Methodenartikel

Realtime bemonstering van arterioveneuze adventitiële interstitiiële vloeistof van het rat femoraliseerd arteriovenus door plaatsing van een microdialysesonde

438 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69551

⸱

30 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Hospital, National Center of Gerontology, Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, 2Peking Union Medical College, 3The Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Institute of Geriatric Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, 4Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie introduceert een microdialysetechniek die realtime, anatomisch nauwkeurige bemonstering van adventieel interstitieel vocht (AISF) bij vernarven ratten mogelijk maakt, waardoor duidelijke metabole variaties aan het licht komen en het unieke fysiologische belang ervan bevestigd worden. In vergelijking met bestaande bemonsteringsmethoden voor interstitiële vloeistof (ISF) biedt deze aanpak een verbeterde moleculaire resolutie en bemonsteringsstabiliteit.

Samenvatting

Interstitiële vloeistof (ISF) is een essentieel onderdeel van de extracellulaire micro-omgeving, die metabole uitwisseling en intercellulaire communicatie faciliteert. Desalniettemin maken de anatomische diepte en de nabijheid van vaatstructuren het adventitiële ISF (AISF) bijzonder moeilijk te bemonsteren zonder besmetting of weefselverstoring te veroorzaken. In deze studie introduceren we een realtime, minimaal invasieve methode voor AISF-verzameling via microdialyse bij verdoofde ratten. Dubbele 20 kDa cut-off probes werden chirurgisch geïmplanteerd in de femorale arterioveneuze adventitia en de vena jugularis om respectievelijk continue bemonstering van ISF en bloed mogelijk te maken. De perfusie met kunstmatige extracellulaire vloeistof maakte selectieve diffusie van laag-moleculaire massale metabolieten mogelijk. Door middel van principal component analysis (PCA) en orthogonale partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) werd een duidelijke metabole divergentie tussen AISF en bloed waargenomen, waarbij 146 significant differentiële metabolieten werden geïdentificeerd. De verrijkingspatronen van lactaat en serotonine bevestigden de anatomische specificiteit en functionele betrouwbaarheid van de methode. Belangrijk is dat AISF werd verrijkt met lokaal gesynthetiseerde metabolieten die in plasma ontbraken, wat de unieke fysiologische betekenis benadrukt. In vergelijking met huidige methoden voor interstitiële vloeistof (ISF) bemonstering, zoals micronaalden, zuigblaren en omgekeerde iontoforese, biedt microdialyse een verbeterde moleculaire resolutie, grotere bemonsteringsstabiliteit en een verminderde invasieve invasie. Deze techniek vormt een betrouwbare basis voor in vivo analyse van analyten in interstitiële vloeistof (AISF) en toont aanzienlijk potentieel voor de ontwikkeling van biomarkerontdekking en onderzoek naar vasculaire pathofysiologie.

Inleiding

Weefselvloeistof, of interstitiële vloeistof (ISF), vormt een cruciaal element van de cellulaire micro-omgeving, met wetenschappelijk onderzoek dat teruggaat tot het einde van de 19e eeuw. In 1896 introduceerde Starling de capillarfiltratie-reabsorptietheorie, die ISF voor het eerst karakteriseerde als een homogene vloeistof die wordt gegenereerd door plasma-ultrafiltratie, en een cruciale rol speelt bij het transport van innutriënten en het verwijderen van metabolisch afval1. In de afgelopen twee decennia hebben vooruitgangen in microscopische beeldvormingstechnologie en moleculaire biologie het begrip van onderzoekers vergroot over de aanzienlijke diversiteit in de anatomische verspreiding, samenstelling en functie van ISF2.

Onderzoek naar interstitiële vloeistof (ISF) op verschillende anatomische locaties heeft de unieke functies ervan binnen verschillende weefsels aan het licht gebracht. Zo faciliteert ISF in cerebraal weefsel de verwijdering van neurotoxische metabolieten, zoals β-amyloïde, tijdens de slaap via het glymfatischesysteem. Omgekeerd draagt tumor interstitiële vloeistof (TIF) bij aan tumorinvasie en immuunontwijking door een zure microomgeving te bevorderen via de ophoping van melkzuur4. Deze bevindingen suggereren dat ISF niet alleen functioneert als een bemiddelaar van metabole uitwisseling, maar ook als een actieve regulator van weefselspecifieke pathofysiologische processen. In deze context vormt Adventitieel Interstitiële Vloeistof (AISF) een unieke onderzoeksuitdaging vanwege de specifieke anatomische lokalisatie en functionele complexiteit. AISF bevindt zich op het grensvlak tussen de adventitia en omliggende weefsels5 en speelt een cruciale rol in de interactie tussen de vaatwand en het zenuw- en immuunsysteem. De diepe anatomische ligging en nabijheid van bloed en lymfevloeistoffen hebben echter aanzienlijke technische uitdagingen opgeleverd voor in situ bemonstering en samenstellingsanalyse.

Traditionele technieken voor het bemonsteren van ISF, waaronder de wick-methode en chirurgische drainage, ondervinden aanzienlijke uitdagingen bij het verkrijgen van hoogzuivere AISF-monsters vanwege het risico op bloedbesmetting en weefselschade. Zo kan het chirurgisch verwijderen van het vaatepitheel schade veroorzaken aan perifere zenuwen of lymfevaten, wat resulteert in de vermenging van niet-doelbiomoleculen6. Bovendien worden deze methoden beperkt door lage bemonsteringspercentages, instabiliteit, gevoeligheid voor interferentie en slechte reproduceerbaarheid, vaak te wijten aan ontsteking veroorzaakt door subcutane lont7 en cellulaire schade tijdens spierimplantatie. De ontwikkeling van microdialyse biedt een effectievere benadering voor ISF-studies. Deze techniek maakt het mogelijk om kleine moleculen, zoals metabolieten en cytokines, in situ en dynamisch te vangen binnen de ISF zonder de vasculaire structuur te compromitteren door gebruik te maken van een semi-permeable membraanprobe. De sonde kan nauwkeurig worden geplaatst binnen de vasculaire epitheelruimte, waardoor het risico op besmetting door bloed of lymfevloeistoffen wordt verminderd. Daarnaast faciliteert het continue bemonstering, wat realtime monitoring van dynamische veranderingen in ISF-metabolisme onder verschillende omstandigheden mogelijk maakt. Zorg voor continue en stabiele monitoring van deze metabole processen tijdens het experiment.

Protocol

De dierproeven werden uitgevoerd na goedkeuring door de Animal Ethics Committee van het Peking Union Medical College. Alle procedures werden strikt gevolgd aan vastgestelde protocollen. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Illustreer het microdialysebemonsteringssysteem en bijbehorende chirurgische instrumenten zoals weergegeven in Figuur 1.
  2. Bereid kunstmatige extracellulaire vloeistof (aECF) voor met 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl en 1,25 mM glucose, en stel de pH aan naar 7,4.
  3. Bereid twee 20-kDa mD-probes voor en wijs ze aan als Probe 1 (weefselvloeistofprobe) en Probe 2 (bloedprobe). Plaats Probe 1 in steriel gefilterd gedeïoniseerd water (dH₂O) en Probe 2 in 1% natriumheparine, zodat de probe-tips continu vochtig blijven.
  4. Stel twee padparen vast (paden 1 en 2) voor "instroom" en "uitstroming." Verbind twee 1-m FEP-buissegmenten met PE50-buizen, waardoor dode ruimte wordt geminimaliseerd. Bevestig elke instroombuis op een 1-mL Exmire-spuit: vul spuit 1 met dH₂O en spuit 2 met 1% natriumheparine. Verbind de microspuiten met de probes en bereid je voor op een aECF-infusie nadat je de probes in de halsslagader hebt geplaatst.
  5. Activeer de mD-pomp en stel de debiet in op 1,5 μL/min totdat er vloeistof uit de uitlaatbuis komt. Verbind de uitlaatbuis met de monsterverzamelleiding.
  6. Vul twee microspuiten met gefilterde aECF en start het pompen bij 1 μL/min.

2. Bereiding van dieren

  1. Selecteer volwassen Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 280 ± 20 g (n = 6).
  2. Induceer anesthesie met 3% isofluraan en houd dit vast met 1,8%-2,2% isoflurane in een lucht/zuurstofmengsel terwijl je de hartactiviteit monitort (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Bevestig diepe anesthesie door de afwezigheid van pijnrespons te beoordelen en een verlaagde hartslag (340-390 slagen per minuut) te noteren. Leg de rat op een thermostatisch deken en immobiliseer de ledematen.
  3. Breng ontharingscrème aan op de nek en linker achterpoot, uitgaande tot aan de linker onderbuik. Desinfecteer de onthaarde gebieden twee keer met jodofore en verwijder restjodium met 75% medische alcohol.

3. Plaatsing van een dubbele sonde (femorale adventitia en jugulaire vene)

  1. Gebruik een sonde met een 10 mm actief dialysevenster (CMA-20, 20 kDa cut-off, 0,5 mm asdiameter) zoals weergegeven in Figuur 2A.
  2. Maak de geleidenaald en afscheurbuis klaar (Figuur 2B).
  3. Strek de achterpoot van de rat zodat de lijn die het kniegewricht en het midden van de liesvouw verbindt, loodrecht staat op de lengteas van het lichaam. Meet een segment van 2 cm langs de huid van het liesgebied in de richting van het achterpoot om het chirurgische herkenningsgebied te definiëren (Figuur 2C). Identificeer het middenpunt van dit liesgebied als het positioneringspunt van het microvenster. Markeer de prikplaats 2 cm lateraal van dit positioneringspunt (Figuur 2D).
  4. Plaats het dier onder een stereomicroscoop.
  5. Maak een incisie van 0,5-0,8 cm in het midden van de liesvouw om visualisatie te vergemakkelijken en een nauwkeurige plaatsing van de sonde binnen het perivasculaire membraan te garanderen. Ontleed het subcutane weefsel bot om de arteria femoralis en -vene, de vena saphena en de oppervlakkige buikwandader bloot te leggen (Figuur 2E).
  6. Omsluit de buitenste laag van de priknaald in een scheurbare buis om een geleidingsnaald te creëren.
  7. Controleer of er geen bloedvaten onder de huid aanwezig zijn bij de prikplaats. Steek de naald verticaal door de huid en stel vervolgens de hoek aan op 45° om de weefselruimte rond de vena saphena binnen te komen.
  8. Beweeg de naald in de richting van de bloedstroom in de vena grote saphena, waarbij je gedurende de procedure nauw contact houdt met de vaatwand. Gebruik een stereomicroscoop om de naaldpositie in realtime te monitoren en vasculaire schade of bloedbesmetting te voorkomen. Leid vervolgens de naald in de adventitia van de femorale vena (Figuur 2F).
  9. Haal de priknaald weg terwijl je de afscheurbuis in het weefsel laat zitten (Figuur 2G).
  10. Plaats de weefselvloeistofprobe in de afbreekbare katheter en open voorzichtig de katheter om de bemonsteringsplaats bloot te leggen en het weefselmonster te verwijderen (Figuur 2H). Zorg ervoor dat de sonde precies is geplaatst binnen de adventitia van de femorale arteria en vene (Figuur 2I). Bevestig de sonde aan de huid voordat je hecht (Figuur 2J). Voer alle procedures uit onder strikte aseptische omstandigheden, waarbij je erop let dat de vasculaire adventitia verstoord wordt en dat weefselontsteking of reacties van vreemde voorwerpen voorkomen die de ophoping van weefselvloeistof kunnen verstoren.
  11. Controleer de positie van de sonde door een chirurgische liniaal samen met de vaste sonde te fotograferen om de belichte lengte te documenteren, en presenteer deze afbeelding zoals weergegeven in Figuur 2I.
  12. Maak een incisie van 2 cm op de huid ongeveer 0,5 cm lateraal van de middenlijn van de hals, beginnend 1 cm boven de sternusinkering.
  13. Snijd bot door de sternocleidomastoïde spier om de vena jugularis bloot te leggen, die lateraal ligt van de halsslagader en te herkennen is aan zijn donkerblauwe kleur. Gebruik een bevochtigd wattenstaafje om de fascia voorzichtig te scheiden, waarbij je voorzichtig bent om contact met de nervus vagus te vermijden.
  14. Met behulp van microscopische pincetten verhoog je voorzichtig het buitenmembraan van de halsslagaar en verwijder je voorzichtig het omliggende bindweefsel om minimaal 1 cm vrije vatenlengte te verkrijgen. Plaats een 4-0 zijden hechting proximaal om als reserveband te dienen (Figuur 2K).
  15. Voor veneuze punctie maakt u een schuine incisie onder een hoek van 45°, ongeveer een derde van de oppervlakte van het vat. Gebruik microtang om de incisie voorzichtig te openen en een ingang te creëren voor het inbrengen van de sonde.
  16. Steek de probetip voorzichtig in de ader en breng deze langzaam naar een diepte van 3,5-4,0 cm, zodat de tip de ingang van het rechter atrium bereikt (Figuur 2L).
  17. Zet de sonde vast door de proximale zijden ligatuur met een dubbele knoop aan te trekken. Sluit de spierlaag met 4-0 Vicryl hechtingen en hecht daarna de huid met onderbroken hechtingen. Bevestig het buitenste deel van de sonde aan het huidoppervlak om verplaatsing te voorkomen.

4. Monsterafname en sondeterugwinning

  1. Monsterafname: Evalueer de relatie tussen weefseldialyse en monsteroverdracht in de verzamelbuis. Houd een totaalvolume van 20 μL tussen de probe en de collector.
    1. Laat een periode van 20 minuten toestaan om het monster door de sonde en buis te laten reizen en het einde van de buis te bereiken voor afname met een debiet van 1 μL/min. Verzamel een voldoende volume om de vereiste concentratie voor de assay te bereiken. Verzamel 30 μL dialysaat per verzamelbuis.
  2. Monsteropslag: Pre-koel 0,5 mL polypropyleen verzamelbuizen tot 4 °C. Direct na het verzamelen sluit je de buizen af, vries je ze 30 seconden in vloeibare stikstof en plaats je ze binnen 2 minuten in een vriezer van -80 °C.
  3. Basismonster: Volledige monsterevenwicht vóór het starten van de monsterafname. Verzamel drie monsters per rat onder narcose om een stabiele metingsbasis vast te stellen.
  4. Verwijdering van de sonde: Verwijder de sonde uit het hoofd van het dier na voltooiing van het monster en plaats deze in een opslagbuis met 1% natriumheparine. Euthanace het dier door het inademen van overtollig isofluran.
  5. Probeconservering: Spoel de sonde grondig af met zoutoplossing en bewaar deze in een flesje met zoutoplossing. Spoel de buisjes door met zoutoplossing met een spuit om microbiële groei te voorkomen. Hergebruik de sonde alleen als deze voldoende doorstroming behoudt en het membraan intact blijft.

5. Data-analyse

  1. Voer Principal Component Analysis (PCA), Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA) en aanvullende statistische analyses uit met MetaboAnalyst 6.0. Gebruik OPLS-DA specifiek om de Variabele Belangrijkheid in Projectie (VIP) te bepalen.
  2. Pas niet-parametrische tests toe, waaronder P-waarde beoordelingen en vouwveranderingsanalyse, om differentiële metabolieten te onderzoeken. Stel kritieke drempels voor het screenen van differentiële metabolieten in als VIP > 1, FC ≥ 2, of FC ≤ 0,5, en P < 0,05.
  3. Annoteer de geïdentificeerde metabolieten met behulp van de KEGG Compound Database.

6. HPLC - MS/MS

  1. Voer metabolietkwantificatie uit met een AB Sciex 6500+ triple quadrupole massaspectrometer uitgerust met een elektrospray-ionisatie (ESI) bron die in positieve ionenmodus werkt.
  2. Stel de instrumentparameters als volgt in: gordijngas, 40 psi; botsingsgas, 10 psi; ionenbrongas 1 (GS1), 50 psi; ionenbrongas 2 (GS2), 55 psi; ionensproeispanning, 4500 V; en brontemperatuur, 550 °C.
  3. Bedien het systeem in multiple reaction monitoring (MRM)-modus. Optimaliseer MRM-overgangen, declusteringspotentialen en botsingsenergieën individueel voor elk metaboliet. Voer gegevensverzameling uit met Analyst 1.7.1-software en kwantitatieve analyse met MultiQuant 3.0.3.
  4. Voor chromatografische scheiding gebruik een C18-kolom (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) die op 45 °C wordt gehouden. Bereid de mobiele fasen voor als (A) 0,1% mierenzuur in water en (B) 0,1% mierzuur in acetonitril. Stel de debiet in op 0,35 mL/min en het injectievolume op 6 μL. Houd de temperatuur van de autosampler op 4 °C vóór analyse.
    OPMERKING: Voor deze studie duurde elke run in totaal ongeveer 25 minuten.

Resultaten

De dataset werd genormaliseerd door het toepassen van sommatie- en logaritmische transformaties, waarna een uitgebreide set statistische analyses werd uitgevoerd. Principal Component Analysis (PCA) werd uitgevoerd (Figuur 3A), die duidelijke scheidingen aantoonde en metabole verschillen benadrukte. Vervolgens werd een Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis (OPLS-DA) model ontwikkeld, waarbij de resulterende scores in Figuur 3B de discriminerende effectiviteit van het model aantonen. Bij de evaluatie van 618 metabolieten identificeerden vulkaangrafieken die AISF- en bloedmonsters vergeleken 146 differentiële metabolieten, waarbij weefselvloeistof zowel neergereguleerde als opgereguleerde metabolieten vertoonde (Figuur 3C). Daarnaast is er een heatmap gemaakt om een vergelijkend overzicht te geven van de top 50 differentiële metabolieten (Figuur 3D).

Om de betrouwbaarheid van de bemonsteringsmethode te beoordelen, werden serotonine en melkzuur gebruikt als positieve controles die respectievelijk weefselvloeistofcomponenten en bloed vertegenwoordigen. De resultaten kwamen overeen met de vastgestelde distributiepatronen van deze componenten over verschillende lichaamsvloeistoffen, zoals geïllustreerd in Figuur 4. Aanvullende Figuur 1 toont de stabiliteit van lactaat en serotonine in microdialysaat-aliquoten die worden opgeslagen bij -80 °C.

De 146 differentiële metabolieten werden systematisch ingedeeld in verschillende categorieën: nucleosiden, nucleotiden en hun analogen; vetzuren en hun derivaten; aminozuren, peptiden en hun analogen; koolhydraten en koolhydraatconjugaaten; organische zuren en hun derivaten; biogene amines; purines en pyrimidijnen; vitamines en steroïden; evenals andere verbindingen (Figuur 5A). Aanvullende Tabel 1 toont differentiële metabolieten die in het bloed zijn aangetroffen. Heatmap-analyses verduidelijken verder de verrijkingspatronen van biogene aminen en aminozuren, peptiden en hun analogen in verschillende lichaamsvloeistoffen (Figuur 5B,C). Differentiële metabolietverrijkingsanalyse wordt weergegeven in Figuur 6. Aanvullende Tabel 2 geeft de variatiecoëfficiënt (CV) weer voor vijftien willekeurig geselecteerde metabolieten in drie opeenvolgende perivasculaire weefsel-vloeistofmonsters.

Figuur 1
Figuur 1: Afbeeldingen van het experimentele apparaat. (A) Gekoelde fractieverzamelaar. (B) Spuitpomp. (C) Microspuiten. (D) Chirurgische instrumenten, waaronder vaatschaar en pincet, enz. (E) Anesthesiemachine. (V) Microdialyseprobes. (G) Microdialyseprobes, weefselgeleidersnaald en een scheurbare buis. (H) Weefselgeleidernaalden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: De belangrijkste stappen in de studie. (A) Een schematische weergave van een diagram dat de positie van de operatielocatie en de oriëntatie van de sonde illustreert. (B) Identificatie van kritisch vasculaire verbindingen om nauwkeurige observatie van de plaatsingsplaatsen van de sonde te waarborgen. (C) Inbrengen van de geleidenaald die de huid binnendringt en de weefselruimte binnendringt. (D) Het terugtrekken van de geleidenaalden wordt teruggetrokken, waardoor de scheurbare buis in het weefsel achterblijft. (E) De microdialysesonde wordt via het gevestigde kanaal in het weefsel gebracht. (F) Zachte terugtrekking van de afscheurbare buis. De afscheurbare buis wordt voorzichtig ingetrokken nadat de sonde op zijn plaats is bevestigd. (G) Visualisatie van sondes die in het epitheel van de femorale arteriële en veneuze vaten zijn geplaatst. (H) Scheiding van weefsel van de halsslagven. (I) Plaatsing van de sonde in de halsslagvene. (J) De microdialysesonde wordt op het huidoppervlak bevestigd. (K) isolatie van de halsslagader. (L) Inbrengen van de sonde in de halsslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Multivariate statistische analyse van interstitiële vloeistof (ISF) en bloed. (A) De gegevens zijn verkleind om significante scheidingen te benadrukken, waarbij duidelijke verschillen tussen ISF en bloedcomponenten worden aangetoond. (B) De scores van het orthogonale gedeeltelijke kleinste-kwadraten-discriminantenanalyse (OPLS-DA) modelscore geven respectievelijk R2Y- en Q2-waarden van 0,925 en 0,811 aan. (C) De vulkaangrafiek toont 146 differentiële metabolieten, met 85 metabolieten die zijn gedownreguleerd en 61 zijn opgereguleerd in ISF. (D) Overeenkomstig tonen heatmaps die de top 30 metabolieten in ISF en bloed contrasteren, een duidelijk onderscheid tussen de twee sets componenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: De presentatie van een reeks boxplots verduidelijkte de verrijkingsniveaus van lactaat en serotonine in ISF en bloed. Alle datapunten vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM; Foutbalken worden weergegeven voor alle kwantitatieve panelen. Paneel (A) laat zien dat ISF-monsters een significant grotere verrijking van lactaat vertonen in vergelijking met bloedmonsters. Daarentegen toont panel (B) aan dat serotonine meer verrijkt is in bloedmonsters, die tegelijkertijd lagere lactaatwaarden vertonen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5: De classificatieringkaart van differentiële metabolieten en de warmtekaart van aminozuren, peptiden en analogen, evenals biogene aminen, worden weergegeven. (A) Elk kleurblok komt overeen met een aparte klasse metabolieten. Aminozuren, peptiden en analogen vormen de grootste categorie en vormen 19,29% van het totaal, gevolgd door nucleosiden, nucleotiden en analogen (15%), vetzuren en derivaten (12,86%), koolhydraten en koolhydraatconjugaten (7,86%), organische zuren en derivaten (10%), biogene aminen (7,14%), purines/pyrimidinen (5,71%), vitaminen en steroïden (8,57%) en andere verbindingen, waaronder indolen, azepinen, pyridines en benzenen, met 13,57%. (B) In interstitiële vloeistof (ISF) zijn de verrijkingsniveaus van verbindingen zoals Deoxycarnitine en Spermidine binnen de biogene aminecategorie significant verhoogd vergeleken met die in bloed, terwijl de niveaus van serotonine (D4), serotonine, tryptamine en verwante verbindingen aanzienlijk zijn verlaagd. (C) Bij ISF zijn de meeste metabolieten die geassocieerd zijn met aminozuren, peptiden en analogen aanzienlijk lager dan die in het bloed worden waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6: Metabolietensetverrijkingsanalyse (MSEA) van normale interstitiële vloeistof toonde aan dat metabole activiteit voornamelijk verdeeld is over routes gerelateerd aan energieproductie, redoxhomeostase en aminozuurvernieuwing. De belangrijkste verrijkte routes zijn butanoaatmetabolisme, purinemetabolisme en glutathionmetabolisme, wat het behoud van mitochondriale energievoorziening en antioxidantcapaciteit onder fysiologische omstandigheden weerspiegelt. Daarnaast zijn verschillende aminozuurgerelateerde routes vertegenwoordigd, zoals het metabolisme van arginine en proline, het metabolisme van tryptofaan, en het metabolisme van cysteïne en methionine, wat wijst op actieve aminozuurinterconversie en regulatie van stikstofbalans in de extracellulaire micro-omgeving. Deze bevindingen suggereren dat het normale interstitiële metaboloom een dynamisch evenwicht handhaaft tussen bio-energetische processen, oxidatieve verdediging en aminozuurmetabolisme, wat de weefselhomeostase en microcirculatiestabiliteit ondersteunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Stabiliteit van lactaat en serotonine in microdialysaat-aliquoten opgeslagen bij -80 °C. De gegevens zijn gemiddeld ± SEM (n = 6 replicates per tijdstip). Geen enkele analyte week >5% af ten opzichte van de basislijn over 72 uur. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Differentiële metabolieten gedetecteerd in bloed en adventieel interstitiële vloeistof microdialysaat. Dit omvat metabolietnaam, fold-change (FC), de T-test P-waarde van de student en VIP (OPLS-DA). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Variatiecoëfficiënt (CV) voor vijftien willekeurig geselecteerde metabolieten in drie opeenvolgende perivasculaire weefsel-vloeistofmonsters. Alle cv's zijn <20%. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Interstitiële vloeistof (ISF) is de waterige micro-omgeving die elke weefselcel omhult en ongeveer 75% van het extracellulaire vloeistofcompartiment 8,9 uitmaakt. Gegenereerd door capillaire filtratie van plasma, mist ISF het cellulaire en hoge eiwitgehalte van bloed, maar behoudt het elektrolyten, kleine opgeloste stoffen en water9. Deze samenstelling positioneert ISF als de centrale interface tussen de vaat- en cellulaire werelden. Functioneel is ISF een dynamisch transportmedium. Het transporteert zuurstof, glucose, aminozuren en micronutriënten van de bloedbaan naar cellen, terwijl het tegelijkertijd kooldioxide, ureum en andere metabole afvalstoffen verzamelt voor terugkeer naar decirculatie. De vloeistof dient ook als smeermiddel en buffer, waarmee interstitiële osmotische druk, pH en ionische balans11 worden gestabiliseerd. Naast metabolisme ondersteunt ISF immuunsurveillance door leukocyten, antilichamen en cytokines door weefselruimtes te vervoeren en fungeert het als communicatieweg voor hormonen en paracriene signalen12,13. In vergelijking met bloed is ISF in wezen een celvrije, eiwitarme filtraat14. Bloed, beperkt tot de vaatboom, bevat rode en witte bloedcellen, bloedplaatjes en hoge concentraties albumine en stollingsfactoren. Zuurstof- en voedingsstoffenniveaus zijn het hoogst in het bloed en steeds lager in ISF vanwege cellulaire opname, terwijl afvalstoffen zich ophopen in ISF voordat ze in de lymfe- of veneuze terugvoer10 terechtkomen. De afwezigheid van grote eiwitten en cellen in normale ISF minimaliseert de oncotische druk en maakt snelle diffusie mogelijk, maar ontstekingstoestanden kunnen dit profiel tijdelijk veranderen15.

De studie van ISF blijft echter beperkt vanwege het ontbreken van eenvoudige, snelle en betrouwbare steekproefmethoden. Huidige methoden omvatten micronaald (MN) patches, zuigblaasjes, omgekeerde iontoforese, thermische ablatie en microdialyse. MN-patches creëren microkanalen voor ISF-extractie via de huid, waarbij core-shell varianten ISF in minder dan 30 seconden extraheren en osmotische hydrogel-MN's in ongeveer 3 minuten. Deze kunnen worden gecombineerd met sensoren voor on-patch analyse, maar zijn beperkt door volume en vereisen een balans tussen sterkte en zwelling. Zuigblaren geven pure ISF met minimale bloedbesmetting, maar zijn invasief, pijnlijk en langzaam 16,17,18. Omgekeerde iontoforese (RI) maakt gebruik van lage elektrische stromen om geladen analyten, zoals glucose en lithiumionen, naar het huidoppervlak te transporteren voor niet-invasieve monitoring. Toch kent het uitdagingen zoals lage doorvoer, variabiliteit tussen individuen en mogelijke huidirritatie 19,20. Transdermale toediening (TA) verstoort het stratum corneum met lokale verwarming zodat ISF passief hydrofiele microkanalen kan binnendringen. Hoewel het apparaat eenvoudiger ontwerpt, verzamelt het minder dan 5 μL vloeistof, wat zeer gevoelige detectie en zorgvuldig thermisch beheer vereist om brandwondente voorkomen. Daarentegen biedt microdialyse (MD), die afhankelijk is van diffusie over geïmplanteerde semi-permeabele probes, unieke moleculaire selectiviteit via instelbare molecuulgewichtsafkapmembraanen (MWCO), zoals 10 kDa voor glucose en 100 kDa voor eiwitten en cytokines23,24. Deze techniek ondersteunt continue en minimaal invasieve bemonstering. MD is echter operationeel complex, vereist in vivo kalibratie en vertoont variabele herstelpercentages voor hydrofobe soorten. Opmerkelijk is dat MD de enige techniek is die in staat is tot grootte-selectieve isolatie van grote biomoleculen25. Vergelijkende studies van dialyseat verzameld naast vasculaire adventitia versus bloed tonen verschillende lactaat- en serotonineprofielen aan, waarmee de stabiliteit en specificiteit van de MD-benadering worden bevestigd.

Dierstudies hebben aangetoond dat, synergetisch gereguleerd door het hart en de longen, de ISF kan stromen in de adventitia die geassocieerd wordt met grote slagaders, aders en perifere zenuwen 5,9. Meestal bevat ISF metabolieten die rechtstreeks uit plasma zijn afgeleid en lokaal worden gesynthetiseerd in weefsels 26,27,28. Het is daarom aannemelijk dat de geïdentificeerde overlappingen en verschillen tussen de metabolieten in AISF en plasma de betrokkenheid van het ISF-circulatiesysteem vertegenwoordigen bij het transport en de verwijdering van voedingsstoffen en metabolieten in weefsels langs de bloedvaten. De hier geïntroduceerde microdialyse-gebaseerde techniek voor het bemonsteren van de AISF zal de studies van de systemische ISF-circulatie bij het reguleren van het metabolisme in meerdere organen en weefsels in het hele lichaam aanzienlijk verbeteren.

Het 20-kDa moleculaire gewichtsgrensmembraan (MWCO) dat in deze studie wordt gebruikt, is optimaal ontworpen voor het kwantitatieve herstel van kleine metabolieten, waaronder glucose, lactaat, pyruvaat en aminozuren. Echter, het onderbemonstert of sluit consequent tal van biologisch belangrijke macromoleculen uit, zoals cytokinen, chemokines, groeifactoren en extracellulaire enzymen. Klinische en methodologische reviews hebben aangetoond dat standaard 20-kDa-katheters effectief zijn in het verzamelen van kleine hydrofiele metabolieten, maar dat ze een lage herstelgraad vertonen voor eiwitten en ontstekingsmediatoren29. Daarom zijn membranen met hogere MWCO's (bijv. 100 kDa) of alternatieve bemonsteringsstrategieën noodzakelijk voor nauwkeurige cytokinekwantificatie30,31. Daarom zal toekomstig onderzoek door onze groep membranen met grotere MWCO's gebruiken om de macromoleculaire samenstelling van perifere interstitiële vloeistof te karakteriseren. In deze studie werden dialysaten onder algehele narcose verzameld. Microdialyse is eerder gevalideerd bij wakkere, vrij bewegende dieren, en verschillende "open-flow" microperfusietechnieken zijn aangepast voor gebruik in bewuste modellen32. Het aanpassen van ons probe-ontwerp en implantatieprotocol voor gebruik bij wakkere dieren vereist echter het aanpakken van uitdagingen met betrekking tot vastbinden, dierstress, probestabiliteit, bewegingsartefacten en langdurige patentie. We zijn momenteel bezig met het ontwikkelen van een lichtgewicht tether-swivelsysteem en zijn van plan bewust bemonstering uit te voeren in onze volgende studie.

Openbaarmakingen

Er zijn geen financiële belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door het Nationaal Sleutelonderzoeks- en Ontwikkelingsprogramma van China (2025YFC3507601) en de Fundamentele Onderzoeksfondsen voor de Centrale onderzoeksinstituten voor het openbaar welzijn (nr. ZZ-YC2023007).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ECG monitoring systemAD Instruments,AustraliaPowerLabUitrusting
ForcepsF.S.T(Fine Science Tools ) Germany11252-00chirurgische instrumenten
Heparine natriumSigma-Aldrich, USA9041-08-1Materiaal
High performance liquid chromatography tandem mass spectrometer (HPLC-MS/MS)SCIEX, USAExionLC-20ACUitrusting
IRIS standaard schaarF.S.T(Fine Science Tools ) Germany14060-09chirurgische instrumenten
IsofluraanRWD Life Science,PRCR510-22-10Materiaal
Low-Flow Anesthesie SysteemKent Scientific,USASomnoSuiteUitrusting
Microdialyse Perfusie Vloeistof T1CMA Microdialysis, SwedenP000034Materiaal
Microdialyse sonde, 20 EliteCMA Microdialysis, Sweden8010436Materiaal
Microdialyse Spuiten 1 mL GastightCMA Microdialysis, Sweden8309020Materiaal
Gekoelde Fractie CollectorCMA Microdialysis, Sweden470Uitrusting
Split Tubing voor CMA 20 ProbesCMA Microdialysis, Sweden8309019Materiaal
Stereoscopische microscoopOlympus, JapanSZ61Uitrusting
SpuitpompCMA MD AB, Sweden800310Uitrusting

Referenties

  1. Reed, R. K., Rubin, K. Transcapillary exchange: role and importance of the interstitial fluid pressure and the extracellular matrix. Cardiovasc Res. 87 (2), 211-217 (2010).
  2. Wiig, H., Swartz, M. A. Interstitial fluid and lymph formation and transport: physiological regulation and roles in inflammation and cancer. Physiol Rev. 92 (3), 1005-1060 (2012).
  3. Iliff, J. J., et al. A paravascular pathway facilitates CSF flow through the brain parenchyma and the clearance of interstitial solutes, including amyloid β. Sci Transl Med. 4 (147), 147ra111(2012).
  4. Jain, R. K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia. Cancer Cell. 26 (5), 605-622 (2014).
  5. Li, H., et al. Regulation of interstitial fluid flow in adventitia along vasculature by heartbeat and respiration. iScience. 27 (4), 109407(2024).
  6. Clough, G. F. Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7 (3), E686-E692 (2005).
  7. Fadnes, H. O., Aukland, K. Protein concentration and colloid osmotic pressure of interstitial fluid collected by the wick technique: Analysis and evaluation of the method. Microvasc Res. 14 (1), 11-25 (1977).
  8. Brinkman, J. E., Dorius, B., Sharma, S. Physiology, body fluids. , StatPearls. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482447/ (2025).
  9. Li, H., et al. Active interfacial dynamic transport of fluid in a network of fibrous connective tissues throughout the whole body. Cell Prolif. 53 (2), e12760(2020).
  10. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Front Neuroanat. 15, 665803(2021).
  11. Hussain, N. M., Amin, B., O'Halloran, M., Elahi, A. Development and characterization of interstitial-fluid-mimicking solutions for pre-clinical assessment of hypoxia. Diagnostics. 13 (19), 3125(2023).
  12. Handly, L. N., Pilko, A., Wollman, R. Paracrine communication maximizes cellular response fidelity in wound signaling. eLife. 4, e09652(2015).
  13. Fan, D., Creemers, E. E., Kassiri, Z. Matrix as an interstitial transport system. Circ Res. , (2014).
  14. Friedel, M., et al. Opportunities and challenges in the diagnostic utility of dermal interstitial fluid. Nat Biomed Eng. 7 (12), 1541-1555 (2023).
  15. Levick, J. R., Michel, C. C. Microvascular fluid exchange and the revised Starling principle. Cardiovasc Res. 87 (2), 198-210 (2010).
  16. Jiang, X., et al. Microneedle-based sampling of dermal interstitial fluid using a vacuum-assisted skin patch. Cell Rep Phys Sci. 5 (6), 101975(2024).
  17. Wu, Z., et al. Interstitial fluid-based wearable biosensors for minimally invasive healthcare and biomedical applications. Commun Mater. 5 (1), 33(2024).
  18. Samant, P. P., Prausnitz, M. R. Mechanisms of sampling interstitial fluid from skin using a microneedle patch. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (18), 4583-4588 (2018).
  19. Sieg, A., Guy, R. H., Delgado-Charro, M. B. Electroosmosis in transdermal iontophoresis: implications for non-invasive and calibration-free glucose monitoring. Biophys J. 87 (5), 3344-3350 (2004).
  20. Nair, A. B., Goel, A., Prakash, S., Kumar, A. Therapeutic drug monitoring by reverse iontophoresis. J Basic Clin Pharm. 3 (1), 207-213 (2012).
  21. O'Brien, D. J., et al. A needle-free transdermal patch for sampling interstitial fluid. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (9), 2573-2580 (2023).
  22. Yang, J., et al. Microneedle-integrated sensors for extraction of skin interstitial fluid and metabolic analysis. Int J Mol Sci. 24 (12), 9882(2023).
  23. Stenken, J. A., et al. How minimally invasive is microdialysis sampling? A cautionary note for cytokine collection in human skin and other clinical studies. AAPS J. 12 (1), 73-78 (2009).
  24. Dorothee, S., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (5), 1322-1330 (2024).
  25. Kho, C. M., et al. A review on microdialysis calibration methods: the theory and current related efforts. Mol Neurobiol. 54 (5), 3506-3527 (2017).
  26. Oharazawa, A., et al. Metabolome analyses of skin dialysate: insights into skin interstitial fluid biomarkers. J Dermatol Sci. 114 (3), 141-147 (2024).
  27. Samant, P. P., et al. Sampling interstitial fluid from human skin using a microneedle patch. Sci Transl Med. 12 (571), eaaw0285(2020).
  28. Niedzwiecki, M. M., et al. Human suction blister fluid composition determined using high-resolution metabolomics. Anal Chem. 90 (6), 3786-3792 (2018).
  29. Hillman, J., et al. Microdialysis of cytokines: methodological considerations, scanning electron microscopy, and determination of relative recovery. J Neurosci Methods. 179 (1), 29-33 (2009).
  30. Buchholtz, D. A., et al. Negligible in vitro recovery of macromolecules from microdialysis using 100 kDa probes and dextran in perfusion fluid. Neurochem Res. 49 (8), 1942-1951 (2024).
  31. Klein, J., et al. Enhanced microdialysis relative recovery of inflammatory cytokines using antibody-coated microspheres. Anal Chem. 82 (18), 7850-7855 (2010).
  32. Scheller, H., et al. Observational evaluations of mice during cerebral microdialysis for pediatric brain tumor research. PLoS One. 9 (5), e98256(2014).

Herprints en machtigingen

Tags

Adventitiële ISFrat femoralisarteriemetabole profileringprincipale componentenanalyselaagmoleculaire metabolietenbiomarker-ontdekkingvasculaire pathofysiologie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.