Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Voorbereiding van neovasculaire weefsels uit humane gliomaweefsels voor kwantitatieve proteomanalyse van tumorangiogenese

496 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69547

⸱

20 maart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Precision Oncology, Shandong Cancer Hospital and Institute, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 2Shandong Provincial Key Medical and Health Laboratory of Ovarian Cancer Multiomics, & Jinan Key Laboratory of Cancer Multiomics, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Science, 3School of Medicine, Wayne State University, 4Department of Pathology, The Second Xiangya Hospital, Central South University, 5Hunan Clinical Medical Research Center for Cancer Pathogenic Genes Testing and Diagnosis,, 6Department of The 1st General Surgery, The Third Xiangya Hospital, Central South University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol bereidde met succes voldoende hoogwaardig neovasculair weefsel van gliomamonsters met behulp van laser-capture microdissectie voor kwantitatieve proteomics-analyse van tumorangiogenese, waarmee de beperkingen van studies die traditioneel vooral op angiogene factoren gericht zijn overwonnen en een grootschalig proteomica-profiel van glioma-angiogenese werden geleverd.

Samenvatting

Glioom vertegenwoordigt primaire kwaadaardige tumoren van het centrale zenuwstelsel met een significante incidentie en mortaliteit. Tumorangiogenese is het kenmerk van de gliomapathofysiologie en is een belangrijk evenement in de tumoromgeving. De abnormale structuur van tumorneovascularisatie vervult dubbele functies: een bron van voedingsstoffen en een metastatische poort die tumorcelinvasie in de bloedbaan mogelijk maakt. Anti-angiogenesetherapie is een hot topic op het gebied van kanker. De meeste eerdere studies richten zich op de activerende en remmende factoren van tumorangiogenese; Dit verduidelijkt echter alleen tumorangiogenese in een zeer beperkt bereik. Abnormale eiwitexpressie of posttranslationele aanpassingen dragen bij aan de abnormale morfologie van bloedvaten bij glioom. Dit protocol gebruikte laser-capture microdissectie (LCM) om een adequate hoeveelheid neovasculaire weefsels uit gliomaweefsels te isoleren en te zuiveren, wat werd gebruikt voor isotoopgelabelde kwantitatieve proteomics-analyse om differentieel tot expressie gebrachte eiwitten in glioma neovasculaire weefsels te identificeren vergeleken met controles. Deze gegevens vormen een cruciale wetenschappelijke basis voor het ontrafelen van de pathologische mechanismen van tumorangiogenese, het ontdekken van anti-angiogene therapeutische doelwitten en het construeren van biomarkers op basis van tumorangiogenese.

Inleiding

Gliomen zijn sterk heterogene tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) die afkomstig zijn van gliacellen en structurele en metabole ondersteuning bieden aan neuronen1, en worden histologisch ingedeeld in subtypen: astrocytomen, oligodendrogliomen en ependymomen2. Volgens het WHO-beoordelingssysteem zijn gliomgraden I en II de laaggradige gliomen (LGG), doorgaans gekenmerkt door trage groeisnelheden en potentiële langetermijnstabiliteit, vaak vatbaar voor chirurgische resectie op basis van anatomische locatie. Daarentegen zijn graden III en IV de hooggradige gliomen (HGG), voornamelijk ongedifferentieerd en kwaadaardig met zeer invasief gedrag en een slechte prognose3. De huidige behandelingen blijven beperkt en grotendeels ineffectief; Hoewel maximale veilige resectie gecombineerd met postoperatieve radiotherapie/chemotherapie de prognose matig verbetert, blijven er aanzienlijke beperkingen en toxiciteiten bestaan door de diffuse infiltratieve groei van tumoren en vage grenzen die radicale resectie voorkomen 4,5. Menselijke gliomen, vooral hoge graden van glioma, zijn sterk vasculaire kwaadaardige tumoren waarvan de groei, proliferatie en invasie sterk afhangen van hun abnormale neovascularisatie, wat een cruciaal kenmerk is van gliomamaligniteit 6,7. De studie gericht op tumorangiogenese heeft aanzienlijke wetenschappelijke waarde voor therapeutische doorbraken.

Angiogenese omvat fundamenteel de proliferatie, migratie en differentiatie van endotheelcellen onder specifieke prikkels, met onderzoek gericht op regulatoren: (i) inducers, waaronder vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF)8, vasorine (VASN)9, hypoxie-inducerende factor 1 (HIF1)10, transformerende groeifactor β (TGF-β)11, endocan12, plaatje-afgeleide groeifactor (PDGF)13 en epidermale groeifactor (EGF)14; en (ii) remmers, waaronder angiostatine15, endostatine16, trobbelet-activerende factor receptor-1 (TSP-1)17, en weefselremmers van metalloproteïnasen (TIMPs)18. In fase I/II/III hersentumor klinische proeven richten de meeste anti-angiogene medicijnen zich op VEGF-signaaloverdracht vanwege de centrale rol in angiogenese, geïllustreerd door bevacizumab, een monoklonaal antilichaam dat neovascularisatie remt via VEGF-blokkade 19,20,21. Recente fase II/III-onderzoeken toonden echter geen significant overlevingsvoordeel voor patiënten met gevorderde glioblastoom die bevacizumab plus lomustine kregen versus alleen lomustine 19,20,21,22. Cruciaal is dat anti-VEGF-therapie vasculaire afwijkingen verbetert, maar alleen angiogenese onderdrukt zonder directe tumorcytotoxiciteit en therapieresistentie kan veroorzaken. Daardoor leidt het aanpakken van één of enkele angiogene regulatoren niet tot een radicale genezing; Effectieve strategieën vereisen gelijktijdige onderdrukking van angiogenese en blokkade van tumorinvasie en metastase via vaatbanen. De diagnostische en prognostische waarde van eiwitten bij gliomen is goed vastgesteld, maar de behandeling van kwaadaardige gliomen heeft in de loop der decennia beperkte vooruitgang geboekt.

Proteomica kan wereldwijd alle eiwitten in biologische monsters analyseren, inclusief expressieprofielen, post-translationele modificaties (PTM's) en interacties, met op massaspectrometrie (MS)-gebaseerde technieken, waaronder top-down (TDP) en bottom-up (BUP) benaderingen. High-throughput MS maakt het mogelijk om tienduizenden eiwitten per run te identificeren, waardoor het essentieel is voor het bestuderen van tumormechanismen en het identificeren van therapeutische doelen. Eiwitovervloed en de bijbehorende PTM's kunnen worden vastgesteld in gliomaweefsels en vloeibare biopten zoals bloed en de afgeleiden23, 24, 25, hersenvocht26 en urine27. Voor tumorvasculatuur stimuleren abnormale eiwitexpressies en PTM's pathologische vasculaire veranderingen. De eiwitveranderingen bij gliomneovascularisatie kunnen worden geïdentificeerd met proteomics, die de protocolontwikkeling voor betrouwbare proteomische profilering van glioma-neovascularisatie aanstuurt.

Neovasculaire weefsels zijn echter slechts één van de componenten in het gehele gliomaweefsel. Isolatie en zuivering van neovasculair weefsel uit het gehele gliomaweefsel is de belangrijkste stap voor een nauwkeurige kwantitatieve proteomische analyse van gliomaangiogenese. Laser-capture microdissectie (LCM)28,29,30,31 is een effectieve methode om neovasculaire weefsels uit volledige gliomaweefsels te isoleren en te zuiveren. Het is erg moeilijk om voldoende neovasculaire weefselproteïnen te verkrijgen voor kwantitatieve proteomics. In 2007 probeerde een onderzoeksteam LCM te gebruiken om neovasculaire weefsels van graad IV glioom te scheiden voor proteomica-analyse, waarbij slechts vier eiwitten met MS32 werden geïdentificeerd. Vervolgens gebruikten ze in 2012 continu LCM om neovasculaire weefsels van graad IV gliomen te verrijken voor kwantitatieve proteomics, waarbij slechts 29 eiwitten met MS33 werden geïdentificeerd. Die twee proteomische studies van gliomaangiogenese tonen een zeer lage proteomische doorvoer in gliomaangiogenese, wat het complexe proteomlandschap van gliomaangiogenese niet kan weergeven.

Dit protocol ontwikkelde een procedure die het mogelijk maakt voldoende hoeveelheden neovasculaire eiwitten te verkrijgen voor kwantitatieve proteomics-analyse van glioma-angiogenese, waarmee een grootschalig proteomlandschap van tumorangiogenese wordt opgebouwd. Dit heeft grote wetenschappelijke waarde voor de ontdekking van effectieve angiogenese-gebaseerde biomarkers en anti-angiogenese therapeutische doelwitten/medicijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol met menselijke weefselmonsters werd goedgekeurd door de Medical Ethics Review Committee van de Shandong First Medical University (goedkeuring nr. R202211090133), en geïnformeerde toestemming werd verkregen van patiënten en de familie van patiënten. De gliomamonsters die in deze studie werden gebruikt, werden allemaal verkregen uit neurochirurgisch geremde exemplaren van de neurochirurgieafdeling van het Xiangya Hospital van Central South University, waaronder 7 gevallen van astrocytoma graad III weefsels. De normale controlevaten (n = 3) werden genomen uit microvaten in beschadigd hersenweefsel dat was verwijderd door een cerebraal trauma. Alle patiënten waren voor het eerst aanwezig zonder voorgaande radiotherapie of chemotherapie vóór de operatie, en zij werden allemaal gediagnosticeerd door de pathologieafdeling van het Xiangya Ziekenhuis, Central South University. Drie normale gecontroleerde vaatweefsels worden verkregen door neurochirurgische resectie van zeer kleine bloedvaten van normale hersenbeschadiging door externe kracht (zonder glioom) in het Xiangya Ziekenhuis. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Gebruik van LCM om neovasculaire weefsels te isoleren van menselijke gliomaweefsels

  1. Bereid LCM-glaasjes voor: Bedek handmatig polyethyleen-naftalaat (PEN) membraan op herbruikbare metalen glaasjes en bewaar gecoate glaasjes bij -80 °C.
    OPMERKING: Voorgecoate metalen glaasjes worden gebruikt om de bevroren weefselsecties direct te hechten.
  2. Maak een toluidineblauwe kleuringsoplossing klaar (0,5%): Los 0,25 g toluidineblauw op in 40 mL ddH₂O. Voeg één proteaseremmertablet toe en meng tot het volledig is opgelost. Stel het volume in op 50 mL met ddH₂O, filter en bewaar het op ijs.
  3. Procesweefsel: Houd cryostat op bedrijfstemperatuur (-25 °C kamer/monsterhoofd). Haal gliomaweefsel uit -80 °C opslag, plaats het op ijs, verwijder bloed met filterpapier en selecteer geschikte weefselblokken voor inbedding.
  4. Inbedding van weefselprotocol: Pre-koel proefschijf. Breng het inbeddingsmedium aan en plaats snel het weefselblok. Bevries het hele blok 10 minuten op -25 °C voor het harden.
  5. Doorsnedeweefsel en screenvaten: Doorsnedeweefsels van 8 μm dikte. Bevestig weefselsecties op standaard glaas, kleur weefsel met toluidineblauwe kleuringsoplossing en screen neovasculaire vaten onder optische microscopie.
    OPMERKING: Als er geen bloedvaten worden gedetecteerd, verwijder dan 3–5 weefselsecties en herhaal de kleuringscyclus totdat er neovasculaire vaatgebieden verschijnen.
  6. Bevestig een vet-positieve weefselsectie op de voorbereide LCM-dia: Breng vat-positieve secties over op PEN-gecoate LCM-glaasjes, verzeg, label en bewaar bij -80 °C.
  7. Bevestig LCM slide-gemonteerde weefselsecties in voorgekoelde 70% ethanol (4 °C, 1–2 min); laat aflekken en beits in 0,5% toluidineblauw (4 °C, 30 s); Laat de kleur aflekken, spoel twee keer af in ddH₂O (4 °C; twee aparte wasbaden), laat het afvoeren, incubeer in proteaseremmeroplossing (30 s) en bewaar bij -80 °C.
  8. Start het LCM-instrument van tevoren, verwarm 30 minuten voor, gebruik een solid-state infraroodlaser om nog eens 30 minuten voor te verwarmen, en installeer vervolgens een 500 μL microcentrifugebuisverzamelapparaat.
  9. Laad de op weefselmonster gemonteerde LCM-plakjes (opgeslagen bij -80 °C) op het voorbereide LCM-instrument en pas de focus aan op de neovasculaire vaten in gliomaweefsels met behulp van de compatibele software.
  10. Trek precies de lasermarkeringslijn langs de buitenrand van het neovasculaire vat uit (vermijd de vaatwand), gebruik de laser om de neovasculaire vaten te verbranden en te scheiden, en verzamel ze vervolgens in de EP-buiskap.
    OPMERKING: Gebruik de tweede laserbrandwond om te controleren of de neovasculaire vaten volledig losgelaten zijn.
  11. Draai de verzamelde neovasculaire vatmonsterbuis om en sluit deze op in een vriezer van -80 °C.

2. Extractie van eiwitten uit LCM-geïsoleerde gliomneovasculaire weefsels en kwantificering van eiwitinhoud

  1. Bereid een eiwitextractiebuffer voor met 4% natriumdodecylsulfaat (SDS), 1 mM dithiothreitol (DTT) en 150 mM Tris-HCl (pH 8,0).
    OPMERKING: SDS is een gevaarlijk stof dat ogen, huid en de luchtwegen ernstig irriteert, en moet worden gewogen in een dampkap; en DTT is een irritant dat in een dampkap gewogen moet worden.
  2. Suspendeer opnieuw door LCM verzamelde gliomneovasculaire vatweefsels in extractiebuffer. Sonicate in een ijswaterbad voor 1 minuut voor volledige lyse.
  3. Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 10 minuten, en breng supernatant over naar nieuwe microcentrifugebuizen.
  4. Aliquot minimale supernatant voor eiwitkwantificatie. Voeg DTT toe aan het resterende supernatant (eindconcentratie: 1 mM DTT), meng voorzichtig door te pipetteren om bellen te voorkomen. Aliquot en bewaren bij -80 °C.
  5. Voer een bicinconine acid (BCA) eiwittest uit volgens de onderstaande stappen:
    1. Bereid werkende oplossing voor (Reagens A:B = 50:1).
    2. Bereid de standaard serumalbumine voor runderen (BSA) voor (0,5 mg/mL).
    3. Voeg de bijbehorende oplossingen toe volgens Tabel 1.
    4. Meng monsters/standaarden met de werkoplossing en breng over naar een 96-well plaat.
    5. Bred 30 minuten uit bij 37 °C.
    6. Meet de absorptie bij 562 nm.
    7. Bereken concentraties tegen de standaardcurve.

3. Gebruik van kwantitatieve proteomics om de voorbereide neovasculaire eiwitten te analyseren

  1. Bereid tryptische peptidemonsters voor van de geëxtraheerde neovasculaire eiwitten.
    1. Voeg ijskoud aceton toe aan elk extraherd eiwitmonster (tumor; controle) (monster: aceton = 1:5, v/v), meng grondig en incubeer bij -20 °C gedurende 1 uur. Centrifugeer op 12.000 x g (4 °C) gedurende 15 minuten. Verwijder supernatant om eiwitextractie-reagentia (SDS, DTT en Tris-HCL) te verwijderen, en reporse de pellet in een 20 μL oplosbuffer met 1 μL 1% SDS.
      OPMERKING: Gebruik aceton met voldoende ventilatie terwijl je een veiligheidsbril draagt, vermijd ontstekingsbronnen en voer afval af in een aparte, vonkvrije container.
    2. Voeg 2 μL reducerend reagens (DTT) toe aan elk monster, meng grondig en incubeer bij 60 °C gedurende 1 uur. Voeg 1 μL cysteïneblokkerend reagens (jodoacetamide) toe en incubeer dan 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Voeg trypsine (eiwit: trypsine = 20:1, v/v) toe aan elk monster. Vortex-mix en incubeer bij 37 °C 's nachts.
  2. Gebruik isobare targs voor relatieve en absolute kwantificatie (iTRAQ) reagentia om de voorbereide tryptische peptiden te labelen.
    OPMERKING: In dit protocol worden zes-plex iTRAQ-reagentia (plex-tags 113, 114, 115, 116, 117 en 118) gebruikt om tryptische peptidemonsters te labelen (tumor; controle), elk type monster wordt drie keer gelabeld (Tabel 2).
    1. Herstel elke iTRAQ-reagensbuis met 50 μL isopropanol.
    2. Voeg tryptische peptidemonsters toe aan de bijbehorende reagensbuizen, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    3. Beëindig de reacties door 3× volume ultrazuiver water toe te voegen en dan 30 minuten te incuberen bij kamertemperatuur.
    4. Leg de gelabelde zes samples samen, mix grondig en lyofiliiseer.
  3. Gebruik sterke kationenuitwisseling (SCX) om het iTRAQ-gelabelde tryptische peptidemonster te fractioneren.
    1. Reconstrueren gelyofilieerde peptiden in 2 mL Oplossing A (10 mM KH₂PO₄, 25% ACN, pH 2,7). Laad op een sulfoethylgefunctionaliseerde kationenuitwisselingskolom (4,6 × 100 mm, 5 μm, 200 Å).
    2. Eluteren met een constante debiet van 1 mL/min met oplossing B (500 mM KCl, 10 mM KH₂PO₄, 25% ACN, pH 2,7): 0 %→10 % (2 min) → 10 %→20 % (25 min) → 20 %→45 % (5 min) → 50 %→100 % (5 min). Meet op 214 nm gedurende het hele proces, verzamel elke minuut per buis, voor een totaal van 30 fracties.
    3. Concentreer elke fractie door vacuümcentrifugatie en reconstrueer vervolgens met 40 μL 0,1% (v/v) trifluorazijnzuur (TFA). Alle 30 fracties worden bewaard in een vriezer van -80 °C.
      OPMERKING: TFA is zeer corrosief en giftig, veroorzaakt ernstige huid- en oogschade en irriteert het ademhalingssysteem; het moet worden behandeld in een dampkap met geschikte PBM, waaronder zuurbestendige handschoenen, een bril en een labjas, en afval moet als zuur afval worden verzameld.
  4. Gebruik LC-MS/MS om elk gefractioneerd peptidemonster te analyseren.
    1. Gebruik een C18 omgekeerde-fase vastefase extractiepatroon (standaarddichtheid, bed-ID 7 mm, volume 3 mL) om te ontzouten.
    2. Gebruik een C18 omgekeerde-fase vloeistofchromatografie (LC) kolom (10 cm lang, 75 μm i.d., 3 μm hars) om 10 μL van elke fractie te elueren met oplossing C (0,1% mierenzuur) en een gradiënt van oplossing D (80% acetonitril en 0,1% mierenzuur) bij een snelheid van 250 nL/min gedurende 140 minuten.
    3. Online voeren de LC-gescheiden peptiden in in een hoge-resolutie massaspectrometer voor MS/MS-analyse.
    4. Zet ruwe spectrumbestanden (.raw) die door Q Exactive zijn gegenereerd om naar .mgf-formaat met Proteome Discoverer 1.4, en dien deze .mgf-bestanden vervolgens in bij de MASCOT 2.2-server , de ingebouwde module van de software voor databasezoeken.
      OPMERKING: De Uniprot menselijke database (146.704 in totaal sequenties; gedownload op 20 juli 2025 van http://www.uniprot.org) wordt gebruikt met gedetailleerde zoekparameters (Tabel 3).
    5. Haal de resulterende zoekbestanden (.dat) terug van de MASCOT-server terug naar Proteome Discoverer 1.4. Gegevens voor filtratie bij een valse ontdekkingssnelheid (FDR) drempel van <0,01 om identificaties met hoge betrouwbaarheid te verkrijgen.
    6. Identificeer de eiwitaminozuursequentie met MS/MS-gegevens, kwantificeer de eiwitabundantie met iTRAQ-rapportageionintensiteiten.
    7. Bereken de experimentele reproduceerbaarheid om de cut-off waarde van differentieel expressieve eiwitten (DEP's) plus een significantie p<0,05 te bepalen.
      OPMERKING: In deze studie wordt de cut-offwaarde bepaald als fold-change (FC) > 1,4, waarmee systematische fouten effectief worden verwijderd.
  5. Analyseer de functionele kenmerken van glioma neovasculaire DEP's.
    1. Bezoek de DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, versie 6.7; https://david.ncifcrf.gov/) homepage en selecteer Start Analyse in de menubalk om de analyse te starten.
    2. Selecteer het linkerpaneel dient als uploadinterface; voer eiwit- of gen-ID's in het invoervak Stap 1 in zoals gevraagd (met behulp van de kopieer-plak-functionaliteit).
    3. Voor stap 2 selecteer je het type identificatie dat overeenkomt met de geüploade eiwitten; deze studie gebruikte UniProt Accession.
    4. Voor stap 3 selecteer je genenlijst of achtergrondinstellingen: Genverrijkingsanalyse vereist het kiezen van een achtergrondgenset. Het systeem schakelt standaard in op het volledige genoom van de soort, of gebruikers kunnen een aangepaste eiwit- of genenlijst uploaden als achtergrond.
    5. Klik op Verzendlijst om de inzendingen in te dienen en de analyse te starten.
      OPMERKING: Analyseresultaten worden weergegeven aan de rechterkant van het paneel "Annotatiesamenvattingsresultaten". Gebruikers kunnen outputs selecteren op basis van analytische behoeften; deze studie maakte specifiek gebruik van de GOTERM_BP_FAT lijst om biologische processen met DEP's te analyseren.
    6. Verkrijg biologische processen (BP's), cellulaire componenten (CC's), moleculaire functies (MF's) en KEGG-routes voor gliom-neovasculaire DEP's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er werd voldoende LCM-geïsoleerde eiwitmonsters verkregen voor kwantitatieve proteomics

Om betrouwbare proteomische profielen te verkrijgen van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten in neovasculaire weefsels van glioma, selecteerde deze studie het meest voorkomende glioma-subtype, astrocytoom Grade III, en isoleerde neovasculaire weefsels met behulp van LCM vanwege de beschikbaarheid van verrijkte neovasculaire vaten. Bovendien vereis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

LCM in combinatie met isotoop-labelende kwantitatieve proteomica identificeerde het eerste grootschalige proteomprofiel van gliomaangiogenese

Tumorangiogenese is een cruciaal pathologisch kenmerk van gliomen, nauw verbonden met hun hoge invasieve invasieve en therapeutische weerstand 6,7. Traditionele anti-angiogene therapieën (zoals VEGF-remmers) vertonen beperkte klinische effectivit...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de China National Nature Scientific Funds (81272798 aan X.Z. en 82203592 aan N.L.), de Shandong Provincial Natural Science Foundation (ZR2022QH112 aan N.L.), Shandong Provincial Taishan Scholar Engineering Project Special Funds (NO.tstp20221143 aan X.Z.), het China National High-end Foreign Expert Talent Program (H20240743; Buitenlandse expert: X.Z.), en Shandong Eerste Wetenschappelijk Onderzoeksproject voor Kweek Van Medische Universiteit in Opkomende Strategische Velden (202403).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-Well PlateThermo Fisher Scientific (USA)468667Consumables
AcetoneNanJing Reagent (China)C0720114023Reagent
AcetonitrileMerck (China)CN34892Reagent
BCA Protein Assay KitAbcam (UK)ab102536Reagent
Bovine serum albumin (BSA) standardSolarbio (China)PC0001-1Reagent
centrifuge tube(50ML)Kirgen (China)KG2811Consumables
Cryostat MicrotomeLeica (Germany)C1900Equipment
CysteineAladdin (China)C108238Reagent
DL-Dithiothreitol(DTT)Amresco (USA)D8220Reagent
EASY-Spray C18 Reversed Phase HPLC ColumnThermo Scientific (USA)ES800AConsumables
Electronic BalanceSartorius (USA)BSA224SEquipment
Embedding mediumLeica (Germany)39475237Consumables
Empore SPE Cartridges C18Sigma-Aldrich (USA)66872-UConsumables
Eppendorf TubeKirgen (China)KG2211Consumables
Filter PaperCytiva (USA)Grade42Consumables
Formic acidAladdin (China)F112032Reagent
Glass BeakerSHUBO (China)1015479Consumables
Glass Graduated CylinderSHUBO (China)1601Consumables
‌High-Resolution Liquid Chromatography-Mass SpectrometryThermo Scientific (USA)Q-ExactiveEquipment
Insulated ContainerFhefon (China)LCZYX-12Consumables
Inverted MicroscopeLeica (Germany)XDS-1Equipment
IodoacetamideSolarbio (China)I8010Reagent
IsopropanolAladdin (China)I112018Reagent
iTRAQ reagentsSigma-Aldrich (USA)4381663Reagent
KClBeyotime (China)ST1596Reagent
KH2PO4ShangHai YuanYe (China)S24278Reagent
Laser-capture microdissectionLeica (Germany)LMD 6000Equipment
Laser-capture microdissection slideLeica (Germany)3800040Consumables
Leica High-Profile Disposable BladesLeica (Germany)14035838926Consumables
Liquid Nitrogen ContainerKEYICRYO (China)YDS-3Equipment
Magnetic Hotplate StirrerShanghaiSILE (China)LAB-0002-0068-SHSLEquipment
Microplate ReaderTECAN (Switzerland)INFNITE F200Equipment
PEN MembraneLeica (Germany)11505189Consumables
PH meterSartorius (USA)PB-10Equipment
PipetteEppendorf (Germany)3123000268Equipment
PipetteEppendorf (Germany)3123000241Equipment
PipetteEppendorf (Germany)3123000225Equipment
PolySULFOETHYL APolyLC Inc (USA)104SE0303Consumables
Protease inhibitorRoche (Switzerland)05892791001Reagent
Refrigerated centrifugeBeckman (USA)AllegraTM X-22REquipment
RefrigeratorMEILING (China)BCD-180KCTEquipment
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Amresco (USA)1027P033Reagent
Staining JarBeyotime (China)FG005Consumables
Stainless Steel ScoopMuzixing (China)XYS-101Consumables
TipsKirgen (China)KG1313Consumables
Toluidine blue staining solutionSigma-Aldrich (USA)198161-5G/198161-25GReagent
Trifluoroacetic acidAladdin (China)T103293Reagent
Tris-HClAmresco (USA)T8230Reagent
Trypsin-EDTA solutionSolarbio (China)T1300Reagent
Ultra-Low Temperature FreezerSanyo (Japan)MDF-382EEquipment
Ultra-pure Water PurifierELGA (UK)PureLAB flexEquipment
Ultrasonic Cell DisruptorQSONICA (USA)Q500Equipment
Vacuum freeze dryerThermo (USA)SNL 315SVEquipment
Vortex mixerCrystal Technology & Industries (USA)HYQ-3110Equipment
Water bath incubatorShanghai Yiheng Technology Instrument (China)HWS-26Equipment
Weighing PaperCole-parmer (USA)133802Consumables

Referenties

  1. Lapointe, S., Perry, A., Butowski, N. A. Primary brain tumours in adults. Lancet. 392 (10145), 432-446 (2018).
  2. Pienkowski, T., et al. Proteomic profiling reveals dynamic regulation of vesicle trafficking across glioma grades. J Neurooncol. 175 (2), 585-598 (2025).
  3. Louis, D. N., et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  4. Kan, L. K., et al. Potential biomarkers and challenges in glioma diagnosis, therapy and prognosis. BMJ Neurol Open. 2 (2), e000069(2020).
  5. Bertolini, G., et al. Prognostic impact of second surgical resection in IDH wildtype recurrent glioblastoma following chemo-radiation therapy: a propensity score analysis cohort study. J Neurooncol. 174 (3), 789-798 (2025).
  6. Ma, X., et al. Long non-coding RNA HOTAIR enhances angiogenesis by induction of VEGFA expression in glioma cells and transmission to endothelial cells via glioma cell derived-extracellular vesicles. Am J Transl Res. 9 (11), 5012-5021 (2017).
  7. Wang, R., et al. MCPIP1 promotes cell proliferation, migration and angiogenesis of glioma via VEGFA-mediated ERK pathway. Exp Cell Res. 418 (1), 113267(2022).
  8. Seyedmirzaei, H., Shobeiri, P., Turgut, M., Hanaei, S., Rezaei, N. VEGF levels in patients with glioma: a systematic review and meta-analysis. Rev Neurosci. 32 (2), 191-202 (2021).
  9. Zhong, Y., et al. Vasorin exocytosed from glioma cells facilitates angiogenesis via VEGFR2/AKT signaling pathway. Mol Cancer Res. 22 (7), 668-681 (2024).
  10. Domènech, M., Hernández, A., Plaja, A., Martínez-Balibrea, E., Balañà, C. Hypoxia: The cornerstone of glioblastoma. Int J Mol Sci. 22 (22), 12608(2021).
  11. Chen, Z., et al. Prrx1 promotes stemness and angiogenesis via activating TGF-β/smad pathway and upregulating proangiogenic factors in glioma. Cell Death Dis. 12 (6), 615(2021).
  12. Bastola, S., et al. Endothelial-secreted Endocan activates PDGFRA and regulates vascularity and spatial phenotype in glioblastoma. Nat Commun. 16 (1), 471(2025).
  13. Krenzlin, H., et al. Cytomegalovirus promotes murine glioblastoma growth via pericyte recruitment and angiogenesis. J Clin Invest. 129 (4), 1671-1683 (2019).
  14. Hong, G., et al. EGFL7: Master regulator of cancer pathogenesis, angiogenesis and an emerging mediator of bone homeostasis. J Cell Physiol. 233 (11), 8526-8537 (2018).
  15. Feldo, M., et al. Effect of diosmin administration in patients with chronic venous disorders on selected factors affecting angiogenesis. Molecules. 24 (18), 3316(2019).
  16. Anakha, J., Dobariya, P., Sharma, S. S., Pande, A. H. Recombinant human endostatin as a potential anti-angiogenic agent: therapeutic perspective and current status. Med Oncol. 41 (1), 24(2023).
  17. Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
  18. Qi, J. H., Anand-Apte, B. Deglycosylation increases the aggregation and angiogenic properties of mutant tissue inhibitor of metalloproteinase 3 protein: Implications for sorsby fundus dystrophy. Int J Mol Sci. 23 (22), 14231(2022).
  19. Sandmann, T., et al. Patients with proneural glioblastoma may derive overall survival benefit from the addition of bevacizumab to first-line radiotherapy and temozolomide: Retrospective analysis of the AVAglio trial. J Clin Oncol. 33 (25), 2735-2744 (2015).
  20. Funakoshi, Y., et al. Update on chemotherapeutic approaches and management of bevacizumab usage for glioblastoma. Pharmaceuticals (Basel). 13 (12), 470(2020).
  21. Sferruzza, G., Malcangi, M., Bosco, L., Finocchiaro, G. Reassessing the efficacy of bevacizumab in newly diagnosed glioblastoma: A systematic review and external pseudodata-based analysis. Neurooncol Adv. 6 (1), vdad174.31(2024).
  22. Ahir, B. K., Engelhard, H. H., Lakka, S. S. Tumor development and angiogenesis in adult brain tumor: glioblastoma. Mol Neurobiol. 57 (5), 2461-2478 (2020).
  23. Hallal, S., et al. A comprehensive proteomic SWATH-MS workflow for profiling blood extracellular vesicles: A new avenue for glioma tumour surveillance. Int J Mol Sci. 21 (13), 4754(2020).
  24. Westphal, M., Lamszus, K. Circulating biomarkers for gliomas. Nat Rev Neurol. 11 (10), 556-566 (2015).
  25. Santangelo, A., Tamanini, A., Cabrini, G., Dechecchi, M. C. Circulating microRNAs as emerging non-invasive biomarkers for gliomas. Ann Transl Med. 5 (13), 277(2017).
  26. Gahoi, N., et al. Multi-pronged proteomic analysis to study the glioma pathobiology using cerebrospinal fluid samples. Proteomics Clin Appl. 12 (2), 201870013(2018).
  27. Hao, X., et al. Urinary protein biomarkers for pediatric medulloblastoma. J Proteomics. 225, 103832(2020).
  28. Mustafa, D., Kros, J. M., Luider, T. Combining laser capture microdissection and proteomics techniques. Methods Mol Biol. 428, 159-178 (2008).
  29. Zheng, P. P., et al. Differential expression of splicing variants of the human caldesmon gene (CALD1) in glioma neovascularization versus normal brain microvasculature. Am J Pathol. 164 (6), 2217-2228 (2004).
  30. Miyai, M., Iwama, T., Hara, A., Tomita, H. Exploring the vital link between glioma, neuron, and neural activity in the context of invasion. Am J Pathol. 193 (6), 669-679 (2023).
  31. Komiyama, K., et al. Glioma facilitates the epileptic and tumor-suppressive gene expressions in the surrounding region. Sci Rep. 12 (1), 6805(2022).
  32. Mustafa, D. A. N., et al. Identification of glioma neovascularization-related proteins by using MALDI-FTMS and nano-LC fractionation to microdissected tumor vessels. Mol Cell Proteomics. 6, 1147-1157 (2007).
  33. Mustafa, D. A. N., et al. A proteome comparison between physiological angiogenesis and angiogenesis in glioblastoma. Mol Cell Proteomics. 11 (6), M111.008466(2012).
  34. Li, C., et al. Accurate qualitative and quantitative proteomic analysis of clinical hepatocellular carcinoma using laser capture microdissection coupled with isotope-coded affinity tag and two-dimensional liquid chromatography mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 3 (4), 399-409 (2004).
  35. Woo, J., Schoenfeld, M., Sun, X., Iraguha, T., Zhou, Z., Zhang, Q. Mouse paneth cell-enriched proteome enabled by laser capture microdissection. Proteome Res. 21 (10), 2435-2442 (2022).
  36. Zhang, Y., et al. Quantitative phosphoproteomics reveals molecular pathway network alterations in human early-stage primary hepatic carcinomas: potential for 3P medical approach. EPMA J. 14 (3), 477-502 (2023).
  37. Yang, H., et al. Ubiquitinomics revealed disease- and stage-specific patterns relevant for the 3PM approach in human sigmoid colon cancers. EPMA J. 14 (3), 503-525 (2023).
  38. Wen, S., et al. Quantitative acetylomics revealed acetylation-mediated molecular pathway network changes in human nonfunctional pituitary neuroendocrine tumors. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 753606(2021).
  39. Su, J., Yang, L., Sun, Z., Zhan, X. Personalized drug therapy: Innovative concept guided with proteoformics. Mol Cell Proteomics. 23 (3), 100737(2024).
  40. Yang, L., et al. What does one-dimensional gel electrophoresis-based western blotting data really mean in the reality of proteoforms. Talanta. 295, 128266(2025).
  41. Fang, Z., et al. Proteoformics: Current status and future perspectives. J Proteomics. 321, 105524(2025).
  42. Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA J. 9 (1), 77-102 (2018).
  43. Jia, W., Gong, X., Ye, Z., Li, N., Zhan, X. Nitroproteomics is instrumental for stratification and targeted treatments of astrocytoma patients: Expert recommendations for advanced 3PM approach with improved individual outcomes. EPMA J. 14 (4), 673-696 (2023).
  44. Gong, X., et al. Glioma angiogenesis phosphoproteome landscape and biomarker sets identified with phenome-centered multiomics toward 3P medical approaches. EPMA J. 16 (4), 831-856 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Glioma-angiogeneselaser-capture microdissectietumorvascularisatiedifferentiële eiwitexpressieLCMSMS-analyseeiwitinteractienetwerktumorbiomarkersanti-angiogenesetherapie
Voorbereiding van neovasculaire weefsels uit humane gliomaweefsels voor kwantitatieve proteomanalyse van tumorangiogenese
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.