Method Article

Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2)

DOI:

10.3791/69588

⸱

December 19th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein College of Medicine, 2SCIENION, 3Department of Chemical, Life and Environmental Sustainability Sciences, University of Parma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om single-cell histon posttranslationele modificatieanalyse te automatiseren met behulp van een isotopische twee-plex labelingstrategie en ArgC-digestie. Deze workflow maakt kwantitatieve, reproduceerbare en hooggevoelige profilering van chromatine-heterogeniteit en epigenetische responsen bij enkelcelresolutie mogelijk.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histon posttranslationele modificaties (hPTM's) zijn centrale regulatoren van chromatineorganisatie en genexpressie. Hun ontregeling wordt in verband gebracht met ontwikkeling, kanker en veroudering. Hoewel massaspectrometrie de voorkeursmethode is om hPTM's te bestuderen, zijn de meeste protocollen ontworpen voor bulkmonsters en kunnen ze cel-tot-cel variabiliteit niet oplossen. Het uitbreiden van histon-PTM-analyse naar het enkelcelniveau is daarom essentieel maar technisch uitdagend, omdat histonen laag in aantallen, rijk aan lysine zijn en sterk gemodificeerd.

Hier beschrijven we een geautomatiseerde single-cell proteomics-workflow voor histon-PTM-analyse met behulp van nanovloeistofbehandeling. Het systeem maakt nanoliter-schaal verwerking van individuele cellen mogelijk met minimale behandeling en hoge reproduceerbaarheid. De workflow omvat de vertering met ArgC Ultra-protease, die arginineresiduen klijvt en de noodzaak van lysineblokkerende derivatisatiestappen, die typisch zijn bij histonproteomics, vermijden. Om kwantitatieve vergelijkingen tussen aandoeningen mogelijk te maken, passen we een twee-plex labelingsstrategie toe met propionanhydride en zijn deutere analoog propionanhydride-d10. Deze combinatie van geautomatiseerde monstervoorbereiding, isotopenmultiplexing en ArgC Ultra-digestie resulteert in een gestroomlijnd en gevoelig protocol voor single-cell histon PTM-analyse.

De methode maakt het mogelijk om chromatine-heterogeniteit en de effecten van epigenetische verstoringen bij enkelcelresolutie te onderzoeken. Om de workflow te demonstreren, genereerden we sferoïden uit HepG2/C3A hepatocellulaire carcinoomcellen en behandelden deze met natriumbutyraat, een histondeacetylase-remmer die hyperacetylatie induceert.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histonen zijn de eiwitcomponenten van nucleosomen, de herhalende eenheden van chromatine. Hun N-terminale staarten zijn rijk aan lysine- en arginineresiduen en worden sterk gereguleerd door posttranslationele modificaties (PTM's), zoals acetylering, methylering en fosforylering. Deze modificaties beïnvloeden de toegankelijkheid van DNA en controleren daarmee processen zoals transcriptie, replicatie en reparatie. Veranderde histon PTM-patronen zijn sterk geassocieerd met ziektetoestanden, van kanker tot neurodegeneratie en veroudering 1,2. Om deze reden is histon-PTM-analyse va....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Buffers en reagentia

  1. Celgroeimedia voor HepG2/C3A-cellen: Bereid Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, 4,5g/L glucose) voor met 10% foetaal runderenserum (FBS), niet-essentiële aminozuren (1% v/v), L-glutamine (1% v/v) en penicilline/streptomycine (0,5% v/v). Groeimedium wordt opgeslagen bij 4 °C.
  2. Mastermix: Bereid ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n -dodecyl-β-D-maltoside (DDM) 0,03%, Dithiothreitol (DTT) 10 mM in LC-MS water.
  3. HA-oplossing: Bereid 1% (v/v) hydroxylamine voor in water van LC-MS-kwaliteit.
  4. Wasoplossing: Maak 10 mL van een 50:50 acetonitril/watermengsel me....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de toepassing van onze single-cell histon proteomics-workflow met ons systeem te demonstreren, analyseerden we sferoïden van HepG2/C3A-cellen behandeld met 5 mM natriumbutyraat gedurende 24 uur. Na LC-MS/MS-verwerving werden ruwe gegevens verwerkt met EpiProfile voor zowel lichte (propionanhydride) als zware (propionaanhydride-d10) labeling, waarbij genormaliseerde gegevens werden verkregen die de hoeveelheden peptiden en histonmarkeringen weergeven. Het QuantQC R-pakket werd vervolge.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om histon posttranslationele modificaties op enkelcelniveau te meten, vormt een cruciale stap richting het begrijpen van de werkelijke heterogeniteit van chromatineregulatie. Traditionele bulkmethoden hebben onschatbare inzichten opgeleverd in de gemiddelde verdeling van hPTM's over weefsels, maar maskeren toch cel-tot-cel variabiliteit die steeds meer wordt erkend als biologisch betekenisvol5. Enkelcellige proteomische benaderingen stellen ons nu in .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C. is werknemer van SCIENION US Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen Dr. Bernice Morrow en Dr. Jidong Shan in de Molecular Cytogenetics Core van het Albert Einstein College of Medicine voor het onderhoud van het cellenONE-instrument.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesBio-Rad2239480
1000 µL wide bore pipet tipsFisher Scientific14222703
200 µL wide bore pipet tipsFisher Scientific14222730
384 well PCR plate Lo Bind Eppendorf30129547
96-well vacuum manifoldMilliporeMAVM0960R
Acetonitrile, Optima LC-MS/MS gradeFisher ScientificA955-1
Adhesive PCR plate foilsThermo FisherAB0626
Anhydrous AcetonitrileFisher ScientificAA42311AKLabels stock solution for bulk
Arg-C Ultra, Mass Spec GradePromegaVA1831
Cell culture grade waterCorning25-055-CV
CellenVIALsSCIENION/Catalog number comes with a quote
DMSO, AnhydrousThermo FisherD12345Labels stock solution
DTTSigmaD0632-5G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Fisher ScientificMT17205CV
Fetal Bovine SerumFisher ScientificMT35010CV
Formic acidThermo28905
Formic acid 98%–100% for LC-MS LiChropurSigma5330020050
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Fisher ScientificMT21022CV
HEPES (Ultra Pure)Thermo Fisher11344041
HPLC grade acetonitrileFisher ScientificA955-4
HPLC grade waterFisher ScientificW5-4
Hydroxylamine solution 50 wt. % in H2OSigma438227-50ML
L-glutamineFisher ScientificMT25015CI
n-Dodecyl-beta-Maltoside (DDM) DetergentFisher ScientificBN2005
Non-essential amino acidsFisher ScientificMT25025CI
Orbitrap Exploris 480 Mass SpectrometerThermo FisherBRE725539
Paraformaldehyde 16% Aqueous Solution EM GradeElectron Microscopy Sciences15710-S
PDC-CM (type 2 coating)SCIENION/Catalog number comes with a quote
Penicillin-StreptomycinFisher ScientificMT3002CI
Phosphate-buffered saline (PBS),10x, pH 7.4, RNase-freeThermo FisherAM9625
Pierce Dimethylsulfoxide (DMSO), LC-MS GradeThermo Fisher85190
Pipette gunEppendorfZ666467 (Milipore Sigma)
Propionic anhydride ≥99%Sigma240311-50G
Propionic anhydride-d10 ≥98 atom % D, ≥99% (CP)Sigma615692-1G
Refrigerated centrifugeThermo75-217-420
SciCHIP H1 coated glass slidesSCIENION/Catalog number comes with a quote
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)Thermo15308325Savant SPD1010
Sterile hoodThermo1375
Sterile serological pipettesFisher Scientific1367549
SYTOX Green Dead Cell Stain, for flow cytometryThermo FisherS34860
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol redThermo Fisher12604013
VortexSigmaZ258415
Water bathFisher ScientificFSGPD10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).
  2. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  3. Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell ProteomicsHistone ModificationsAutomated Sample PreparationMultiplex LabelingChromatin HeterogeneityMass SpectrometryArgC Ultra DigestionSpheroid AnalysisHigh Throughput WorkflowEpigenetic Perturbations

Related Articles