Een kruidenklysmaformule verlicht colitis ulcerosa door de enterische gliale activatie te remmen via de S100β/RAGE/NF-κB-route

Samenvatting

Een kruidenklysmaformule die Sanguisorba officinalis, Bletilla striata en Acacia catechu combineert, werd geëvalueerd met behulp van LC-MS/MS-profilering, S100β-koppeling, een DSS-colitismodel en LPS/IFN-γ-geactiveerde enterische glia. De formule schakelde S100β in, onderdrukte gliale activatie en verminderde de p-NF-κB/iNOS-expressie, wat verbeterde aanduidt via de S100β-RAGE-NF-κB-as.

Samenvatting

Activatie van enterische gliale cellen (EGC's) draagt bij aan de pathogenese van colitis ulcerosa (UC). Deze studie onderzocht of Dibai Enema Liquid (DBE)—een kruidenklysma die Sanguisorba officinalis, Bletilla striata en Acacia catechu combineert—EGC-gedreven ontstekingen moduleert. LC-MS/MS-profielen van DBE-bestanddelen en geprioriteerde verbindingen werden gekoppeld aan S100β. De werkzaamheid werd beoordeeld bij door dextransulfaat natrium (DSS)-geïnduceerde muiscolitis met behulp van lichaamsgewicht, colonlengte, histopathologie en cytokineniveaus (ELISA). Gliale activatiemarkers werden gemeten door immunohistochemie, immunofluorescentiecolocalisatie, kwantitatieve PCR (qPCR) en immunoblotting. Een in vitro model gebruikte CRL-2690 enterische glia geactiveerd met lipopolysaccharide plus interferon-γ, met DBE-bevattend rattenserum (15%) als interventie. Koppeling suggereerde een sterke voorspelde binding van verschillende DBE-componenten aan S100β. DSS verhoogde TNF-α en IL-1β, verstoorde tight junctions en verhoogde S100β/GFAP op zowel mRNA- als eiwitniveau, wat consistent is met gliale hyperactivatie; DBE draaide deze veranderingen aanzienlijk terug. In vitro reduceerde DBE S100β, RAGE, iNOS (NOS2) en fosforyleerde NF-κB p65. Gezamenlijk lijkt DBE UC te verlichten door de activatie van EGC te remmen en de S100β/RAGE/NF-κB/iNOS-as te downreguleren, waardoor de slijmvliesintegriteit behouden blijft.

Inleiding

Colitis ulcerosa (UC) is een belangrijk subtype van inflammatoire darmziekte (IBD) die wordt gekenmerkt door chronische mucosale ontsteking van de dikke darm, met een toenemende wereldwijde last sinds 1990, en UC is verantwoordelijk voor een aanzienlijk aandeel van de gevallen van IBD ^1,2. Typische verschijningen zijn buikpijn en bloedige diarree, wat leidt tot aanzienlijke lichamelijke en psychische stress en hoge behandelingskosten³. Hoewel de behandelmogelijkheden zijn uitgebreid, wordt langdurige blootstelling aan immunomodulatoren en biologische middelen die de systemische immuniteit onderdrukken geassocieerd met een verhoogd risico op lymfoom en opportunistische infecties, en een deel van de patiënten blijft refractair of intolerant⁴. UC wordt algemeen beschouwd als een immuungemedieerde aandoening waarbij verstoring van de mucosale immuunhomeostase centraal staat in de pathofysiologie⁵. Echter, steeds meer bewijs wijst erop dat mucosale immuunmechanismen alleen onvoldoende zijn om alle kenmerken van IBD te verklaren; het enterisch zenuwstelsel (ENS) draagt bij aan darmontsteking en breidt het concept van ziekte uit naar neuroontsteking binnen IBD⁶.

Enterische gliale cellen (EGC's), die in volwassen zoogdieren in aantal zijn boven enterische neuronen, worden nu erkend als belangrijke regulatoren van intestinale homeostase en ontsteking ^7,8. EGC's moduleren de functie van epitheelbarrières door mediatoren zoals GDNF, TGF-β1, S100β en 15d-PGJ2 vrij te geven, waardoor de permeabiliteit en slijmvliesintegriteit⁹ worden beïnvloed. Onder deze mediatoren kan S100β downstream cascades activeren – waaronder de RAGE/NF-κB-route – wat leidt tot barrièreschade en inflammatoire amplificatie^10,11. EGC's vormen ook immuunresponsen door het macrofagenfenotype en viscerale gevoeligheid te reguleren via connexin-43 en M-CSF, en door suppressieve effecten uit te oefenen op T-cellen in vitro, waarbij EGC-activatie als een behandelbaar therapeutisch doelwit in UC^12,13 wordt benadrukt.

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) wordt steeds vaker onderzocht in UC en heeft veelbelovende voordelen laten zien in klinische en experimentele omgevingen^14,15. De klassieke combinatie van Sanguisorba officinalis (Diyu) en Bletilla striata (Baiji), samen met Acacia catechu (Ercha), is al lange tijd gedocumenteerd voor dysenterische aandoeningen in materia medica-bronnen en wordt vermeld in de Chinese Farmacopoeia vanwege hemostatische, pijnstillende en wondgenezingsindicaties. Hedendaagse studies rapporteren antibacteriële, ontstekingsremmende, antioxidatieve en anti-ulcus activiteiten voor deze botanicals, terwijl A. catechu ook neuroprotectieve eigenschappen vertoont met catechine als prominent bestanddeel^16,17. In vergelijking met conventionele systemische immunosuppressie zou een formulering die gebruikmaakt van EGC-gecentreerde neuro-immuunroutes complementaire effectiviteit kunnen bieden met een duidelijk mechanisme en mogelijk minder systemische immuungerelateerde risico's^18,19.

Deze studie evalueert of de gecombineerde bereiding van Diyu, Baiji en Ercha (DBE) UC vermindert door de activatie van EGC te onderdrukken. Er wordt een geïntegreerde aanpak gebruikt: ongerichte LC-MS/MS-profilering om bestanddelen te prioriteren, moleculaire koppeling tegen S100β, validatie in een door dextran sulfaat natrium geïnduceerd colitismodel, en mechanistische assays in EGC's. Het werk benadrukt een neuro-immuunmechanisme – S100β/RAGE/NF-κB/iNOS-loos – dat in eerdere UC-therapieën werd onderzocht, en schetst praktische implicaties voor dosisselectie, formuleringsoptimalisatie en daaropvolgende translationele studies.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Beijing University of Chinese Medicine [BUCM-2023-0912] en werden uitgevoerd volgens institutionele en nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Er waren geen menselijke proefpersonen betrokken.
De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Reagentia en materialen

Analytische oplosmiddelen en moleculair-biologisch reagentia werden overal gebruikt. Alle commerciële informatie, inclusief fabrikanten, catalogusnummers en softwarelicentiegegevens, wordt vermeld in de Materiaaltabel (xlsx). Water voor alle voorbereidingen werd gedeïoniseerd en gefilterd. Alle buffers werden vers voorbereid of opgeslagen onder de hieronder gespecificeerde omstandigheden.

2. Apparatuur en software-opstelling

Een UPLC-MS/MS-systeem gekoppeld aan een quadrupool time-of-flight massaspectrometer; een gekoelde centrifuge met een schwenkbakrotor; een CO₂-incubator die wordt gehandhaafd op 37 °C, 5% CO₂ en ≥95% relatieve luchtvochtigheid; een microplaatlezer (450 nm); een realtime PCR-thermocycler; elektroforese en deppingsapparaat; en een fluorescentiemicroscoop met vaste excitatie-/emissiefilters werd gebruikt. Instrumentbesturing en data-analyse werden uitgevoerd in MassLynx v4.2 voor chromatografische en massaspectrometrische data en AutoDock 4.2 met AutoDockTools 1.5.7 voor docking. Beeldanalyse werd uitgevoerd in ImageJ/Fiji v1.53.

3. Bereiding van Dibai klysmavloeistof (DBE)

Het kruidenmengsel bestaande uit Diyu (50 g), Baiji (50 g) en Ercha (20 g) werd grof gepletterd en 30 minuten geweekt in 1.200 mL gedeïoniseerd water bij kamertemperatuur om volledige hydratatie te garanderen. Het geweekte mengsel werd 30 minuten stevig gekookt en af en toe geroerd om hechting te voorkomen. Het hete aftrek werd gefilterd door steriel, meerlaags medisch gaas in steriel glaswerk om onoplosbaar materiaal te verwijderen. Het filtraat werd vacuümgeconcentreerd in een waterbad dat niet hoger was dan 45 °C, totdat een concentraat dat overeenkwam met een uiteindelijke voorraadconcentratie van 1,98 g/mL was verkregen (hoogdosisvoorraad). Middel- en laagdosis-werkoplossingen van 0,99 g/mL en 0,50 g/mL werden bereid door verdunning met steriel gedeïoniseerd water tot uiteindelijke volumes van elk 100 mL. Elke oplossing werd onder steriele omstandigheden door een membraan van 0,22 μm geleid, in gelabelde steriele containers gedoseerd en tot zeven dagen opgeslagen bij 4 °C. Voor gebruik werden de oplossingen voorzichtig gemengd; Een acceptabel uiterlijk was helder tot licht opaalachtig zonder zichtbare deeltjes.

4. UPLC - MS/MS-analyse van DBE

Het poeder van elk medicinaal bestanddeel werd nauwkeurig gewogen op 50 mg en extraherd met 1,0 mL van 80% (v/v) methanol door ultrasone agitatie gedurende 30 minuten bij omgevingstemperatuur. Extracten werden na sonicatie weer op kamertemperatuur gebracht, gecentrifugeerd bij 15.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C, en supernatanten werden via 0,22 μm-membranen gefilterd in autosampler-flesjes. Chromatografische scheiding werd uitgevoerd op een kolom met omgekeerde fase (2,1 × 100 mm, 1,8 μm; polair endcaped C18-type) die op 35 °C werd gehouden; kolommerk/model en catalogusnummer zijn vermeld in de Materiaallijst. Mobiele fase A: 0,1% mierenzuur in water; Mobiele fase B: acetonitril. Debiet: 0,30 mL/min; injectievolume: 10 μL. Gradiënt: 5% B voor 0-2 minuten; 5→95% B van 2-20 minuten; 95% B voor 20-23 minuten; 95→5% B van 23,0-23,1 min; her-equilibreer bij 5% B tot 26 min (volledige gradiënttabel is weergegeven in Tabel 1).

Massaspectrometrie gebruikte elektrospray-ionisatie met positieve/negatieve schakeling en data-onafhankelijke acquisitie met lage- en hoge-energie (MSE) scans. Massabereik: m/z 100-1.500; capillaire spanning: 2,0 kV; bemonsteringskegel: 20 V; brontemperatuur: 120 °C; desolvatietemperatuur: 360 °C; kegelgas: 50 L/u; desolvatiegas: 600 L/h. Met een hoge energiefunctie werd een getrapte botsingsenergie van 20-50 eV gebruikt. De gegevens werden verwerkt in MassLynx v4.2 met lock-mass correctie en standaard piekdetectieparameters. Een uitgebreide lijst van 105 geïdentificeerde componenten (moleculaire formules, waargenomen m/z, retentietijden en betrouwbaarheidsscores) wordt gegeven in Aanvullende Tabel 1.

5. Moleculaire koppeling

Koppelen vond plaats in AutoDock 4.2 onder een inductie-fit protocol. De driedimensionale structuur van S100β (PDB 3HCM) werd voorbereid door kristallografische watermoleculen te verwijderen, polaire waterstoffen toe te voegen en Kollman-ladingen toe te wijzen. Ligandstructuren die karakteristieke DBE-bestanddelen vertegenwoordigen, werden gebouwd, geprotoneerd bij fysiologische pH en energiegeminimaliseerd. De bindingsplaats werd gedefinieerd door de inheemse-ligandcoördinaten; aminozuurresiduen binnen 6 Å van de native ligand werden tijdens het koppelen als flexibel behandeld. Rastervakken omvatten de hele pocket met een rasterafstand van 0,375 Å. Lamarckiaanse genetische algoritmeparameters waren: populatiegrootte 150; tot 2,5 × 10⁶ energie-evaluaties; 100 onafhankelijke runs per ligand. Eindhoudingen werden gerangschikt op voorspelde bindingsvrije energie en geclusterd door RMSD; interactiepatronen (waterstofbruggen, hydrofobe contacten, π-π interacties) werden gevisualiseerd voor consistentie met bekende S100β-complexen.

6. Diermodel van door DSS geïnduceerde colitis en DBE-behandeling

Mannelijke C57BL/6J muizen (8 weken, 20-22 g) werden minstens 7 dagen geacclimeerd bij 22 ± 2 °C, 50%-60% relatieve luchtvochtigheid, een licht-donker cyclus van 12 uur, met voedsel en water ad libitum. Dieren werden willekeurig ingedeeld in zes groepen (n = 10/groep): controle, dextran sulfaat natrium (DSS) model, sulfasalazine (SASP) positieve controle, en laag-, middel- en hoge doses DBE-behandelingen. Personeel dat verantwoordelijk was voor histologische scoring en beeldkwantificatie was blind voor groepstoewijzing.

Experimentele colitis werd veroorzaakt door 2,0% (met v/v) DSS in drinkwater gedurende 7 dagen, gevolgd door 1,0% DSS gedurende 3 dagen, gevolgd door regulier water gedurende 4 dagen voorafgaand aan euthanasie. DBE werd eenmaal dagelijks toegediend met klysma van 10 mL/kg met een flexibele katheter die 2,5 cm in het rectum werd ingebracht; Dieren werden 30 minuten verticaal vastgehouden om lekkage te minimaliseren. Dagelijkse DBE-doses waren respectievelijk 12,35, 27,4 en 49,4 g/kg/dag voor de lage, middelmatige en hoge groepen; SASP werd toegediend met 0,5 g/kg/dag als positieve controle. Lichaamsgewicht, ontlastingsconsistentie en occult bloed uit ontlasting werden dagelijks geregistreerd om de ziekte-activiteitsindex te berekenen. Aan het eindpunt werden muizen verdoofd met pentobarbital natrium 50 mg/kg i.p.; Bloed werd afgenomen uit de retro-orbitale sinus met behulp van hepariniseerde haarvaten; Dieren werden geëuthanaseerd door cervicale ontwrichting. De dikke darm werd verwijderd van de ileocecale verbinding naar het rectum, voorzichtig verlengd, en de lengte werd gemeten onder minimale spanning. Representatieve segmenten waren vastgesteld in 4% paraformaldehyde; het resterende weefsel werd ingevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij −80 °C.

7. Bereiding van serum dat medicijn bevat

Mannelijke Sprague-Dawley-ratten werden gerandomiseerd in controle- en DBE-groepen (n = 6/groep). De DBE-groep kreeg 12,34 g/kg/dag via orale gavage, eenmaal dagelijks gedurende 7 dagen; De controles ontvingen gelijke hoeveelheden gezuiverd water. Vierentwintig uur na de laatste dosis werden de dieren verdoofd en werd volbloed uit de abdominale aorta verzameld. Serum werd na 30 minuten stolling bij kamertemperatuur gescheiden, gevolgd door centrifugatie bij 1.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Sera werden bij 56 °C gedurende 30 minuten hitte-geïnactiveerd en onder steriele omstandigheden door membranen van 0,22 μm gefilterd voordat ze werden opgeslagen. Serum werd in steriele buizen gealiquoteerd en opgeslagen bij −80 °C. Gehemolyseerde monsters, geïdentificeerd door verhoogde absorptie rond 414 nm, werden uitgesloten.

8. Histologisch onderzoek (H&E)

Darmweefsel vastgelegd in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur werd gedehydrateerd via gegradueerde ethanolen, vrijgemaakt in xyleen en ingebed in paraffine. Secties (5 μm) werden gesneden, gedeparaffiniseerd, gerehydrateerd en 5 minuten gekleurd met hematoxyline, 5 minuten geblauwd in stromend water en 2 minuten gekleurd met eosine. De preparaten werden met hars gemonteerd en onderzocht op cryptarchitectuur, bekerceldichtheid, epitheelcontinuïteit en ontstekingsinfiltratie. Representatieve wijzigingen worden aangegeven met pijlen/pijlpunten en gedefinieerd in de figuurinscripties; Schaalbalken (bijv. 200 μm) en vooraf gedefinieerde visuele drempels worden in de legendes gespecificeerd.

9. Immunohistochemie (IHC)

Paraffinesecties werden 15-20 minuten bij 95-98 °C afgekoeld in citratbuffer (pH 6,0), 10 minuten afgekoeld met 3% waterstofperoxide, en 10 minuten geblokkeerd met 5% normaal serum bij kamertemperatuur. Primaire antilichamen werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C in een bevochtigde kamer. Na het wassen werden secties verwerkt met een streptavidin-peroxidase-detectiesysteem, ontwikkeld met DAB voor 2 minuten (microscopische monitoring), tegengekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd en gemonteerd. Negatieve controles zonder het primaire antilichaam werden in elke batch opgenomen.

10. Immunofluorescentie (IF) analyse

Paraffine-ingebedde secties werden gedeparaffiniseerd en onderworpen aan antigeenwinning in een EDTA-buffer (pH 8,0). Na afkoeling werd de niet-specifieke binding geblokkeerd met 3% runderserumalbumine gedurende 1 uur op kamertemperatuur. Secties werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen GFAP (1:500) en S100β (1:200), gevolgd door fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:500) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. Kernen werden tegengekleurd met DAPI en de glaasjes werden gemonteerd in antifade-medium. Beelden werden vastgelegd met identieke objectieven, een vaste belichtingstijd van 100 ms en een detectorversterking van 1,0 over groepen. De gemiddelde fluorescentieintensiteit werd gekwantificeerd in ImageJ/Fiji v1.53 na kalibratie van pixelgrootte, achtergrondaftrekking (rolling-ball radius 50 pixels) en normalisatie naar DAPI-positief gebied. Er werden minstens vijf biologische replicaten per groep en drie niet-overlappende velden per replicate geanalyseerd.

11. Celkweek en behandelingen

Enterische gliale ratten (aanduiding CRL-2690) werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% foetaal rundserum en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂. De celidentiteit werd bevestigd door korte tandemherhalingsprofilering en de culturen waren vrij van mycoplasma. Experimenten werden uitgevoerd bij passages 5-15. Cellen werden gezaaid in 6-wellplaten met 2,0 × 10⁵ cellen/put in 2,0 mL/well medium en mochten 24 uur hechten. Experimentele groepen waren: onbehandelde controle, voertuigcontrole, model, DBE-serum en inhibitor.

Voor modelinductie werden cellen blootgesteld aan lipopolysaccharide (LPS, 1 μg/mL) plus IFN-γ (20 ng/mL) gedurende 24 uur in volledig medium; de overeenkomstige U/mL-waarde voor IFN-γ wordt gerapporteerd in de Materiaaltabel volgens lot-specifieke potentie. Voor DBE-serumbehandeling kregen cellen 15% (v/v) hitte-geïnactiveerd (56 °C, 30 min), 0,22 μm gefilterd DBE-bevattend rattenserum in volledig medium gedurende 24 uur (dosisbereik 5%-20% wordt gebruikt voor levensvatbaarheidsoptimalisatie zoals gespecificeerd in het CCK-8 gedeelte). Voor de behandeling met de inhibitor werd de selectieve S100β-remmer SBI-4211 (10-50 μM; 45 μM voor belangrijke metingen) 24 uur toegediend. Voertuigcontroles matchten oplosmiddelinhoud (0,1% DMSO (v/v)) met verder identieke medium. Tenzij anders vermeld, werden behandelingen bereid in voorverwarmd medium (37 °C) en werden de cellen 2× gespoeld met PBS voordat de behandeling werd vervangen. Na behandeling werden cellen verzameld voor RNA-extractie, eiwitanalyse en immunofluorescentie, zoals beschreven in latere secties. Biologische replicatie bestond uit n ≥ 5 onafhankelijke culturen per conditie.

12. CCK-8 cellevensvatbaarheidstest

Cellen werden gezaaid in 96-wellplaten met 5 × 10³ cellen/put in een medium van 100 μL en lieten ze 's nachts hechten. Medium werd vervangen door medium met DBE-behandeld serum op 5%, 10%, 15% of 20% (v/v) gedurende 24 uur. CCK-8 reagens (10 μL/put) werd toegevoegd en platen werden 1 uur geïncubeerd bij 37 °C. De absorptie werd gemeten op 450 nm met blanke subtractie (medium + reagens, geen cellen). De levensvatbaarheid werd uitgedrukt als percentage van de voertuigcontrole. Elke aandoening gebruikte n ≥ 5 biologische replicaten (onafhankelijke culturen) met drie technische replicaten per kweek.

13. ELISA voor weefselcytokines

Colonweefsel werd gehomogeniseerd op ijs in PBS (1:9, w/v) die proteaseremmers bevatte. Homogenaten werden geklarificeerd met 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C; Supernatanten werden volgens de kitprotocollen getest op IL-1β en TNF-α. Standaarden en samples werden dubbel uitgevoerd, en krommen werden uitgerust met een vier-parameter logistisch (4PL) model met R² ≥ 0,99; terugberekende standaarden werden geaccepteerd binnen 85%-115% van nominaal. De absorptie werd gemeten op 450 nm met een referentie van 620-650 nm wanneer beschikbaar. De cytokineconcentraties werden genormaliseerd op weefselgewicht (pg/mg weefsel). Elke groep bevatte n ≥ 5 biologische replicaten.

14. Kwantitatieve Real-Time PCR (qPCR)

Totaal RNA uit het colonweefsel (of cellen, indien van toepassing) werd geïsoleerd met een silica-membraan spinkolomkit. De integriteit van RNA werd geverifieerd door A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1 en agarose-gel inspectie. Eerstestreng cDNA werd gesynthetiseerd uit 1 μg RNA met genomische DNA-verwijdering. qPCR gebruikte SYBR Green mastermix op een gekalibreerde thermocycler met het programma: 95 °C 30 s; 40 cycli van 95 °C 5 s, 60 °C 30 s; smeltcurve 65-95 °C in stappen van 0,5 °C/5 s. GAPDH diende als de endogene controle. Relatieve expressie werd berekend met 2⁻ΔΔCt na verificatie van primer-efficiënties (90%-110%, van standaardcurve-hellingen). Geen RT- en geen template-besturing waren inbegrepen. Primerreeksen zijn vermeld in Tabel 2. Elke groep had n ≥ 5 biologische replicaten en twee technische herhalingen per monster.

15. Western blot-analyse

Eiwitten uit het darmweefsel (of cellen) werden in de RIPA-buffer geëxtraheerd met protease/fosfataseremmers en gekwantificeerd met een BCA-assay. Gelijk eiwit (30 μg/baan) werd gedenatureerd, opgelost op 4-20% gradiënt SDS-PAGE, en overgedragen aan PVDF (0,45 μm; 0,2 μm voor ≤ 20 kDa-doelen). Membranen werden 2 uur lang geblokkeerd in 5% magere melk bij kamertemperatuur en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen GFAP (1:1.000), S100β (1:1.000), iNOS (1:1.000), NF-κB p65 (1:1.000), fosfo-NF-κB p65 (Ser536, 1:1.000), Occludin (1:1.000), Claudin-1 (1:1.000) en GAPDH (1:5.000). HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5.000) werden 1 uur bij kamertemperatuur aangebracht. Signalen werden ontwikkeld met ECL; De belichtingstijden waren beperkt tot het lineaire dynamisch bereik (10-90 seconden). Overdrachten werden geverifieerd door reversibele membraankleuring voorafgaand aan blokkering. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd in ImageJ/Fiji v1.53 na achtergrondaftrekking en genormaliseerd tot GAPDH. Verwachte molecuulgewichten: GFAP ~49 kDa, S100β ~10-12 kDa, NF-κB p65 ~65 kDa, iNOS ~130 kDa, Occludin ~65 kDa, Claudin-1 ~22 kDa, GAPDH ~36-37 kDa. Elke analyse bevatte n ≥ 5 biologische replicaten.

16. Statistische analyse

De gegevens werden geanalyseerd in GraphPad Prism 8.0 en worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Voor meervoudige groepsvergelijkingen werd eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post hoc-test gebruikt; voor paargewijze vergelijkingen werden ongepaarde, tweezijdige Student's t-tests toegepast wanneer passend. Voor tijdverloop- of tweefactorontwerpen (bijvoorbeeld behandeling × dosis of behandeling × tijd) werd tweerichtings-ANOVA (herhaalde metingen indien van toepassing) gebruikt met correctie van Tukey of Dunnett zoals gespecificeerd in de figuurlegendes. De tests van Shapiro-Wilk en Levene werden gebruikt om normaliteit en homoscedasticiteit te onderzoeken voorafgaand aan parametrisch testen; wanneer aannames werden geschonden, werden gegevens log-getransformeerd of geanalyseerd met passende niet-parametrische tests (Kruskal-Wallis met Dunns post hoc; Mann-Whitney U voor paargewijze). Exacte p-waarden en effectgroottemetingen (η² voor ANOVA, Cohen's d voor t-tests) worden waar van toepassing in figuurlegendes weergegeven. Een tweezijdige p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Figuurlegendes gebruiken de volgende notatie voor significantie: *p<0,05, **p<0,01, *** p<0,001 vs Control; # p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 vs DSS; NS, niet significant.

17. Verwachte resultaten en kwaliteitscontrole

Van DSS wordt verwacht dat het de lengte van de dikke darm verkort, de ziekte-activiteitsindex verhoogt en histologische schade veroorzaakt (crypt architecturale vervorming, uitputting van bekercellen, epitheelerosie). DBE-behandeling zou dosisafhankelijk deze indices moeten verbeteren en de enterisch-gliale activatiemarkers verlagen. Westerse blots zouden banden moeten tonen bij de hierboven genoemde molecuulgewichten, met verhoogde signalen in DSS en demping met DBE of SBI-4211; belichtingen moeten binnen het lineaire dynamisch bereik blijven. Immunofluorescentie voor GFAP en S100β zou verhoogde gemiddelde intensiteiten in DSS moeten laten zien en een vermindering na DBE-behandeling. LC-MS/MS-chromatogrammen moeten stabiele retentietijden (drift ≤ 0,2 min) en massanauwkeurigheden binnen ± 5 ppm voor referentie-ionen vertonen, met karakteristieke fragmentionen voor belangrijke bestanddelen. Negatieve controles (bijv. het ontbreken van primaire antilichamen) zouden geen specifiek signaal moeten opleveren. Beeldvormingsparameters (objectief, belichting, versterking, gamma) moeten tussen groepen constant blijven om geldige kwantitatieve vergelijkingen mogelijk te maken.

18. Probleemoplossingsnotities

Troebelheid of deeltjes in DBE-oplossingen wijzen op onvoldoende filtratie of neerslag; Herhaal de 0,22 μm filtratie en bevestig pH 6,5-7,5. Overmatige sterfte of ernstig gewichtsverlies tijdens blootstelling aan DSS wijst op overinductie; verlaag de concentratie van DSS, controleer het batchmolecuulgewicht en vervang dagelijks DSS-oplossingen. Inconsistente kwantificatie van immunofluorescentie weerspiegelt doorgaans variabele blootstelling; Stel de belichtingstijd en versterking vast, en voeg een referentieslide toe voor batchkalibratie. Zwakke western-blot banden kunnen onderbelasting of overdrachtsinefficiëntie weerspiegelen; Controleer de kwantificatie van eiwitten, selecteer het juiste gelpercentage of -gradiënt en bevestig de overdracht door reversibele membraankleuring. Slechte ELISA-fit (R² < 0,99 of standaard terugberekening buiten 85-115%) rechtvaardigt het herhalen van de standaardcurve en het opnieuw analyseren van verdunde monsters. Voor qPCR wordt uitgevoerd met primer-efficiëntie buiten 90-110%, optimaliseer opnieuw de annealingtemperatuur of primerconcentratie vóór analyse.

Resultaten

Identificatie van DBE-componenten en geneesmiddelhoudend serum

LC-MS/MS identificeerde 105 unieke chemische bestanddelen in DBE, met een massafout < 10 ppm. De identificatie werd bevestigd door moleculaire formule, isotooppatroon en fragmentmatching. Belangrijke klassen waren onder andere triterpenen, flavonoïden, bifenantrenen en organische zuren. Medicijnhoudend serum toonde 59 DBE-afgeleide componenten na ...

Discussie

Colitis ulcerosa (UC) is een chronische inflammatoire darmziekte met multifactoriële pathogenese. Naast gestoorde immuunresponsen zijn dysfunctie van de intestinale epitheelbarrière en dysbiose van de darmmicrobiota algemeen erkende oorzaken, terwijl afwijkingen van het enterisch zenuwstelsel (ENS) steeds vaker worden geïdentificeerd als een belangrijke drijfveer in de progressie van UC²³. Specifiek kunnen zowel structurele als functionele disregulatie van de ENS ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
AutoDock 4.2	Moleculair docking software	-	The Scripps Research Institute
Dextran Sulfaat Natrium (DSS)	Chemisch product voor het induceren van colitis bij muizen	9011-18-1	Sigma-Aldrich
Dibai Klysma Vloeistof (DBE)	Kruidenmix voor de behandeling van colitis ulcerosa	-	Beijing University of Chinese Medicine
DMEM (Dulbecco's Gemodificeerd Arendsmiddel)	Celkweekmedium	11965-092	Thermo Fisher
Fetaal Rundserum (FBS)	Supplement voor celkweek	16000-044	Thermo Fisher
Fluorescentiemicroscoop	Instrument voor immunofluorescence beeldvorming	-	Olympus
LC-MS/MS Systeem	Massaspectrometer voor LC-MS analyse	-	Waters Corporation
Lipopolysaccharide (LPS)	Inductor van ontsteking in celkweek	L2630	Sigma-Aldrich
PCR Thermocycler	Apparatuur voor qPCR	T100	Bio-Rad
Primaire Antilichaam (S100)	Antilichaam voor S100-eiwitdetectie	ABC1234	Abcam
Eiwit Assay Kit (BCA)	Eiwit kwantificeringskit	23225	Thermo Fisher
Recombinant Interferon- (IFN)	Cytokine voor EGC activatie in celkweek	-	Sigma-Aldrich
Secundair Antilichaam (HRP-geconjugeerd)	Secundair antilichaam voor immunohistologie	XYZ5678	Thermo Fisher
Sulfasalazine (SASP)	Positieve controle voor colitis ulcerosa	-	Sigma-Aldrich
Western Blot Apparatuur	Elektroforesesysteem voor eiwitanalyse	-	Bio-Rad