tsing Hua University (NTHU IACUC Goedkeuring nr. 109088 en 111060) en in overeenstemming met de richtlijnen van de Agriculture Guidebook for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Zuivering van recombinant GFAP uit bacteriën (Figuur 1)

  1. Transformeer de E. coli BL21(DE3) pLysS-stam met pET 23b vector die cDNA bevat van ofwel WT of mutant GFAP.
  2. Kweek bacteriën in 1 L Luria-Bertani medium aangevuld met 100 μg/mL ampicilline en 34 μg/mL chloromfenicol bij 37 °C tot OD600 van ~0,2.
  3. Voeg isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 0,5 M) toe aan een eindconcentratie van 0,5 mM om GFAP-expressie te induceren bij 37 °C gedurende 4 uur.
  4. Oogst bacteriën door centrifugatie bij 6.371 xg gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  5. Lysebacterie in 50 mL TEN-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl) aangevuld met 0,2 mM fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) door homogenisatie in een Dounce-homogenisator.
  6. Centrifugeer bacteriële lysaten op 22.045 xg gedurende 20 minuten bij 4 °C, en extraheren vervolgens de pellet in een Triton X-100 buffer (TEN met 1% (v/v) Triton X-100).
  7. Na centrifugatie onder dezelfde omstandigheden wordt de resulterende pellet uit de hoge zoutbuffer gehaald (TEN met 1% (v/v) Triton X-100 en 1,5 M KCl).
  8. Na centrifugatie onder dezelfde omstandigheden was je de pellet met TEN-buffer.
  9. Los de uiteindelijke pellet op in 10 mL ureumbuffer (8 M ureum, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA en 0,2 mM PMSF) door 3 uur op kamertemperatuur te roeren.
  10. Centrifugeurea wordt geëxtraheerd bij 80.000 xg in een tafel-ultracentrifuge bij 4 °C gedurende 20 minuten.
  11. Voeg polyethyleeneimine (1% (v/v)) toe aan de ureumoplosbare fractie tot een uiteindelijke concentratie van 0,06% (v/v) en incubeer 5 minuten op ijs.
  12. Centrifugeer op 80.000 xg bij 4 °C gedurende 20 minuten en dialyseer vervolgens de supernatantfractie tegen buffer A (6 M ureum, 20 mM MES, pH 6,0, 14,4 mM β-mercaptoethanol).
  13. Laad dialysaten op een CM-Sepharose ionenuitwisselingskolom, vooraf geëviktilibreerd in buffer A in een NGC-chromatografiesysteem.
  14. Eluteer eiwitten met een lineaire gradiënt van 0-0,5 M NaCl in buffer A over 1 uur bij een debiet van 1 mL/min.
  15. Pool GFAP-houdende fracties en dialyseer tegen buffer B (6 M ureum, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en 1 mM EDTA).
  16. Laad dialysaten op een anionenuitwisselingskolom die vooraf in balans is gebracht in buffer B. Eluteren eiwitten met een lineaire gradiënt van 0-0,5 M NaCl in buffer B over 1 uur bij een debiet van 1 mL/min.
  17. Analyseer kolomfracties met SDS-PAGE en Coomassie blauwkleuring. Verzamel die met gezuiverde GFAP en bewaar bij -80 °C.
    OPMERKING: Bacteriële lyse kan worden gefaciliteerd door meerdere vries- en ontdooicycli. De uiteindelijke concentratie polyethyleeneimine mag niet hoger zijn dan 0,06% (v/v), waarboven ook eiwitten neerslaan. Bij het werken met gevaarlijke stoffen zoals PMSF en β-mercaptoethanol is het cruciaal om duidelijke veiligheidsrichtlijnen en instructies voor het verwijderen van gevaarlijk afval op te nemen. PMSF is zeer giftig en kan irritatie veroorzaken aan de huid, ogen en de luchtwegen. Maak PMSF-oplossingen vers in een dampkap en vermijd direct contact. Gebruik β-mercaptoethanol in een goed geventileerde ruimte, omdat het sterke, giftige dampen afgeeft.

2. In vitro assemblage en sedimentatietest (Figuur 2)

  1. Verdun gezuiverd WT of mutant GFAP tot 0,3 mg/mL in 6 M ureum in een laag-zoutbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA en 14,4 mM β-mercapethanol).
  2. Dialyseer monsters tegen de lage zoutbuffer met 4 M en daarna 2 M ureum gedurende 4 uur bij kamertemperatuur.
  3. Dialyseer monsters tegen de lage zoutbuffer zonder ureum 's nachts bij 4 °C.
  4. Dialyseer monsters tegen de assemblagebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7, 50 mM NaCl en 14,4 mM β-mercapethanol) bij kamertemperatuur gedurende 12-16 uur.
  5. Breng assemblagemengsels over op de bovenkant van een sucrosekussen met 0,2 mL 0,85 M sucrose in assemblagebuffer.
  6. In de hogesnelheidssedimentatietest centrifugeer je de mengsels op 80.000 xg gedurende 20 minuten bij 20 °C met behulp van een tabletop micro-ultracentrifuge.
  7. Concentreer ongeassembleerde GFAP in de supernatantfractie door methanol/chloroformprecipitatie15 uit te voeren. Resuspendeerprecipitates in 0,2 mL Laemmli-monsterbuffer (25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 1% (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS), 12,5% (v/v) glycerol, 0,01% (w/v) bromofenolblauw en 355 mM β-mercaptoethanol).
  8. Suss de samengestelde GFAP opnieuw in de pelletfractie in Laemmli-monsterbuffer.
  9. Gebruik zowel supernatant als pelletfracties op 10% (w/v) SDS polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) gel en kleur met 10 mL Coomassie blue.
  10. Bij de laag-snelheid sedimentatietest mengt centrifugeassemblage op 3.000 xg gedurende 5 minuten bij 20 °C met behulp van een benchtop-centrifuge.
  11. Voeg 0,2 mL Laemmli-monsterbuffer toe aan de niet-geaggregeerde vormen van GFAP in de supernatantfractie.
  12. Susselt geaggregeerd GFAP direct in de pelletfractie in de Laemmli-monsterbuffer in een volume evenredig aan de supernatantfractie.
  13. Analyseer zowel supernatant- als pelletfracties met 10% (met v/v) SDS-PAGE gel, gevolgd door Coomassie blue kleuring.
    OPMERKING: Methanol en chloroform zijn giftige oplosmiddelen en kunnen ernstige gezondheidsproblemen veroorzaken. Vermijd huidcontact en inademing. Behandel voorzichtig in een dampkap om morsen te voorkomen.

3. Negatieve kleuring en elektronenmicroscopie (Figuur 2)

  1. Glow-ontlading van de Formvar/koolstofgecoate koperen roosters gedurende 45 seconden bij 20 mA in een Glow Discharge Cleaning systeem.
  2. Breng assemblagemengsels af aan het gloei-ontladen rooster en laat monsters 60 seconden aan de ondersteuningsfilm binden.
  3. Verwijder overtollig vocht door de rand van het rooster te laten weken met een stuk doppapier.
  4. Was roosters met gedestilleerd water en kleur vervolgens 60 μL 1% (w/v) uranylacetaat in 60 seconden.
  5. Verwijder overtollige kleuroplossing en laat het rooster 30 seconden aan de lucht drogen.
  6. Onderzoek roosters onder een H-7600 transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) met behulp van een hoge resolutiemodus bij een versnellingsspanning van 100 kV.
    OPMERKING: Het ontladen van de roosters in een vacuümverdamper voordat het eiwitmonster wordt toegevoegd, verbetert de adsorptie van het monster aan het rooster. Uranylacetaat is een radioactieve en zeer giftige chemische stof die vaak wordt gebruikt in elektronenmicroscopie voor negatieve kleuring. Het hanteren ervan vereist strikte naleving van veiligheidsprotocollen en instructies voor het verwijderen van gevaarlijk afval om blootstellingsrisico's voor personeel en het milieu te minimaliseren. Bereid uranylacetaatoplossingen alleen in een dampkap om inademing van luchtdeeltjes of dampen te voorkomen.

4. Oxidatieve modificatie (Figuur 3)

  1. Verdun GFAP tot 0,3 mg/mL in 6 M ureum in een laag-zoutbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA en 14,4 mM β-mercapethanol) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  2. Dialyseer tegen de lage zoutbuffer met 4 miljoen ureum gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur. Roer de buffer voorzichtig met een magnetische roermachine om een gelijkmatige verdeling te behouden en concentratiegradiënten te voorkomen.
  3. Na 2,5 uur plaats je het dialysemembraan in de lage zoutbuffer met 2 miljoen ureum voor nog eens 2,5 uur op kamertemperatuur, waarbij je gedurende het hele proces voorzichtig roert.
  4. Dialyseer tegen de lage zoutbuffer zonder ureum bij 4 °C gedurende 18 uur.
  5. Behandel gedialyseerde monsters met 10 mM H2O2 gedurende 15 minuten, gevolgd door behandeling met 10 of 100 mM dithiothreitol (DTT) gedurende nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Analyseer eiwitmonsters met standaard 10% (w/v) SDS-PAGE zonder β-mercapethanol en kleuring met 10 mL Coomassie blue.
    OPMERKING: Bij het gebruik van H2O2 moet je voorzichtig omgaan, want het is een sterk oxiderend middel dat brandwonden kan veroorzaken. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen om contact met huid en ogen te vermijden. DTT kan irritatie veroorzaken aan de huid, ogen en het ademhalingssysteem. Bij het werken met DTT en H2O2 is het essentieel om de juiste veiligheidsprotocollen te volgen om risico's te minimaliseren.

5. Zuivering van GFAP uit de hersenen van AxD-ratten (Figuur 4A,B)

  1. Extracteer hersenweefsel met 10 mL TEN-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM NaCl en 5 mM EDTA) met behulp van een Douce-homogenisator.
  2. Centrifugeer de hersenhomogenisatie bij 76.000 xg bij 4 °C gedurende 20 minuten, en haal vervolgens de resulterende pellet uit met 10 mL Triton X-100 buffer (1% (v/v) Triton X-100 in TEN buffer).
  3. Centrifugeer op 76.000 xg bij 4 °C gedurende 20 minuten en haal vervolgens de resulterende pellet uit met 10 mL sucrosebuffer (0,85 M sucrose en 0,5% (v/v) Triton X-100 in TEN-buffer).
  4. Centrifugeer op 76.000 xg bij 4 °C gedurende 20 minuten, en haal vervolgens de resulterende pellet uit met 10 mL hoge zoutbuffer (1,5 M KCl en 0,5% (v/v) Triton X-100 in TEN buffer).
  5. Centrifugeer op 76.000 xg bij 4 °C gedurende 20 minuten, en haal vervolgens de uiteindelijke pellet uit met 10 mL ureumbuffer (8 m ureum, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4 en 5 mM EDTA).
  6. Verzamel de supernatantfractie en dialyseer tegen de Q-kolombuffer (6 M ureum, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM EDTA en 14,4 mM β-mercaptoethanol).
  7. Laad de dialysaten op een anionenuitwisselingskolom in een NGC-chromatografiesysteem.
  8. Eluteer het gebonden eiwit met een lineaire gradiënt van 0-0,5 M NaCl in de Q-buffer bij een debiet van 1 mL/min.
  9. Pool GFAP-houdende fractie en dialyseer tegen S-kolombuffer (6 M ureum, 20 mM MES, pH 6 en 14,4 mM β-mercaptoethanol).
  10. Pas dialysaten aan op een kationenuitwisselingskolom en elueer vervolgens de gebonden eiwitten met een lineaire gradiënt van 0-1 M NaCl in de S-buffer bij een debiet van 1 mL/min.
  11. Analyseer geëlueerde fracties met SDS-PAGE en Coomassie blauwkleuring, en verzamel die met gezuiverde GFAP.

6. Analyse van GFAP-ubiquitinatie door immunoblotting (Figuur 4C)

  1. Gebruik gezuiverde GFAP op 10% (met SDS-PAGE gel).
  2. Breng de eiwitten van de gel over naar een nitrocellulosemembraan.
  3. Blokkeer het membraan door het te incuberen met 10 mL 3% (w/v) rundereserumalbumine in Tris-buffered salline (TBS: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl) met 0,1% (v/v) Tween 20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Incubeer het membraan met 5 μL anti-GFAP en 5 μL anti-ubiquitine primaire antilichamen, verdund in 5 ml TBST bij 4 °C gedurende de nacht. Was het membraan drie keer met TBST.
  5. Incubeer het membraan met 5 μL secundaire antilichamen geconjugeerd met fluorescerende kleurstoffen, verdund in 5 mL TBST, bij kamertemperatuur gedurende minstens 1 uur. Was het membraan drie keer met TBST.
  6. Neem beelden vast met een fluorescerend beelddetectiesysteem.
  7. Analyseer in vitro assemblage van native GFAP door TEM en sedimentatie-assays (Figuur 5) met dezelfde procedure als beschreven in stappen 2.1 tot 2.13 en stappen 3.1 tot 3.6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te onderzoeken hoe AxD-veroorzakende mutaties de assemblage-eigenschappen van GFAP beïnvloeden, produceerden we recombinante eiwitten in bacteriën met behulp van een PET-gebaseerd expressiesysteem. We beschrijven de protocollen voor het uitdrukken en zuiveren van GFAP, met WT GFAP als voorbeeld. Na IPTG-inductie (Figuur 1A, baan 2) werd GFAP gezuiverd via een driestapsproces waarbij inclusielichaamvoorbereiding (Figuur 1B) en ionenuitwisselingschromatografie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol stelt een uitgebreid experimenteel kader vast voor de biochemische karakterisering van GFAP en zijn ziekte-geassocieerde mutanten. Door een betrouwbare en gestandaardiseerde benadering te bieden, is deze methode een waardevolle bron die ons begrip van de biologische rollen van GFAP en de pathologische implicaties ervan vergroot, vooral in de context van AxD. In deze sectie bespreken we verschillende cruciale aspecten van het protocol, waaronder mogelijke aanpassingen en prob...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Tracy Hagemann (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) voor het leveren van de R237H knock-in ratten. De suggestie en steun van prof. Albee Messing (Waisman Center, University of Wisconsin-Madison) voor deze studie worden zeer gewaardeerd. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (111-2320-B-007-008 en 112-2320-B-007-006 aan N.-H.L. en M.-D.P.). We danken ook BioTEM van de National Tsing Hua University (MOST-104-2731-M-007-002) voor het gebruik van de apparatuur in deze studie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
30% Acrylamide/Bis solution 37.5:1Biorad1610158
Ammonium Persulfate (APS)Biorad1610700
Ampicillinusb11259
anti-GFAP antibodyCell Signaling Technology12389
anti-ubiquitin antibodyMilliporeST 1200Clone FK2
Avanti J-26S XP CentrifugeBeckman
Chloroamphenicolusb23660
CM-SephroseCytiva1707 1901
Coomassie blue dyeusb32826
Copper gridTed Pella01753-F
CS 150 NX Micro ultracentrfugeHitachiNA
Dounce homogenizerWheaton
DTTURDTT
E. coli BL21(DE3) pLysS strainAgilent
EasiGlowTed Pella
ECL reagentPerkinElmerNEL 105001
EDTAusb15699
H2O2Sigma-Aldrich18312
HiRes S ColumnCytiva2927 5877
HiTrap Q columnCytiva1711 5301
IPTGURIPTG
KClHoneywell12636
LB medium (LB Agar)usb75851
LB medium (LB Broth)BD Difco244620
mercaptoethanolSigma-AldrichM3148
MESSigma-AldrichM8250
NaClHoneywell31434S
NGC chromatography systemBioRad
Optima XE-90 UltracentrifugeBeckman
PMSFACROS ORGANICS215740050
polyehtyleneimineSigma-AldrichP3143
RotorBeckman
S55S RotorHitachi
S80AT3 RotorHitachi
SDSusb75819
SDS-PAGEBiorad
StarBright Blue 520 goat anti-mouse IgG Biorad12005867
StarBright Blue 700 goat anti-rabbit IgG BioRad12004161
SucroseSigma-AldrichS5391
TEMEDusb76320
Transmission electron microscope H-7700)HitachiNA
Trisusb75825
Triton X-100Sigma-AldrichT9284
Uranyl acetateElectron microscope Sciences 22400
ureaHoneywell15604H

Referenties

  1. Brenner, M., et al. Mutations in GFAP, encoding glial fibrillary acidic protein, are associated with Alexander disease. Nat Genet. 27 (1), 117-120 (2001).
  2. Hagemann, T. L., et al. Gene expression analysis in mice with elevated glial fibrillary acidic protein and Rosenthal fibers reveals a stress response followed by glial activation and neuronal dysfunction. Hum Mol Genet. 14 (16), 2443-2458 (2005).
  3. Hagemann, T. L. Alexander disease: models, mechanisms, and medicine. Curr Opin Neurobiol. 72, 140-147 (2022).
  4. Iwaki, T., et al. Alpha B-crystallin and 27-kd heat shock protein are regulated by stress conditions in the central nervous system and accumulate in Rosenthal fibers. Am J Pathol. 143 (2), 487-495 (1993).
  5. Goldman, J. E., Corbin, E. Rosenthal fibers contain ubiquitinated alpha B-crystallin. Am J Pathol. 139 (4), 933-938 (1991).
  6. Yang, A. W., Lin, N. H., Yeh, T. H., Snider, N., Perng, M. D. Effects of Alexander disease-associated mutations on the assembly and organization of GFAP intermediate filaments. Mol Biol Cell. 33 (8), ar69(2022).
  7. Chen, Y. S., Lim, S. C., Chen, M. H., Quinlan, R. A., Perng, M. D. Alexander disease-causing mutations in the C-terminal domain of GFAP are deleterious both to assembly and network formation with the potential to both activate caspase 3 and decrease cell viability. Exp Cell Res. 317 (16), 2252-2266 (2011).
  8. Battaglia, R. A., et al. Site-specific phosphorylation and caspase cleavage of GFAP are new markers of Alexander disease severity. Elife. 8, e47789(2019).
  9. Viedma-Poyatos, A., Gonzalez-Jimenez, P., Pajares, M. A., Perez-Sala, D. Alexander disease GFAP R239C mutant shows increased susceptibility to lipoxidation and elicits mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Redox Biol. 55, 102415(2022).
  10. Lin, N. H., Jian, W. S., Snider, N., Perng, M. D. Glial fibrillary acidic protein is pathologically modified in Alexander disease. J Biol Chem. 300 (7), 107402(2024).
  11. Kondo, T., et al. Modeling Alexander disease with patient iPSCs reveals cellular and molecular pathology of astrocytes. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 69(2016).
  12. Hagemann, T. L., et al. Antisense therapy in a rat model of Alexander disease reverses GFAP pathology, white matter deficits, and motor impairment. Sci Transl Med. 13 (620), eabg4711(2021).
  13. Bar, H., et al. Severe muscle disease-causing desmin mutations interfere with in vitro filament assembly at distinct stages. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (42), 15099-15104 (2005).
  14. Gu, L. H., Coulombe, P. A. Defining the properties of the nonhelical tail domain in type II keratin 5: insight from a bullous disease-causing mutation. Mol Biol Cell. 16 (3), 1427-1438 (2005).
  15. Wessel, D., Flugge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal Biochem. 138 (1), 141-143 (1984).
  16. Ralton, J. E., Lu, X., Hutcheson, A. M., Quinlan, R. A. Identification of two N-terminal non-alpha-helical domain motifs important in the assembly of glial fibrillary acidic protein. J Cell Sci. 107 (Pt 7), 1935-1948 (1994).
  17. Nagai, K., Thogersen, H. C. Synthesis and sequence-specific proteolysis of hybrid proteins produced in Escherichia coli. Methods Enzymol. 153, 461-481 (1987).
  18. Vorgias, C. E., Traub, P. Isolation of glial fibrillary acidic protein from bovine brain white matter and its purification by affinity chromatography on single-stranded DNA-cellulose. Biochem Biophys Res Commun. 115 (1), 68-75 (1983).
  19. Vorgias, C. E., Traub, P. Nucleic acid-binding activities of the intermediate filament subunit proteins desmin and glial fibrillary acidic protein. Z Naturforsch C J Biosci. 41 (9-10), 897-909 (1986).
  20. Lin, N. H., Jian, W. S., Perng, M. D. Deletions in glial fibrillary acidic protein leading to alterations in intermediate filament assembly and network formation. Int J Mol Sci. 26 (5), 1913(2025).
  21. Herrmann, H., Kreplak, L., Aebi, U. Isolation, characterization, and in vitro assembly of intermediate filaments. Methods Cell Biol. 78, 3-24 (2004).
  22. Kim, B., Kim, S., Jin, M. S. Crystal structure of the human glial fibrillary acidic protein 1B domain. Biochem Biophys Res Commun. 506, 2899-2905 (2018).
  23. Lin, N. H., Messing, A., Perng, M. D. Characterization of a panel of monoclonal antibodies recognizing specific epitopes on GFAP. PLoS One. 12 (7), e0180694(2017).
  24. Eliasson, C., et al. Intermediate filament protein partnership in astrocytes. J Biol Chem. 274 (34), 23996-24006 (1999).
  25. Jing, R., et al. Synemin is expressed in reactive astrocytes in neurotrauma and interacts differentially with vimentin and GFAP intermediate filament networks. J Cell Sci. 120 (Pt 7), 1267-1277 (2007).
  26. Thomsen, R., Pallesen, J., Daugaard, T. F., Borglum, A. D., Nielsen, A. L. Genome-wide assessment of mRNA in astrocyte protrusions by direct RNA sequencing reveals mRNA localization for the intermediate filament protein nestin. Glia. 61 (11), 1922-1937 (2013).
  27. Perng, M. D., et al. Intermediate filament interactions can be altered by HSP27 and alphaB-crystallin. J Cell Sci. 112 (Pt 13), 2099-2112 (1999).
  28. Tian, R., Gregor, M., Wiche, G., Goldman, J. E. Plectin regulates the organization of glial fibrillary acidic protein in Alexander disease. Am J Pathol. 168 (3), 888-897 (2006).
  29. Lin, N. H., Yang, A. W., Chang, C. H., Perng, M. D. Elevated GFAP isoform expression promotes protein aggregation and compromises astrocyte function. FASEB J. 35 (5), e21614(2021).
  30. Hagemann, T. L., Connor, J. X., Messing, A. Alexander disease-associated GFAP mutations in mice induce Rosenthal fiber formation and a white matter stress response. J Neurosci. 26 (43), 11162-11173 (2006).
  31. Eng, L. F. The glial fibrillary acidic protein: the major protein constituent of glial filaments. Scand J Immunol Suppl. 9, 41-51 (1982).
  32. Yen, S. H., Dahl, D., Schachner, M., Shelanski, M. L. Biochemistry of the filaments of brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (2), 529-533 (1976).
  33. Goldman, J. E., Schaumburg, H. H., Norton, W. T. Isolation and characterization of glial filaments from human brain. J Cell Biol. 78 (2), 426-440 (1978).
  34. Tsukita, S., Ishikawa, H., Kurokawa, M. Isolation of 10-nm filaments from astrocytes in the mouse optic nerve. J Cell Biol. 88 (1), 245-250 (1981).
  35. Rasmussen, S., Sensenbrenner, M., Devilliers, G., Schousboe, A., Bock, E. Isolation of intermediate filaments from rat astrocytes in culture. Neurosci Lett. 25 (2), 119-124 (1981).
  36. Yang, Z. W., Babitch, J. A. Factors modulating filament formation by bovine glial fibrillary acidic protein, the intermediate filament component of astroglial cells. Biochemistry. 27 (18), 7038-7045 (1988).
  37. Liem, R. K., Hutchison, S. B. Purification of individual components of the neurofilament triplet: filament assembly from the 70 000-dalton subunit. Biochemistry. 21 (13), 3221-3226 (1982).
  38. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal and gliosed human brain: demonstration of multiple related polypeptides. Biochim Biophys Acta. 386 (1), 41-51 (1975).
  39. Fukuyama, R., Fushiki, S., Fujita, S. Purification of glial fibrillary acidic protein (GFAP) from normal bovine brain. J Neurosci Methods. 40 (2-3), 133-137 (1991).
  40. Dahl, D., Crosby, C. J., Gardner, E. E., Bignami, A. Purification of the glial fibrillary acidic protein by anion-exchange chromatography. Anal Biochem. 126 (1), 165-169 (1982).
  41. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain: purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  42. Perng, M., et al. The Alexander disease-causing glial fibrillary acidic protein mutant, R416W, accumulates into Rosenthal fibers by a pathway that involves filament aggregation and the association of alpha B-crystallin and HSP27. Am J Hum Genet. 79 (2), 197-213 (2006).
  43. Hsiao, V. C., et al. Alexander-disease mutation of GFAP causes filament disorganization and decreased solubility of GFAP. J Cell Sci. 118 (Pt 9), 2057-2065 (2005).
  44. Rueger, D. C., Dahl, D., Bignami, A. Purification of a brain-specific astroglial protein by immunoaffinity chromatography. Anal Biochem. 89 (2), 360-371 (1978).
  45. Bignami, A., Dahl, D. Isolation of GFA protein from normal brain-a comment. J Histochem Cytochem. 27 (2), 693-696 (1979).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

GFAP mutatiesziekte van Alexanderastrocyten dysfunctiefilamentassemblageprote neaggregatieposttranslationele modificatiestransmissie elektronenmicroscopieprote nezuiveringSDS PAGE
Experimentele benaderingen voor biochemische analyse van gliale fibrillaire zure eiwitten en de ziekte-geassocieerde varianten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.