Het dieronderzoeksprotocol werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Beijing University of Chinese Medicine. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Voorbereiding
- Krijg 216 specifiek-pathogene vrije (SPF) mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten, met een gewicht van 300-320 g.
- Wennen de ratten aan de woonomgeving gedurende een week vóór het experiment.
- Houd de huisvestingsomstandigheden aan op 23 ± 3 °C, 45% ± 5% luchtvochtigheid, en een licht/donkercyclus van 12 uur (licht aan om 8:00 uur, uit om 20:00 uur).
- Huis vijf ratten per kooi met ad libitum toegang tot steriel standaardvoedsel en water.
OPMERKING: Minimaliseer het aantal gebruikte dieren en verminder het lijden door voorzichtig omgaan en geoptimaliseerde procedures (bijv. verstelbare fixaties om ademhalingsonderdrukking te voorkomen).
2. Operatie van de middencerebrale arterie (MCAO)
OPMERKING: Deze stap beschrijft de vaststelling van het MCAO/reperfusie (MCAO/R) model, aangepast van Bederson et al.6.
- Maak de ratten klaar voor de operatie.
- Vasten de ratten 's nachts (12 uur) voor de operatie (geen waterbeperking).
- Verdoof de ratten via intraperitoneale injectie van 1% natrium pentobarbital (50 mg/kg).
OPMERKING: Er werden geen extra pijnstillers toegediend, omdat natriumpentobarbital uitsluitend als anestheticum werd gebruikt.
VOORZICHTIG: Natriumpentobarbital is een gecontroleerde verdoving. Hanteer het in een dampkap, draag handschoenen en een bril, en bewaar het in een afgesloten kast volgens de institutionele regelgeving.
- Beveilig en bereid de operatieplaats voor.
- Plaats verdoofde ratten in rugligging en herstel hun ledematen.
- Scheer de nekvacht en desinfecteer de huid met een geschikt desinfectiemiddel (bijv. 75% ethanol).
- Maak de halsvaten bloot en bereid ze voor.
- Maak een 2-3 cm lange middenlijnincisie in de huid van de nek, en dissectieer vervolgens botweg de subcutane klieren en fascia. Scheid de arteria common carotis (CCA), de arteria internal carotis (ICA) en de arteria external carotis (ECA), die worden gevormd door de takken van de CCA.
- Lokaliseer de CCA, plaats er twee hechtingen onder als reserve, bind er één bij het hartuiteinde en maak een levende knoop dicht bij de splitsing van de CCA met de andere.
- Gebruik een arteriële klem om het distale uiteinde van de CCA nabij de bifurcatie te sluiten.
- Zoek de ECA en verbind deze met een hechting.
- Plaats de hechting om de MCA te blokkeren.
- Snijd voorzichtig een incisie in de wand tussen de ligatieplaats van het proximale uiteinde van de CCA en de klemplaats van de slagaderclip, en steek vervolgens een speciale schroefdraadplug (monofilamenthechting) in deze incisie.
- Open de arteriële clip en steek de schroefplug vanaf de vork in de ICA totdat er lichte weerstand is, stop dan (Figuur 1).
OPMERKING: De hechtingslengte (18 mm ± 2 mm) is cruciaal voor consistente MCA-occlusie; Pas het licht aan op basis van het gewicht van de rat (300-320 g).
- Induceer ischemie en reperfusie.
- Houd 2 uur lang ischemie (strikt getimed met een stopwatch).
- Na 2 uur trek je voorzichtig de hechting eruit om de doorbloeding van de MCA te herstellen, knip je de overtollige hechting af en verwijder je de arteriële clip.
- Sluit de operatieplaats en monitor het herstel.
- Spoel de incisie met steriele zoutoplossing en hecht vervolgens het onderhuidse weefsel en de huid.
- Plaats de ratten in een herstelkooi (gehouden op 25 ± 1 °C) totdat ze weer bij bewustzijn komen; Houd 24 uur lang in de gaten op bloedingen of stress.
- Richt de schijnoperatiegroep op.
- Voer dezelfde nekdissectie en vatblootstelling uit als in stappen 2.1-2.3.
- Steek de hechting slechts 5 mm in de CCA en verwijder hem dan meteen; hecht de incisie zonder MCA-occlusie.
3. Groepering van dieren
- Verdeel de ratten willekeurig in zes groepen (n = 36 per groep aanvankelijk) voor neurologische score.
- Beroertegroep: alleen MCAO, geen gedragsbeperking of medicatiebehandeling.
- PSD-groep: MCAO + gedragsbeperking + isolatiehuisvesting, geen medicatiebehandeling.
- FXT-groep: MCAO + gedragsbeperking + isolatiehuisvesting + fluoxetine hydrochloride gavage.
- YNJYP-groep: MCAO + gedragsbeperking + isolatiehuisvesting + Yi-nao-jie-yu voorgeschreven (YNJYP) gavage.
- Blanco groep: Geen operatie uitgevoerd.
- Schijnoperatiegroep: Geen blokkade van de middelste cerebrale arterie.
- Sluit ratten met scores van 0 of 4 of ratten die na de operatie zijn overleden, uit.
- Voer 24 uur na MCAO de neurologische scores van Longa7 uit om gekwalificeerde ratten te selecteren.
- Gebruik de Longa-schaal van 5 punten: 0 = geen tekort; 1 = buiging van de voorpoot wanneer deze door de staart wordt opgetild; 2 = cirkelwandelend lopen naar de paretische zijde; 3 = afvallend naar de paretische zijde; 4 = bewusteloosheid of onvermogen om te lopen.
4. Toediening van fluoxetinehydrochloride (FXT) en YNJYP
- Bereid YNJYP en FXT voor.
OPMERKING: YNJYP bevat zes Chinese medicinale stoffen: Ciwujia (wortels van Acanthopanax senticosus ) 30 g, Yujin (wortels van Curcuma longa ) 10 g, Wuweizi (Schisandra chinensis vruchten) 15 g, Zhizi (Gardenia jasminoides vruchten) 10 g, Danshen (Salvia miltiorrhiza wortels) 15 g, en Chuanxiong (Ligusticum chuanxiong rhizomen) 15 g (verstrekt door de afdeling Farmacie, Derde Geaffilieerd Ziekenhuis van de Beijing Universiteit voor Chinese Geneeskunde). Op basis van eerdere studies8 werd de intragastrische toedieningsdosis vastgesteld op 9,92 g/(kg·d).
- Los de fluoxetinehydrochloridecapsules op in gedestilleerd water om een concentratie van 0,233 g/L te bereiken bij gebruik. Op basis van de volwassen dosering vermenigvuldigd met zeven, stel de dosering voor ratten in op 2,33 mg/(kg·d).
- Geef medicijnen via gavage.
- Begin met gavage op dag 1 na MCAO en ga door tot het einde van het experiment, waarbij de procedure consequent 's ochtends in alle groepen wordt uitgevoerd.
- Geef FXT aan de FXT-groep bij 2,33 mg/(kg·d), YNJYP aan de YNJYP-groep bij 9,92 g/(kg·d), en 0,9% normale zoutoplossing (10 mL/kg) aan de stroke- en PSD-groepen.
OPMERKING: Gebruik een 1 mL gavage-naald; Zorg ervoor dat de naald in de maag (niet in de luchtpijp) wordt ingebracht om aspiratie te voorkomen.
5. Chronische milde stress (gedragsbeperking) gecombineerd met isolatiehuisvesting
- Begin met gedragsbeperking en isolatiehuisvesting op dag 7 na MCAO (om de acute beroertefase te voorkomen).
- Bereid het aangepaste T-vormige veiligheidsplatform voor.
- Het perron bestaat uit een basis (20 cm × 10 cm × 2,8 cm) en een veiligheidsruimte (22 cm × 6,6 cm).
- Het vastzetgebied bevat sleuven om het hoofd en de ledematen van de rat vast te zetten en drie verstelbare riemen om verschillende rattenmaten te passen (Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4).
OPMERKING: Het platform is aangepast van Chen3 en Tian4, met toegevoegde voorpootsleuven om de paretische houding van beroertepatiënten te simuleren.
- Voer dagelijkse vasthouding uit.
- Selecteer elke dag willekeurig een venster van 2 uur (bijvoorbeeld 9:00-11:00 uur of 14:00-16:00 uur) om circadiane vooringenomenheid te voorkomen.
- Bevestig elke rat aan het platform met de sleuven en riemen; Pas de strakheid aan om worstelingen te voorkomen, maar niet om ademhalingsonderdrukking te voorkomen.
- Houd je vastgehouden gedurende 2 uur aaneengesloten, 7 dagen achter elkaar.
- Huisratten in isolatie.
- Breng ratten in de PSD-, FXT- en YNJYP-groepen over van groepshuisvesting (vijf ratten per kooi) naar enkele kooien bij het begin van gedragsbeperking.
- Houd de eenpersoonswoning aan totdat gedragsbeperking is voltooid (na MCAO dag 14).
6. Sucroseconsumptietest (SCT)
OPMERKING: Kies willekeurig zes ratten uit elke groep op 2, 4 en 8 weken na MCAO. Test alle ratten in de volgorde SCT, OFT en FST.
- Maak ratten klaar voor de test.
- Snel en onthoud de ratten 24 uur van water voor de test.
- Zorg ervoor dat de testkamertemperatuur (23 ± 2 °C) en verlichting aansluiten bij de woningomgeving.
- Voer de test uit.
- Plaats twee flessen (elk 150 ml) in elke kooi: één met kraanwater en de andere 1% sucroseoplossing.
- Na 1 uur gratis drinken noteer je de hoeveelheden sucroseoplossing en het geconsumeerde water.
- Bereken de voorkeur voor sucrose.
- Gebruik de formule: Sucrosievoorkeur (%) = (Volume van geconsumeerde sucroseoplossing / Totaal volume verbruikt) × 100%.
- Wissel halverwege de drinkperiode de posities van de twee flessen om positie-bias te elimineren.
7. Open-veld test (OFT)
OPMERKING: Selecteer dezelfde batch ratten uit elke groep die voor de FST wordt gebruikt bij 2, 4 en 8 weken. Vasten en de ratten 24 uur voor de test water ontnemen om een consistente fysiologische condities te behouden.
- Maak het openveld-apparaat klaar.
- Gebruik een zwart vierkant vakje met de vloer verdeeld in 25 gelijke rasters.
- Houd de testruimte rustig en zwak verlicht.
- Voer de test uit.
- Plaats elke rat in het middenraster van de doos en start een timer van 5 minuten.
- Registreer horizontale activiteit (aantal rasterovergangen met driekwart van de poten in een nieuw raster) en verticale activiteit (aantal achteren waarbij twee kwart van de poten van de vloer af zijn door handmatig observeren met handzame tellers.
- Noteer de tijd die je doorbrengt in de centrale rasters en de verzorgingsfrequentie (optioneel, voor extra gedragsinzichten).
8. Verplichte zwemtest (FST)
OPMERKING: Selecteer dezelfde batch ratten uit elke groep die voor de FST wordt gebruikt bij 2, 4 en 8 weken. Vasten en de ratten 24 uur voor de test water ontnemen om een consistente fysiologische condities te behouden.
- Maak het testapparaat klaar.
- Vul een glazen cilinder met een geschikte hoeveelheid water, zodat het waterniveau hoog genoeg is zodat de rat zich niet kan ondersteunen door met zijn poten de bodem aan te raken.
- Stel de watertemperatuur in op 25 ± 1 °C.
- Voer de test uit.
- Plaats elke rat in de cilinder en laat hem 5 minuten zwemmen.
- Noteer de totale immobiliteitstijd tijdens de 5 minuten.
- Definieer 'immobiliteit' als passief drijven (slechts minimale bewegingen om de neus boven het water te houden) en 'activiteit' als ledematen peddelen of muurkrabben.
- Zorg voor ratten na de test.
- Haal de rat na 5 minuten uit de cilinder, droog hem met een handdoek en leg hem 30 minuten onder een verwarmingslamp (30 ± 2 °C) om onderkoeling te voorkomen (Figuur 5).
9. Statistische analyse
- Organiseer data als gemiddelde ± standaarddeviatie (gemiddelde ± SD).
- Analyseer data met SPSS versie 20.0 software.
- Voordat parametrische tests worden uitgevoerd, test je de gegevens op normaliteit (met de Shapiro-Wilk-test) en homogeniteit van varianties (met behulp van de Levene-test). De gegevens van elke groep voldoen aan een normale verdeling en voldoen aan de homogeniteit van variantie.
- Gebruik eenrichtingsvariantieanalyse (eenrichtings-ANOVA) voor vergelijkingen van steekproefgemiddelden tussen groepen, gecombineerd met least significant difference (LSD) en Student-Newman-Keuls (SNK) tests. Gebruik de test van Welch wanneer de varianties ongelijk zijn.
- Stel statistische significantie in op p < 0,05.