Methodenartikel

Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

545 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69545

⸱

13 maart 2026

 ,  ,  , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, University of Toyama, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati College of Medicine, 4Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol maakt zuivering, karakterisering en kweek mogelijk van primaire HLA-G+ extravilleuze trofoblasten (EVT) uit de decidua basalis en het chorionmembraan van menselijke termplacenta's. Primaire EVT-culturen behouden de levensvatbaarheid gedurende 96 uur, waardoor co-kweek met monster-gematchte moederlijke immuuncellen en daaropvolgende flowcytometrische en moleculaire analyse van hun interacties mogelijk is.

Samenvatting

De menselijke moeder-foetale interface vormt een unieke immunologische omgeving waar moederlijke immuuncellen en foetale extravillloze trofoblasten (EVT) direct cellulair contact hebben om immuuntolerantie op te bouwen en te behouden. EVT vertonen een duidelijk immunofenotype dat wordt gekenmerkt door de expressie van tolerantogene moleculen, waaronder HLA-G, PD-L1 en PD-L2, die een cruciale rol spelen bij het moduleren van moederlijke immuunresponsen. Daarnaast drukt menselijke EVT HLA-C uit, dat direct door moederlijke NK- en T-cellen kan worden herkend en hun activatie bevordert. Belangrijk is dat er geen orthologen van HLA-C of HLA-G aanwezig zijn in diermodellen die voor onderzoek worden gebruikt, en muistrofoblasten geen MHC-expressie hebben. Het onderzoeken van de fenotypische en functionele eigenschappen van menselijke EVT uit placentaweefsels, onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden, is essentieel om de mechanismen achter het onderhoud van de zwangerschap en de pathofysiologie van placentaontsteking geassocieerd met pre-eclampsie, vroeggeboorte, foetale groeibeperking en placenta accreta, te onderzoeken. Dit protocol beschrijft een uitgebreide methodologie voor de isolatie en karakterisering van primaire menselijke EVT uit gezond terminaal placentaweefsel, evenals na vroeggeboorte en pre-eclampsie. Het omvat: (1) dissectie van placenta- en chorionmembraanweefsels; (2) enzymatische vertering en de bereiding van eencellige suspensies; (3) EVT-zuivering door FACS-type; (4) Fenotypische karakterisering door hoogdimensionale flowcytometrie; en (5) kortdurende in vitro kweek en co-kweek met moederlijke immuuncellen tot 96 uur. De nadruk ligt op het verkrijgen van zeer zuivere en levensvatbare EVT die geschikt is voor latere toepassingen zoals immunologische functionele assays, eiwit- en genexpressieanalyse. De implementatie van dit protocol maakt een robuust en reproduceerbaar platform mogelijk om het begrip van EVT en interacties tussen moederlijke immuuncellen en de implicaties daarvan in zowel gezonde als gecompliceerde zwangerschappen te vergroten.

Inleiding

De menselijke placenta bevat vier brede categorieën van trofoblasttypen: trofoblaststamcellen, syncytiotrofoblasten, villeuze cytotrofoblasten en extravilleuze trofoblasten (EVT), elk met eigen functies en fenotypische kenmerken. Onder hen vertonen EVT unieke immunologische kenmerken, waaronder hoge expressie van immunosuppressieve moleculen, zoals HLA-G, PD-L1, PD-L2 en leden van de B7-familie, evenals polymorfe HLA-C 1,2,3,4,5,6. EVT dringt diep binnen in het maternale deciduale weefsel, spiraalslagaders en het myometrium, waarbij ze in direct contact komen met maternale immuuncellen7. EVT worden gekenmerkt door prominente expressie van polymorfe HLA-C, een belangrijke mediator van interacties met moederlijke T- en NK-cellen die gecontroleerd moeten worden om immuuntolerantie tijdens de zwangerschap te behouden. Als het enige klassieke MHC-molecuul dat door EVT tot expressie komt, maakt HLA-C ook antigeenpresentatie mogelijk aan moederlijke geheugen T-cellen en ondersteunt het immuunbescherming8. Verschillende studies hebben echter aangetoond dat EVT direct de regulerende CD4 T-cellen en tolerante toestanden van CD8 T-cellen en NK-cellen verhoogt om zichzelf te beschermen tegen cytotoxiciteit en immuunafstoting 9,10,11,12,13. Daarnaast rapporteerden sommige studies immunologische veranderingen in moederlijke immuuncellen en EVT van placenta's die werden verkregen na pre-eclampsie, vroeggeboorte of miskraam in vergelijking met gezonde controles 14,15,16,17,18,19,20,21. Verschillende mogelijkheden kunnen ten grondslag liggen aan deze immunologische veranderingen, waaronder i) een reeds bestaande moederlijke T-celafwijking; ii) verminderde immunosuppressieve functies van EVT; of iii) verstoorde interacties tussen de twee celtypen. Om de onderliggende mechanistische drijfveren te verduidelijken, zijn ex vivo experimentele modelleringssystemen die evaluatie van moederlijke immuuncellen en EVT-interacties mogelijk maken, essentieel.

De methoden en benaderingen zoals hier gepresenteerd hebben verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden die gebruikmaken van klassieke trofoblastlijnen, trofoblaststamcelmodellen of organoïden. Het belangrijkste is dat klassieke trofoblastcellijnen en trofoblaststamcelmodellen essentiële kenmerken van primaire EVT niet replicitueren, waaronder hun MHC-expressieprofielen 3,5,22,23. Ten tweede beïnvloeden de complexe mediumvereisten van menselijke trofoblaststamcel (hTSC) en organoïde culturen, die meerdere moleculaire remmers bevatten, direct de werking en het fenotype van immuuncellen, waardoor een adequate beoordeling van EVT- en immuuncelinteracties wordt verhinderd 22,24,25,26,27 . Ten slotte maken de cellulaire diversiteit van hTSC-culturen na differentiatie en de binnenstebuiten aard van de placentaorganoïde structuren immuuninteracties mogelijk met trofoblasttypen die geen vivo-relevantie hebben, waardoor de helderheid van de studies afneemt22,27.

Hier beschrijven we methoden om primaire HLA-G+ EVT te zuiveren uit menselijke termische placentaweefsels, waardoor kweek tot 96 uur mogelijk is in aanwezigheid of afwezigheid van immuuncelpopulaties. Het medium mist moleculaire remmers die EVT- en immuuncelfuncties beïnvloeden, terwijl ze hun levensvatbaarheid behouden. Deze aanpak biedt een waardevol platform voor directe ex vivo studies van EVT- en immuuncelinteracties bij gezonde en gecompliceerde zwangerschappen. Er wordt verwacht dat het zal bijdragen aan de ontdekking van belangrijke oorzaken van moeder-foetaal immuuntolerantie en het identificeren van therapeutische doelen om placentaontsteking op te lossen.

Protocol

De institutionele beoordelingscommissie van het Cincinnati Children's Hospital keurde dit onderzoeksprotocol goed (Goedkeuring #2021-0336), dat voldoet aan de eisen voor bioethische overwegingen, omgang met persoonlijke informatie, infectieuze ziekteverwekkers en procedures voor geïnformeerde toestemming volgens de Amerikaanse wetgeving. Elk laboratorium moet goedkeuring verkrijgen die voldoet aan de nationale onderzoeksrichtlijnen voordat het experiment wordt gestart.

Dit protocol richt zich op het cultiveren van primaire HLA-G+ EVT die levensvatbaarheid behouden tot 96 uur voor secundaire functionele assay door ons vorige protocol 2,28 te verbeteren. Zie Hamilton et al.2 voor het vaststellen van HLA-G+ EVT-achtige cellijn en Ikumi et al.28 voor het betrekken van gematchte maternale deciduale lymfocyten.

1. Het laboratorium opzetten (dag 0).

OPMERKING: Gebruik een klasse II biosafety (BSL2) kast voor het hanteren van monsters.

  1. Zet twee waterbaden in op 39 °C en 37 °C. Zet een bevochtigde CO-2-broedmachine op bij 37 °C.
  2. Bereid 1x PBS, Wash Medium A, Wash Medium B, EVT cultuur Medium A, B en C (Tabel 1 en Tabel 2).
  3. Ontdooi 15 mL van 10 mg/mL DNase I-oplossing (Tabel 1) en 500 mL 0,25% trypsine/EDTA in een waterbad bij 37 °C.
  4. Plaats een container gevuld met biocidale/virucidale oplossing (bijvoorbeeld 10% bleekmiddel) in de BSL2-kast voor het verzamelen van vloeibaar afval. Zet een afvalcontainer met een biohazard-zak in de BSL2-kast voor vast afval.
  5. Bereid absorberende pads, steriele dissectiegereedschappen (gebogen pincet en 6 1/2" schaar), steriele metalen filters, buizenrekken en steriele 50 mL conische buizen voor in de BSL2-kast.
  6. Bereid drie 50 mL kegelvormige buizen voor (twee met elk 1x PBS en één met Wash Medium A voor het verzamelen van placentaweefsel tijdens de dissectie).

2. Monsterverzameling (dag 0)

OPMERKING: Gebruik menselijke placenta's met membranen verkregen via een keizersnede tussen 24 en 42 weken van de zwangerschap. Een vaginaal toegediende placenta kan minder EVT opleveren.

  1. Begin direct met het verwerken van de placenta in een BSL2-kast, bij voorkeur binnen 1-2 uur na de bevalling, om de opbrengst van levensvatbare cellen te maximaliseren. Houd de placenta altijd op kamertemperatuur.
  2. Inspecteer de placenta en registreer indien nodig de grootte, het gewicht en het grof-morfologisch uiterlijk.

3. Weefseldissectie (dag 0)

  1. Membraandissectie
    1. Plaats de placenta met het gezicht naar de foetale zijde omhoog (het deel van de navelstrenginbreng is zichtbaar). Verwijder het amnion, dat is de membraanlaag die het dichtst bij de foetale zijde ligt, door handmatig van het laterale membraan naar de navelstrenginzetplaats te trekken; Snijd en gooi de amnion weg.
    2. Snijd het choriodeciduale membraan in stroken van 5 cm die beginnen vanaf de basis van de placenta omhoog, terwijl de membraanstrook aan de placenta blijft bevestigd.
    3. Plaats de choriodeciduale membraanstrook op de twee vingers met de deciduale zijde naar boven en schraap voorzichtig de maternale decidua parietalis van het chorion met de steriele, gebogen tip pincett.
      OPMERKING: Werk efficiënt en laat het chorionmembraan niet uitdrogen.
    4. Verzamel het chorionmembraan in een 50 mL conische buis met 20 mL Wash Medium A.
    5. Verzamel decidua parietalis voor deciduale lymfocytenisolatie in de 50 mL conische buis met 20 mL PBS en volg het protocol beschreven door Ikumi et al. voor lymfocytenisolatie28.
    6. Knip het chorionmembraan met een schaar in de 50 mL buis totdat het kleine stukjes van <2 mm2 wordt.
      OPMERKING: De totale hoeveelheid van het bezinkte membraan is idealiter 30 mL na het snijden.
    7. Gooi de Wash Medium A weg en was meerdere keren met PBS totdat het supernatant helder wordt.
  2. Placenta-dissectie
    1. Plaats de placenta met de moederzijde naar boven en verwijder bloedstolsels. Knip de stukken van de placenta-basale plaat (lengte 2 cm, breedte 2 cm, diepte 0,5 cm) met een steriele schaar, waarbij de necrotische, verkalkte of ischemische delen worden vermeden.
    2. Plaats het stuk decidua basalis op de vingers die naar de villi (foetale zijde) naar boven wijzen. Verwijder voorzichtig de villi van de decidua basalis met een schaar om 2-3 mm membraan te verkrijgen, met slechts een dunne laag villi op de decidua basalis.
    3. Verzamel decidua basalis weefsel in de 50 mL conische buis met 20 mL PBS. Hak de decidua basalis totdat ze kleine stukjes van <2 mm2 worden.
      OPMERKING: De totale hoeveelheid van het bezinkte weefsel is idealiter 15 mL na het snijden.
    4. Gooi het PBS weg en was de deciduale basalis meerdere keren met PBS totdat het supernatant helder wordt zonder zichtbaar bloed.
    5. Splits 15 mL weefselsuspensie in twee 50 mL conische buizen (7,5 mL in elke buis).
      OPMERKING: Het protocol van lymfocytenisolatie uit decidua basalis verschilt van dit protocol. Zie het protocol dat is verstrekt in Hamilton et al.2.

4. Weefselvertering (dag 0)

  1. Na de laatste wasbeurt van het chorionmembraan en decidua basalis in sectie 3, vul je alle buizen met 1x PBS, centrifugeer je ze op 200 × g gedurende 1 minuut en giet je het supernatant eraf.
  2. Bereid de Tissue Digestion Enzyme Cocktail voor (Tabel 1). Voeg 150 ml warme Tissue Digestion Enzyme Cocktail toe aan een glazen fles van 300 mL en voeg vervolgens 30 ml chorionmembraan toe aan de fles.
  3. Voeg 20 ml warme DMEM/F20 en 80 ml warme Tissue Digestion Enzyme Cocktail toe aan twee glazen flessen van 300 ml en voeg vervolgens 7,5 ml decidua basalis toe aan elke fles.
  4. Incubeer de fles met chorionmembraan in het 39 °C waterbad en de twee flessen met decidua basalis in het 37 °C waterbad. Schud tijdens de 15 minuten durende incubatie alle flessen elke 3-4 minuten (eerste vertering).
  5. Na de vertering filtert u het verteerde weefsel door metalen zeefjes (gaasgrootte 40). Voeg Wash Medium B toe aan de weefsels om te spoelen en de gelatineuze substantie op te lossen.
  6. Filter de celsuspensies over een filter van 100 μm in 50 mL buizen met een gelabelde weefseltype en verteringsnummer.
  7. Ga verder met de tweede vertering door het onverteerde weefsel terug te brengen in de 300 mL mediumflessen, voeg de Tissue Digestion Enzyme Cocktail toe zoals beschreven in stap 4.2, en herhaal stappen 4.2-4.6.
    OPMERKING: Alle decidua basalis-weefsels worden overgebracht in één fles van 300 mL. Houd cellen die na de eerste vertering en de tweede vertering worden verkregen gescheiden.
  8. Draai de celsuspensie 8 minuten op 650 × g en gooi het supernatant weg.
  9. Combineer de pellets (maar houd de eerste en tweede vertering gescheiden) van hetzelfde weefseltype en verteringsaantal in één buis. Vul met Wash Medium B tot 25 mL.

5. Ficoll-dichtheidsgradiënt (dag 0)

  1. Bereid vier 50 mL conische buizen voor met het type weefsel en het verteringsnummer. Giet 12 ml Ficoll in de buizen.
  2. Laad voorzichtig de celophangingen op de Ficoll. Centrifugeer de buizen op 800 × g gedurende 20 minuten (kamertemperatuur) zonder rem.
  3. Breng de cellaag op de Ficoll-medium interface zorgvuldig over in schone 50 mL conische buizen, gelabeld op weefseltype en verteringsnummer na centrifugatie.
    OPMERKING: Verzamel de laag zorgvuldig zonder de interface te verstoren met een steriele transferpipet.
  4. Vul de buizen met Wash Medium B en centrifugeer op 650 × g gedurende 8 minuten.
  5. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellets opnieuw met het resterende medium (ongeveer 0,5 mL). Houd indien nodig ongeveer 10% van de celsuspensie apart voor fenotypering en gebruik 90% voor celsortering. Tel de cellen om het aantal en levensvatbaarheid van cellen te bepalen.

6. Sortering van EVT (dag 0)

  1. Plaats de resuspendeerde celpellets in steriele FACS-buizen met het type weefsel en het verteringsnummer. Voeg anti-CD45-BV785 (1:100), anti-HLA-G-APC (1:125) en anti-EGFR1-BV711 (1:160) toe (Tabel 3). Incubeer de buizen 20 minuten op kamertemperatuur in het donker.
  2. Voeg 1 ml Wash Medium B toe en centrifugeer ze op 650 × g gedurende 8 minuten.
  3. Gooi het supernatant weg en suspendeer de celpellets opnieuw met Wash Medium B om ongeveer 1 × 106-cellen / mL celsuspensie te maken.
  4. Filter de cellen door een 40 μm celzeef, direct vóór celsortering, en sorteer CD45-HLA-G+EGFR+ EVT in buizen met 1 mL EVT Culture Medium A volgens de gatingstrategie beschreven in Figuur 1A.
    OPMERKING: Voor optimale trofoblast-levensvatbaarheid moet een jet-in-air celsorter (bijv. Bigfoot of MoFlo) worden gebruikt met een 100 μm nozzle. Op fluidica gebaseerde sorteerders (bijv. DB S6 of Sony Nano) kunnen de levensvatbaarheid van trofoblasten verminderen, terwijl magnetische celsorteerstrategieën (bijv. Easysep of MACS) de levensvatbaarheid behouden maar een lage zuiverheid hebben, wat resulteert in overgroei van stomalcellen in de culturen.
  5. Centrifugeer de FACS-buizen met gesorteerde cellen, verwijder het supernatant en suspendeer de celpellets opnieuw met EVT Culture Medium B.
    OPMERKING: Ga verder in het volgende gedeelte met het voorbereiden van kweekplaten tijdens het sorteren van cellen.

7. Primaire HLA-G+ EVT-kweek voor secundaire assay (dagen 0 - 1)

  1. Bedek de putten van plat-bottom 96-put celkweekplaten met 50 μL 20 μg/mL fibronectine (Tabel 2) bij kamertemperatuur gedurende 45 minuten.
  2. Verwijder de fibronectine en voeg de celsuspensie met EVT Culture Medium B toe aan de putten. Streef naar 0,5 × 105 basalis EVT-cellen/200 μL medium/put en 1,0 × 10à 5 chorionische EVT-cellen/200 μL medium/put. Incubeer de celkweekplaten gedurende 12-18 uur in de bevochtigde CO2-incubator bij 37 °C (dag 0 incubatie).
  3. Verwijder medium B op dag 1, was de cellen voorzichtig met 1x PBS en voeg EVT Culture Medium C toe met of zonder T-cellen voor verdere (co)kweek (zie sectie 8).

8. Co-kweek van primaire HLA-G+ EVT met geactiveerde T-cellen (dagen 0 - 4)

  1. Stimulatie van CD8+T-cellen door een donor van 3partijen (dag 0-1)
    1. Tijdens het sorteren van HLA-G+ EVT (dag 0) isoleer perifere bloed-immuuncelpopulaties uit ofwel gepaard moederbloed of niet-verwante bloeddonoren, met behulp van de verwezen menselijke CD8+ T-cel verrijkingscocktail (zie de Materiaaltabel) gevolgd door Ficoll dichtheidsgradiënt centrifugatie of FACS-sorteer.
    2. Prestimuleren T- of NK-cellen met anti-CD3/28 kralen of cytokines (bijv. IL2, IL15, IL12 of IL18) in het Lymfocytencelkweekmedium naar wens.
  2. Co-kweek EVT met geactiveerde T-cellen (dagen 1-4)
    1. Tel het aantal lymfocyten en maak celsuspensies met Lymphocyte Cell Culture Medium bij een concentratie van 0,5 × 106/mL. Voeg 1 × 105 lymfocyten toe aan de primaire EVT-putten (het volume EVT Kweekmedium C : Lymfocytencelkweekmedium = 1:1). Incubeer de platen 24-72 uur in een bevochtigde CO2-broedmachine bij 37 °C.
    2. Oogst lymfocyten voor de flowcytometrie-analyse en verzamelt supernatanten voor cytokine-analyse.
    3. Oogst EVT met trypsinisatie en verzamel EVT in de FACS-buizen voor de flowcytometrie-analyse op dag 4 (zie sectie 9).

9. Fenotypering van primaire HLA-G+ EVT

OPMERKING: Ga onmiddellijk door met flowcytometrische kleuring en houd EVT en alle benodigde oplossingen altijd op kamertemperatuur.

  1. Centrifugeer de FACS-buizen met primaire EVT op 650 × g gedurende 7 minuten en gooi het supernatant weg.
  2. Voeg de caspase 3/7 kleuroplossing (Tabel 3) toe aan de celpellets en meng ze voorzichtig.
  3. Kleur de cellen met antilichamen (Tabel 3), meng ze voorzichtig en incubeer nog eens 20 minuten (totale 30 minuten incubatie).
  4. Voeg 1 mL EVT Culture Medium C toe, centrifugeer de buizen op 650 × g gedurende 7 minuten en gooi het supernatant weg.
  5. Suspensieer de celpellet opnieuw met 0,4 mL cel EVT Culture Medium C. Voeg 7-AAD kleuroplossing (5 μL/celsuspensie) toe aan de buizen en analyseer onmiddellijk met een flowcytometer.

Resultaten

Verwachte cel levert op

Van 15 mL decidua basalis levert de verwachte HLA-G+ EVT 0,1-0,3 × 106 cellen uit de eerste vertering en 0,1-0,6 × 106 cellen uit de tweede vertering (totaal 0,2-0,8 × 106 cellen). Van 30 mL chorionmembraan zijn de verwachte HLA-G+ EVT-opbrengsten 0,4-1,0 × 106cellen uit de eerste vertering en 0,4-1,5 × 106 cellen uit de tweede vertering (totaal 0,8-2,5 × 106 cellen). Het aandeel caspase 3/7-7-AAD- live EVT in de isolaten wordt verwacht 90-95% te bedragen.

Primaire HLA-G+ EVT-cultuur

De flowcytometrieanalyse van afstammingsmarkers (HLA-G, HLA-C, EGFR) en celsterftemarkers toonde aan dat dit protocol levensvatbare primaire EVT-kweek biedt tot dag 4 (96 uur na het plateren van de gesorteerde EVT) (Figuur 1B-D). Representatieve lichtmicroscopiebeelden van primaire chorion- en d.basalis HLA-G+ EVT worden getoond na 24, 48 en 72 uur kweek (Figuur 2A-F).

Co-kweek van primaire HLA-G+ EVT met T-cellen

Dit protocol verbeterde de levensvatbaarheid van primaire EVT 96 uur na isolatie van de placenta, een verbetering ten opzichte van ons vorige rapport 1,2,10. Hierdoor maakt het de analyse van EVT-responsen na co-kweek met voorgestimuleerde lymfocyten mogelijk, wat acute ontsteking op het moeder-foetale grensvlak nabootst. EVT expresseert polymorfe HLA-C evenals immunosuppressieve co-inhibitiemoleculen, zoals PD-L1, PD-L2, PVR (ook bekend als CD155), B7H3 en HLA-E, zoals bepaald door extracellulaire flowcytometriekleuring (Figuur 3A,B). EVT verhoogde de expressie van HLA-C, evenals PD-L1, PD-L2 en HLA-E, maar verhoogde de expressie van PVR en B7H3 niet wanneer deze 72 uur co-culturen met geactiveerde lymfocyten volgens protocolsectie 8 (Figuur 4A, B). Daarnaast werd geen toename van EVT-sterfte waargenomen, zoals aangetoond door 7AAD en caspase 3/7 kleuring (Figuur 4C,D).

Figuur 1
Figuur 1. De gatingstrategie voor EVT-celsortering en flowcytometrieplots na het cultiveren van gesorteerde EVT. (A) De representatieve gatingstrategie voor het sorteren van decidua basalis EVT en chorionische EVT. R1 is de live celpoort in de Forward-Side Scatter-plot. R2 is de poort voor uitsluiting van CD45+ leukocyten. R3 is de HLA-G+EGFR+EVT-poort. R4 is de 7-AAD-caspase3/7-live EVT. Hoewel de R4-poort niet per se nodig is voor sortering, wordt deze hier getoond om de levensvatbaarheid van primaire EVT aan te tonen. (B) Representatieve flowcytometrieplots van gesorteerde HLA-G+EGFR+EVT, na 96 uur in vitrokweek. (C,D) Frequenties van caspase 3/7-7-AAD- live EVT tijdens de sortatie (dag 0) en 96 uur kweek (dag 4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. De morfologie van EVT tijdens in vitro kweek. Representatieve lichtmicroscopiebeelden van chorionische EVT na (A) 24 uur, (B) 48 uur, en (C) 72 uur kweek en decidua basalis EVT na (D) 24 uur, (E) 48 uur en (F) 72 uur kweek. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Immunologische fenotypes van primaire EVT. (A) De representatieve flowplots van HLA's en co-inhibitiemoleculen op primaire EVT, zoals bepaald door extracellulaire flowcytometriekleuring (dag 0). (B) Gepaarde lijngrafieken tonen ruwe MFI van IgG-controle en volledige kleuring van elke marker van d. basalis EVT (blauw) en chorionische EVT (groen) op dag 0. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Immunologische fenotypes van primaire EVT met of zonder geactiveerde lymfocyten (dag 4). (A) Vertegenwoordigende flowplots van EVT na de 72-uurs kweek (dag 4) met of zonder geactiveerde derde-partij lymfocyten. (B) Gepaarde lijngrafieken tonen MFI van EVT met of zonder geactiveerde lymfocyten van derden. Blauwe plots staan voor decidua basalis EVT, en groene plots voor chorionische EVT. (C) Vertegenwoordigende flowcytometrieplots voor caspase 3/7-7-AAD- live EVT met of zonder geactiveerde lymfocyten van derden op dag 4. (D) Gepaarde lijndiagrammen tonen frequenties van caspase 3/7-7-AAD- live EVT, met of zonder geactiveerde lymfocyten van derden. Blauwe plots staan voor decidua basalis EVT, en groene plots voor chorionische EVT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Belangrijke reagentia voor de weefseldissectie en spijsvertering. Zie ook 1,2,24. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2. Belangrijke reagentia voor de EVT-kweek en co-kweek met T-cellen. Zie ook 1,2,24. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3. Belangrijke antilichamen en reagentia voor sortering en flowcytometrieanalyse. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Kritieke stappen in het protocol

Om levensvatbare EVT te verkrijgen, is het cruciaal om direct na de bevalling celisolatie uit de placenta te starten en alle procedures van isolatie tot sortering bij kamertemperatuur uit te voeren. Omdat EVT groter en hechter zijn dan lymfocyten, moeten de volgende voorzorgsmaatregelen worden genomen bij sortering om verstopping te voorkomen: i) laat celsuspensie door een 40 μm celfilter passeren vóór sortering, ii) gebruik een medium met DNase voor celsuspensie, iii) vermijd overconcentratie van de celsuspenties (idealiter ~1 × 10⁶ cellen/mL), en iv) gebruik een nozzle van minstens 100 μm. Een Jet-in-Air sorteerder (bijv. Bigfoot, MoFlo) behaalt een hoger levensvatbaar EVT-opbrengst vergeleken met fluidica-gebaseerde celsorteerders (bijv. BD-sorteerders, Sony Nano).

Aanpassingen en probleemoplossing van de methode

Over- of onderverteerd na de eerste vertering van decidua basalis EVT

De verteringsefficiëntie van het weefsel van decidua basalis varieert tussen placenta's. Oververteerde weefsels vormen grote, kleverige aggregaten die moeilijk door het metalen zeef te laten gaan. Meestal helpt het toevoegen van 10-30 ml Wash Medium B om deze aggregaten tijdens de filtratie te verspreiden. Als dit het probleem niet oplost, voeg dan 1-2 ml DNase direct toe aan de weefsels. Als de eerste vertering leidt tot oververtering, verlaag dan de concentratie van de Tissue Digestion Enzyme Cocktail van 80% naar 70% voor de tweede vertering. Na de filtratie van de eerste vertering moet het resterende weefselvolume worden teruggebracht tot ongeveer minder dan de helft. Als het resterende weefselvolume onveranderd blijft, verhoog dan de concentratie van de Tissue Digestion Enzyme Cocktail van 80% naar 90-100% voor de tweede vertering. Chorionmembraanweefsels worden consequent verteerd via placenta's. Daarom is het aanpassen van de concentratie van de Tissue Digestion Enzyme cocktail over het algemeen niet nodig.

Voor de vertering van grotere weefselvolumes dan beschreven in het bovenstaande protocol

Voor verterings van meer dan 30 ml chorionmembraan of meer dan 15 ml decidua basalis-weefsel, gebruik extra flessen met de Tissue Digestion Enzyme Cocktail. Het vergroten van het weefselvolume in één fles leidt vaak tot ondervertering.

Beperkingen van de methode

Lagere EVT-opbrengsten worden verwacht van placenta's die vaginaal worden toegediend. EVT kan niet worden gecryoppreserve voor of na sortering, omdat ze gevoelig zijn voor vries-dooistress, wat hun levensvatbaarheid en functie aanzienlijk beperkt. Dit protocol bevat dus geen stoppunt.

De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande methoden

We rapporteerden eerder het protocol voor het vestigen van HLA-G+ EVT-achtige cellijnen uit termplacenta met behulp van Tissue Culture Medium B en collageengecoate platen. Echter, verschillende remmers in het medium en collageen kunnen mogelijk de functie van T-cellen in het co-kweeksysteembeïnvloeden 2. Andere eerdere rapporten die Tissue Culture Medium B niet gebruikten, stonden de evaluatie van T-cellen in co-cultuur toe, maar niet van EVT vanwege celvariabiliteit 1,10. Het voordeel van het huidige protocol is dat het de invloed van kweekmedium minimaliseert terwijl de kweek van levensvatbare primaire EVT mogelijk wordt. Dit protocol biedt een experimenteel platform om de immunologische functie van EVT en hun functionele veranderingen als reactie op omliggende immuuncellen te onderzoeken – een gebied dat tot dusver onderbelicht is.

Openbaarmakingen

Er is geen belangenconflict gerelateerd aan deze studie.

Dankbetuigingen

We willen Sherry Thornton en de Research Flow Cytometry Core van de afdeling Reumatologie van het Cincinnati Children's Hospital Medical Center bedanken voor alle hulp bij flowcytometrie en celsortering; Alle verpleegkundigen en artsen van deelnemende ziekenhuizen voor hun inspanningen bij het verzamelen van placentamateriaal; Alle Tilburgs-lableden en de immunologische docenten van CCHMC voor hun nuttige discussies; Dit werk werd ondersteund door NIH R01HD116852 (T.T.); Cincinnati Kinderonderzoeksstichting (T.T.); Burroughs Wellcome Fund Next Gen Zwangerschapsprijs #NGP10115 (T.T.); en de March of Dimes Ohio samenwerkingsbeurs (T.T.). S.T. wordt ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Nummers 22KK0287 en 25K12697.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin/EDTAGibco25200-072
15 mL Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-238
-20 °C freezerany supplier
37 °C 5% CO2 Incubatorany supplier
4 °C fridgeany supplier
50 mL Conical Centrifuge tubesThermo Fisher14-955-240
55 mM β-MercaptoethanolGibco21985-023
6 ½” scissorsany supplier
7-AAD Viability Staining SolutionBiolegend420403
-80 °C freezer any supplier
A83-01REPROCELL04-0014
AF700, mouse, IgG1 k Isotype ControlBiolegend400144
APC/Cy7 Rat IgG2a, κ Isotype ControlBiolegend400524
B7H3 PE/Dazzle594Biolegend351012
BD FACSymphony A5 SE Cell AnalyzerBD Biosciences
Bigfoot Spectral Cell SorterThermo Fisher
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
BSL2 biosafety cabinetany supplier
BV605 Mouse IgG1, κ Isotype ControlBD Biosciences562652
BV750 Mouse IgG1, κ isotype Control Biolegend400105
BV785 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400170
CD45 BV785Biolegend304048
Cell dissociation sieveMillipore Sigma CD1-1KT (mesh size 60)
Cell strainers 40µm, 70µm, 100µmThermo Fisher22363547; 22363548; 22363549
CellEvent caspase-3/7 Green Detection ReagentinvitrogenC10423
Centrifugeany supplier
CHIR99021, 3mMSigma-AldrichSML 1046-5MG
Curved tip tweezersany supplier
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)VWR Life Science97063-136
DMEM/F12ThermoFisher11320-033
DNAse ISigma-AldrichDN25
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and ActivationThermo Fisher Scientific11131D
EGF, Human, Recombinant, Animal FreePeproTechAF-100-15-1MG
EGFR1 BV711Biolegend352920
FACS DIVA softwareBD Bioscienceshttps://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software
Ficoll Paque PlusCytivia17144003
FlowJo SoftwareFlowJohttps://www.flowjo.com/
HLA-C PEBD Biosciences566372
HLA-E PE/Cy7Biolegend342608
HLA-G APCabcamAB40915
Human AB serumCorning35060CI
Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)Sigma-AldrichC1063
Human fibronectin (1mg/mL)Corning354008
Human recombinant IL-2PeproTech200-02
Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)Thermo Fisher Scientific41400-045
ITGA6 APC/cy7Biolegend313627
L-Ascorbic AcidSigma-AldrichA0278
magnet separatorpromegaZ5342
Newborn Calf Serum (NCS)gibco16010-159
PD-L1 AF700invitrogen56-5983-42
PD-L2  BV750Biolegend345528
PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype ControlBiolegend400126
PE/Dazzle594 Mouse IgG1, κ Isotype CotrolBiolegend400176
Penicillin and Streptomycin Gibco15140-122
Phosphate Buffered Saline 10X SolutionThermoFisherBP399-4
PVR BV605BD Biosciences748276
Research grade FBSThermo Fisher ScientificFB12999102
RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment CocktailStem Cell15023
SB431542. 10 mMApex-BioA8249
Shaking water bath 37 °Cany supplier
Tryple Express 1x No Phenol RedThermo Fisher Scientific12604013
VPASigma-AldrichP4543
X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell MediumLonza04-380Q
Y27632Sigma-Aldrich688000-1MG

Referenties

  1. Papuchova, H., et al. Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).
  2. Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions. STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).
  3. Tilburgs, T., et al. Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).
  4. Yu, J., et al. Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance. Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).
  5. Apps, R., et al. Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells. Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).
  6. Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells. Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).
  7. Moffett, A., Loke, C. Immunology of placentation in eutherian mammals. Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).
  8. Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface. Front Immunol. 10, 2730(2019).
  9. Vander Zwan, A., et al. Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).
  10. Salvany-Celades, M., et al. Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface. Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).
  11. Mahajan, S., et al. Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells. JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).
  12. Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).
  13. Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications. BMJ. 366, 12381(2019).
  14. Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content. J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).
  15. Tsuda, S., et al. Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia. Front Immunol. 9, 1934(2018).
  16. Tsuda, S., et al. CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing. Front Immunol. 15, 1401738(2024).
  17. Pique-Regi, R., et al. Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition. eLife. 8, e52004(2019).
  18. Yang, J., et al. Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia. Front Immunol. 14, 1142273(2023).
  19. Morita, K., et al. Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia. Front Immunol. 11, 1082(2020).
  20. Sasaki, Y., et al. Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia. Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).
  21. Sasaki, Y. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion. Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).
  22. Shannon, M. J., et al. Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms. Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).
  23. Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).
  24. Okae, H., et al. Derivation of human trophoblast stem cells. Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).
  25. Shimizu, T., et al. CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).
  26. Hori, T., et al. Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier. Nat Commun. 15 (1), 962(2024).
  27. Wang, M., et al. Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts. Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).
  28. Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. Purification of primary human placental leukocytes. STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HLA G expressieplacentawefselmaterno foetale interfaceimmuuntolerantieflowcytometrieFACS sortingfenotypische karakteriseringinteractie tussen immuuncellenenzymatische digestie

Gerelateerde artikelen