Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2)

Summary

Hier presenteren we een protocol om single-cell histon posttranslationele modificatieanalyse te automatiseren met behulp van een isotopische twee-plex labelingstrategie en ArgC-digestie. Deze workflow maakt kwantitatieve, reproduceerbare en hooggevoelige profilering van chromatine-heterogeniteit en epigenetische responsen bij enkelcelresolutie mogelijk.

Abstract

Histon posttranslationele modificaties (hPTM's) zijn centrale regulatoren van chromatineorganisatie en genexpressie. Hun ontregeling wordt in verband gebracht met ontwikkeling, kanker en veroudering. Hoewel massaspectrometrie de voorkeursmethode is om hPTM's te bestuderen, zijn de meeste protocollen ontworpen voor bulkmonsters en kunnen ze cel-tot-cel variabiliteit niet oplossen. Het uitbreiden van histon-PTM-analyse naar het enkelcelniveau is daarom essentieel maar technisch uitdagend, omdat histonen laag in aantallen, rijk aan lysine zijn en sterk gemodificeerd.

Hier beschrijven we een geautomatiseerde single-cell proteomics-workflow voor histon-PTM-analyse met behulp van nanovloeistofbehandeling. Het systeem maakt nanoliter-schaal verwerking van individuele cellen mogelijk met minimale behandeling en hoge reproduceerbaarheid. De workflow omvat de vertering met ArgC Ultra-protease, die arginineresiduen klijvt en de noodzaak van lysineblokkerende derivatisatiestappen, die typisch zijn bij histonproteomics, vermijden. Om kwantitatieve vergelijkingen tussen aandoeningen mogelijk te maken, passen we een twee-plex labelingsstrategie toe met propionanhydride en zijn deutere analoog propionanhydride-d10. Deze combinatie van geautomatiseerde monstervoorbereiding, isotopenmultiplexing en ArgC Ultra-digestie resulteert in een gestroomlijnd en gevoelig protocol voor single-cell histon PTM-analyse.

De methode maakt het mogelijk om chromatine-heterogeniteit en de effecten van epigenetische verstoringen bij enkelcelresolutie te onderzoeken. Om de workflow te demonstreren, genereerden we sferoïden uit HepG2/C3A hepatocellulaire carcinoomcellen en behandelden deze met natriumbutyraat, een histondeacetylase-remmer die hyperacetylatie induceert.

Introduction

Histonen zijn de eiwitcomponenten van nucleosomen, de herhalende eenheden van chromatine. Hun N-terminale staarten zijn rijk aan lysine- en arginineresiduen en worden sterk gereguleerd door posttranslationele modificaties (PTM's), zoals acetylering, methylering en fosforylering. Deze modificaties beïnvloeden de toegankelijkheid van DNA en controleren daarmee processen zoals transcriptie, replicatie en reparatie. Veranderde histon PTM-patronen zijn sterk geassocieerd met ziektetoestanden, van kanker tot neurodegeneratie en veroudering ^1,2. Om deze reden is histon-PTM-analyse van grote interesse geworden in epigenetica- en proteomicaonderzoek. Massaspectrometrie (MS) biedt locatie-specifieke en kwantitatieve analyse van histonmodificaties, maar histonen brengen unieke analytische uitdagingen met zich mee. Hun aminozuursamenstelling, meerdere modieplaatsen en complexe combinatorische patronen maken ze moeilijker te analyseren dan typische eiwitten. Gevestigde protocollen vertrouwen op chemische derivatisatie om lysineresiduen vóór de vertering te blokkeren, waardoor het peptideherstel en de chromatografische prestaties verbeteren³. Hoewel effectief in bulkanalyses, kunnen deze meerstapsderivatisatieprotocollen verliezen veroorzaken die problematisch zijn voor single-cell inputs. Single-cell analyse wordt steeds belangrijker omdat biologische systemen van nature heterogeen zijn. Bulk histon analyseert gemiddelde signalen over veel cellen en slaagt er daardoor niet in deze variabiliteit te vatten. Subpopulaties van cellen kunnen verschillen in hun chromatinetoestanden, en deze verschillen kunnen de ontwikkeling, cellulaire herprogrammering of medicijnresponsen^{aansturen 4,5}.

Hier presenteren we een geautomatiseerde monstervoorbereidingsmethode voor de gemultiplexeerde single-cell histon PTM-analyse (sc-hPTM2). Deze methode maakt gebruik van het CellenONE-systeem, dat het mogelijk maakt om individuele cellen en nanoliter-reagentia op een geautomatiseerde manier te doseren. Deze methode is een variant op de nanoproteomische monstervoorbereiding (nPOP)-methode, die voor het eerst het gebruik van druppelvoorbereiding op een glazen preparaat⁶ introduceerde. Het nPOP-platform heeft geavanceerde geautomatiseerde single-cell proteomics, maar het standaard tryptische verteringsprotocol is suboptimaal voor histonen vanwege hun hoge lysinegehalte en uitgebreide modificatiedichtheid. Hier pasten we het CellenONE-systeem aan om de goudstandaard histonderivatisatie te combineren met propionaanhydride en introduceerden we isotopische labeling, waardoor een nauwkeurige en uitgebreide kwantificering van histon post-translationele modificaties bij enkelcelresolutie mogelijk werd. Specifiek vereenvoudigen we het protocol door ArgC Ultra-protease te gebruiken voor eiwitvertering. In tegenstelling tot trypsine splitst ArgC alleen bij arginineresiduen en vereist geen lysineblokkade. Dit elimineert de noodzaak van een tweestapsderivatisatiestrategie, waardoor het protocol wordt gestroomlijnd. Daarnaast bevat de methode een twee-plex isotopenlabelsysteem met propionanhydride en propionanhydride-d10, waardoor twee cellen gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd ^7,3. Na de vertering en etikettering worden enkelcelmonsters teruggewonnen en geanalyseerd met vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS)/MS met behulp van data-onafhankelijke verzameling (DIA). In onze handen is aangetoond dat deze methode zowel de gevoeligheid als de reproduceerbaarheid voor de kwantificering van histon-PTM's verhoogt vergeleken met de vorige versie van deze methode⁸.

Om de methode te demonstreren, hebben we de PTM-dynamica van enkelcelige histon geprofileerd in sferoïden afkomstig van HepG2/C3A hepatocellulaire carcinoomcellen. We behandelden deze sferoïden met natriumbutyraat, een goed gekarakteriseerde histondeacetylase-remmer die de histonacetylatie verhoogt en dient als benchmark voor het onderzoeken van chromatineregulatie ^9,10. Door controle- en natriumbutyraatbehandelde sferoïden op single-cel resolutie te vergelijken, tonen we een principebewijs van representatieve resultaten aan, waarmee we het potentieel voor bredere toepassingen in chromatinebiologie en kankerepigenetica benadrukken. Met name verwijzen we voor het protocol naar een eerdere publicatie die de groei en behandeling van 3D-sferoïden¹⁰, de verwerving van histonenpeptiden in massaspectrometrie¹¹ en data-analyse met de software EpiProfile¹² beschrijft.

Protocol

1. Buffers en reagentia

1. Celgroeimedia voor HepG2/C3A-cellen: Bereid Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, 4,5g/L glucose) voor met 10% foetaal runderenserum (FBS), niet-essentiële aminozuren (1% v/v), L-glutamine (1% v/v) en penicilline/streptomycine (0,5% v/v). Groeimedium wordt opgeslagen bij 4 °C.
2. Mastermix: Bereid ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n -dodecyl-β-D-maltoside (DDM) 0,03%, Dithiothreitol (DTT) 10 mM in LC-MS water.
3. HA-oplossing: Bereid 1% (v/v) hydroxylamine voor in water van LC-MS-kwaliteit.
4. Wasoplossing: Maak 10 mL van een 50:50 acetonitril/watermengsel met 0,1% (w/w) mierenzuur (alle LC-MS-kwaliteit).
5. Mobiele Fase A (MPA) - 0,1% mierenzuur: Voeg 1 mL geconcentreerd mierenzuur toe aan 999 mL HPLC-kwaliteitswater en meng goed.
6. Mobiele Fase B (MPB) - 80% HPLC-kwaliteit acetonitril + 0,1% mierenzuur: Voeg 800 mL HPLC-kwaliteit acetonitril toe aan 199 mL HPLC-kwaliteit water. Voeg vervolgens 1 ml geconcentreerd mierenzuur toe aan deze oplossing en meng.

2. Sferoïden bereiding

1. Voor de preparaat van de sferoïden, zie Stransky S et ^al.11.
2. Kwek HepG2/C3A hepatocellulaire carcinoomcellen in een roterende driedimensionale (3D) bioreactor gedurende 5-7 dagen om de uniforme sferoïdenvorming te bevorderen totdat een diameter van ~400-600 μm wordt bereikt. Gebruik DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuren, 1% L-glutamine en 0,5% penicilline/streptomycine. Houd de sferoïden op 37 °C en 5% CO_tot de behandeling.
   OPMERKING: Figuur 1A toont de apparatuur die is gebruikt om de sferoïden in het referentieartikel te bereiden.

3. Celkweek en behandeling

1. Plaats ~10 sferoïden in een weefselcultuurplaat met 6 putten en bevat 2 ml groeimedium.
2. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator.
3. Behandel de sferoïden 24 uur met 5 mM natriumbutyraat of voeg dezelfde hoeveelheid water toe voor de controle (Figuur 1B).

4. Celisolatie en voorbereiding van single-cell suspension

1. Na 24 uur behandeling incubeer je de cellen met 1 ml trypLE bij 37 °C gedurende 3-5 minuten.
2. Pipetteer voorzichtig op en neer totdat de sferoide uit elkaar valt en er enkele cellen ontstaan.
3. Verzamel de cellen in een 15 mL buis en was, verdun tot 10 mL met ijskoude 1x PBS, centrifugeer op 500 g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en aspireer het supernatant.
4. Sussen de cellen opnieuw in 1 mL ijskoude 1x PBS en voeg Sytox groene dode celkleuring toe met een uiteindelijke concentratie van 1 μM.
5. Incubeer de cel met Sytox Green gedurende 20 minuten op ijs in een donkere omgeving.
6. Was de cel met 10 mL ijskoude 1x PBS, centrifugeer op 500 g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en aspireer het supernatant.
7. Susseer de cellen opnieuw in 1 mL ijskoude 1x PBS en voeg paraformaldehyde (PFA) toe met een uiteindelijke concentratie van 0,5%.
8. Incubeer de cel met PFA gedurende 15 minuten op ijs.
   OPMERKING: Hoewel Sytox green doorgaans niet compatibel is met fixatie vanwege membraanpermeabilisatie, blijft het aandeel Sytox groene cellen voor cellen tot 8 uur na fixatie gelijk zonder tekenen van histonproteïnelekkage.
9. Was de cel met 10 mL ijskoude 1x PBS, centrifugeer op 500 g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en aspireer het supernatant.
10. De cellen worden opnieuw samengesteld bij een uiteindelijke concentratie van 200-500 cellen/μL.
    OPMERKING: Voor kleine cellen die niet geneigd zijn af te zetten, wordt een concentratie van 500 cellen/μL aanbevolen, terwijl voor grote cellen die geneigd zijn zich af te zetten, een concentratie van 200 cellen/μL wordt aanbevolen. Als de celsuspensie gevoelig is voor aggregatie, laat deze dan door een zeef van 40 μm lopen vóór het aspireren om verstopping van de nozzle te voorkomen. Als cellen groter dan 40 μm interessant zijn en waarschijnlijk aanwezig zijn in een monster, kan in plaats daarvan een 70 μm zeef worden gebruikt om zeer grote aggregaten te verwijderen.
11. Bewaar de cellen op ijs totdat ze in het instrument worden geladen voor sortering.

5. Softwareverbinding en systeeminitialisatie

1. Zet het cellenONE-systeem in (Figuur 2A), start de besturingscomputer op, start de software en open de v2.0-nPOP2 gebruikerswerkruimte; Alle vereiste veldbestanden en uitvoeringstemplates voor nPOP zijn daar vooraf geladen.
2. Zorg ervoor dat de koeler van het instrument is ingeschakeld en stel vervolgens de dauwpunt-chasewaarde in volgens de interne temperatuur die het instrument momenteel rapporteert.
3. Prim het systeem met PDC-70, coatingtype 2 doseerspuiten (Figuur 2B) die in sleuven 1 en 3 zijn geïnstalleerd, volgens de instructies op het scherm.
4. Stel de pulsbreedte van elke nozzle en de aandrijfspanning in op de waarden die op de verpakking van de fabrikant zijn aangegeven.
   OPMERKING: Het gebruik van twee aparte nozzles behoudt de consistentie van de doseer: de ene levert de celsuspensie, de andere de reagentia, zodat eventueel vuil dat aan een nozzle blijft blijven de volgende druppels niet in gevaar brengt. Het gebruik van beide mondstukken tijdens de laatste verzamelstap versnelt ook de monsterwinning.
   1. (KRITISCHE STAP) Voor maximale opname-efficiëntie moet de z-offset tussen de twee nozzles met <50 μm verschillen. Bepaal dit door de optimale contactpositie voor elke nozzle te definiëren en de Z-hoogte uitlezingen te vergelijken in het tabblad Nozzle Setup.
5. Vul het luchtbevochtigerreservoir met gedeïoniseerd water tot aan de aangegeven vulleiding.

6. Pre-run configuratie op de vloeistofbehandelaar

1. Selecteer het aantal glazen preparaten (Figuur 2C) dat voorbereid moet worden. Deze keuze bepaalt direct het totale aantal cellen dat gepland is om te analyseren.
2. Voor een 2-plex multiplexingschema (Figuur 3A), laad een enkele slide met 320 cellen.

7. Het toedienen van een dimethylsulfoxide (DMSO) "gracht" rond de slederanden

OPMERKING: Figuur 3B toont de stappen voor het voorbereiden van de monsters in de cellenONE, beginnend bij de gracht van DMSO. Als extra preventie tegen druppelverdamping wordt DMSO langs de randen van de glaasjes toegediend.

1. Selecteer in het tabblad Hoofd de run to 0_Dispense_DMSO_Moat.
2. Ga naar het tabblad Target Setup , laad het DMSO_Moat.fld-bestand vanuit de juiste schemamap en stel het aantal velden in op Y, zodat het aantal geplande dia's wordt verwerkt.
3. Aliquot 150 μL LC-MS-klasse DMSO in een nieuwe PCR-buis en plaats deze op positie 2 van het CellenWASH-station met de buisdop naar de instrumentendeur gericht.
4. Open het tabblad Run en klik op Start Run. Het systeem zal 10 μL DMSO aspireren en pauzeren voor gebruikersbevestiging van de druppelstabiliteit. Vuur drie autodrop-testdruppels af (Figuur 4A); als alle drie perfect gevormd zijn, klik dan op Doorgaan met runnen.
5. Na het doseren spoelen de mondstukken automatisch en maakt het instrument beelden op alle slides voor kwaliteitscontrole. Bekijk de beelden om een uniforme DMSO-druppel op elke dia te verifiëren en om te controleren op ontbrekende of niet-doelwitte druppels (Figuur 4B).

8. DMSO-uitgifte

1. Selecteer in het tabblad Hoofd de run to 1_Dispense_DMSO.
2. Open het tabblad Target Setup , importeer het veldbestand DMSO.fld (Figuur 4C) uit de juiste schememap en zet Aantal velden op Y, zodat het aantal dia's dat je wilt verwerken overeenkomt.
3. Aliquot 150 μL LC-MS-klasse DMSO in een nieuwe PCR-buis en plaats deze op positie 2 van het CellenWASH-station met de buisdop naar de instrumentendeur gericht.
4. Open het tabblad Run en klik op Start Run. Het systeem zal 10 μL DMSO aspireren en pauzeren voor gebruikersbevestiging van de druppelstabiliteit. Vuur drie autodrop-testdruppels af; als alle drie perfect gevormd zijn, klik dan op Doorgaan met runnen.
5. Bij het doseren van afwerkingen spoelt de software automatisch de nozzles door en maakt beelden op elke dia, voor kwaliteitscontrole. Bekijk de beelden om een uniforme DMSO-druppel op elke dia te verifiëren en om te controleren op ontbrekende of niet-doelwitte druppels.

9. Cellule dispensatie

1. Selecteer in het tabblad Hoofd de run to 2_Dispense_Cells.
2. Open in het tabblad Target Setup de submap Cells Field Files van de gekozen multiplexing-schema map.
3. Omdat het experiment twee voorwaarden vereist, kies je het veldbestand dat overeenkomt met de steekproef die op het punt staat te sorteren – ofwel CellType_A.fld of CellType_B.fld.
4. Nadat het bestand is geladen, stel je het aantal velden in op Y, zodat het gelijk is aan het totale aantal dia's voor deze run.
5. Ontgass de celsuspensie vanaf stap 4.11 met een vacuümpomp gedurende 10 minuten op ijs.
6. Breng 150 μL van de voorbereide celsuspensie over in een schone CellenVIAL, plaats vervolgens het flesje in slot 1 van de CellenWASH-carrousel met de dop gericht naar de instrumentdeur.
7. Ga naar het tabblad Nozzle Setup > Do Task en voer Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 uit om het monster uit het buisje te aspireren.
8. Blijf in het tabblad Nozzle Setup , start de cel-dispenserende viewer (Figuur 5A) en voer de mappingroutine uit om de uitwerpzone en poortobjecten te definiëren op basis van grootte en verlenging. De isolatieparameters van één cel die in Figuur 5A worden getoond, komen overeen met de exacte instellingen die worden gebruikt voor het uitdienen van HepG2/C3A-cellen die van sferoïden zijn gedissocieerd.
9. Activeer vervolgens de fluorescentiemodus door T > F te selecteren. Stel de selectiemodus in op negatief. Verhoog het isolatieparameterbereik voor grootte en intensiteit van het minimum naar het maximum om ervoor te zorgen dat er geen dode cellen worden geïsoleerd.
10. Controleer met de mappingparameters, open het tabblad Run , klik op Start Run, volg vervolgens de softwareprompts. Bij het doseerend zal het instrument automatisch de nozzles doorspoelen en afbeeldingen van de diaplaat maken ter beoordeling van de druppelplaatsing en uniformiteit.
    OPMERKING: Tijdens celsortering worden afbeeldingen gemaakt van elke individuele cel die tijdens de run wordt geïsoleerd (Figuur 5B).
11. Nadat de celsortering is voltooid, sluit je het uitdeelvenster.
12. Houd eventuele overgebleven celsuspensie op ijs tot sectie 9 voorbij is; Het overschot kan later worden gebruikt voor bulkmonsters, empirische bibliotheekconstructie of aanvullende validatiestudies.

10. Digestie master mix doseer

1. Selecteer in het tabblad Hoofd de run to 2_Dispense_Digest_10ulPickup.
2. Open het tabblad Target Setup , laad Digest.fld vanuit de juiste multiplexing-schema-map en stel het aantal velden in op Y zodat het gelijk is aan het aantal slides voor deze run.
3. Bereid een verse digestie-mastermix voor en ontgass de oplossing met een vacuümpomp gedurende 10 minuten op ijs (Mastermix: ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0,03%, DTT 10 mM in LC-MS water).
4. Pipetteer 20 μL van de mastermix in een 384-wellplaat en plaats de plaat in het X1-systeem.
5. Klik in het tabblad Run op Start Run en volg de prompts. Nadat het systeem het reagens heeft aspireerd, controleer de druppelstabiliteit wanneer daarom wordt gevraagd.
6. Bij het doseren spoelt het instrument automatisch de mondstukken door en fotografeert elke slide; Bekijk de beelden om te verifiëren dat elke druppel de verteringsmix gelijkmatig heeft ontvangen.
7. Incubeer de glaasjes een nacht voor de vertering, waarbij je de gespecificeerde luchtvochtigheid en dauwpunten aanhoudt. Elke druppel bevat ~13,5 nL verteringsmix. Voer de vertering 's nachts uit bij ~75% relatieve luchtvochtigheid, waarbij het dauwpunt 1-2 °C onder de kamertemperatuur blijft om verdamping van druppels te voorkomen.

11. Incubatie 's nachts

1. Kies in het tabblad Hoofd de run to 4_Incubation_16h.
2. Schakel over naar het tabblad Run , klik op Start Run.
   OPMERKING: De instrumenten maken elke 30 minuten foto's van de preparaten om de staat van de druppels te monitoren. Als ze uitdrogen of zwellen tijdens de incubatie, pas dan de dauwpuntinstelling aan indien nodig.
3. Wanneer de incubatie is afgerond, verschijnt er een bericht dat de incubatie is voltooid.
   OPMERKING: Snelle verterings (≤4 uur) kunnen mogelijk zijn met een hogere effectieve enzym-naar-substraat condities; Dit is hier niet geëvalueerd, dus de gevalideerde voorwaarde blijft 16 uur.

12. Verdamping

OPMERKING: Voordat we overgaan naar de etiketteringsstap, wordt aanbevolen om de staat van de druppels te controleren om te controleren of ze niet te veel gezwollen zijn door water, omdat water de efficiëntie van het labelen kan verstoren. Hiervoor wordt de verdampingsfase aanbevolen.

1. Kies in het tabblad Hoofd de run to 5_Evaporation.
2. Ga naar Bestand, Koelunit Regeling, en stel onder de Dauwpuntregeling de vaste regeltemperatuur in op 23 °C.
3. Schakel over naar het tabblad Run , klik op Start Run. Het drogen duurt 5 minuten, en de instrumenten maken automatisch foto's van de dia's na het drogen.
4. Bekijk de foto's; Als de druppels voldoende droog zijn, stop dan de run. Zo niet, klik dan op doorgaan en droog nog eens 5 minuten (Figuur 6A).
5. Aan het einde van de run schakel je terug naar de vorige Dew Point Control.

13. Etiketten uitdelen

1. Kies in het tabblad Hoofd de run to 6_Dispense_PA_Labels.
2. Ga naar het tabblad Target Setup , laad het Labels.fld-bestand uit de juiste schememap en stel het aantal velden in op Y, zodat het aantal geplande dia's wordt verwerkt.
3. Aliquot 150 μL LC-MS-grade DMSO in slot 2 van het CellenWASH-station.
4. Bereid een voorraadoplossing voor van de twee labelvoorraden voor multiplexed histonderivatisatie: 25% (v/v) propionanhydride in DMSO en 25% (v/v) propionanhydride-d₁₀ in DMSO.
   OPMERKING: Ontgass beide oplossingen voordat je ze op de plaat overbrengt om de vorming van bellen te minimaliseren.
5. Doseer 20 μL van elk labelreagens in de aangewezen putten van een 384-put plaat en plaats de plaat binnen het X1-systeem. Elke druppel ontvangt ~10 nL labelingsreagens (25% propionanhydride of 25% propionaanhydride-d₁₀ in DMSO).
6. Schakel over naar het tabblad Run , klik op Start Run en volg de prompts.
7. Laat de labels 1 uur op de schuif reageren.
8. Na het afgeven spoelt het instrument automatisch de mondstukken en fotografeert elke slide. Bekijk de beelden om een gelijkmatige verdeling en correcte druppelplaatsing over alle dia's te bevestigen.

14. HA-uitlevering

1. Bereid de HA-oplossing voor en ontgass deze voor gebruik.
2. Laad het flesje. Pipetteer 150 μL van de HA-oplossing in een schone PCR-buis, plaats deze in CellenWASH-slot 2 en oriënteer de kap naar de instrumentdeur.
3. Selecteer het runprofiel. Kies in het tabblad Hoofd 7_Dispense_Quench.
4. Configureer het veldbestand. Open het tabblad Target Setup , laad HA.fld vanuit de juiste multiplexing-schema map en stel het aantal velden in op Y zodat het gelijk is aan het totale aantal dia's.
5. Begin met de run. Navigeer naar Run, klik op Start Run en volg de instructies op het scherm.
6. Incubateer. Laat de HA 30 minuten op de dia's reageren.
7. Controleer de afgifte. Na voltooiing spoelt het systeem de nozzles door en maakt beelden van elke dia—bekijk deze beelden om de uniforme plaatsing en het volume van de druppels te bevestigen.

15. Voorbeeld-pick-up

1. Bereid de wasoplossing voor in de WashTray XL.
2. Zet het collectebord klaar. Doseer 2 μL van 0,01% (w/w) DDM in LC-MS-kwaliteit water in elke put van een verse 384-put plaat en plaats de plaat in de vloeistofbehandelaar.
3. Kies de pick-up run. Selecteer in het tabblad Hoofd het profiel 8_Pickup_2plex.
4. Laad het veldbestand. Open het tabblad Target Setup , importeer Pick-up.fld uit de juiste multiplexing-schema-map en stel het aantal velden in op Y zodat het overeenkomt met het aantal dia's.
5. Voer de run uit. Schakel over naar het tabblad Run , klik op Start Run en volg de prompts. Het instrument zal elke druppel verzamelen, de mondstukken doorspoelen en de dia's fotograferen ter beoordeling om te bevestigen dat elk monster is teruggewonnen.

16. Verwerking na het ophalen

1. Sluit de 384-put plaat af met lijmfolie en centrifugeer kort om druppels naar de bodems van de putten te brengen.
2. Verwijder de folie en droog de monsters op lage temperatuur in een vacuümconcentrator.
3. Sluit de plaat af met lijmfolie en bewaar de gedroogde plaat op -80 °C totdat deze klaar is voor LC-MS/MS-analyse.

17. Bulkmonstervoorbereiding

1. Gebruik de overgebleven suspensie van sectie 9 om de cellen te spinnen en opnieuw te suspenseren in 1x PBS om een concentratie van 2.000 cellen/μL te verkrijgen. Dit moet worden uitgevoerd na voltooiing van sectie 10.
2. Thermische lyse: de resterende suspensie met een snap-freeze bij -80 °C gedurende 10 minuten, daarna hitteshock bij 90 °C gedurende 10 minuten.
3. Laat de buis weer afkoelen tot kamertemperatuur.
4. Breng 25 μL van het lysaat over in een PCR-buis en voeg 5 μL van het eerder bereide verteringsmengsel toe.
5. Broeden 's nachts (≈ 16 uur) op 37 °C in een thermische cycler.
6. Lichtlabelderivatisatie: voeg 5 μL van een verse 25% (v/v) lichte etiket toe aan acetonitril en incubeer gedurende 1 uur.
7. Reactie-afkoeling: voeg 5 μL van 1% (w/w) hydroxylamine (HA) oplossing toe en incubeer 30 minuten.
8. Droog het monster in een vacuümconcentrator op lage temperatuur en bewaar het vervolgens bij -80 °C tot het klaar is voor LC-MS/MS.

18. LC/MS-opstelling en gegevensverzameling

OPMERKING: Om de gegevens voor dit manuscript te verzamelen, is een LC-MS\MS-systeem opgesteld met een Ion Optics 75 μm ID x 25 cm x 1,7 μm analytische kolom.

1. Bereid de mobiele fasen voor om op de HPLC te draaien:
   Mobiele Fase A (MPA): 0,1% mierenzuur in HPLC-kwaliteit water
   Mobiele Fase B (MPB): 0,1% mierenzuur in HPLC-kwaliteit acetonitril
2. Programmeer de HPLC-methode voor een actieve gradiënt van 30 minuten: 5-23% MPB in 25,7 min, 23-35% MPB in 2,6 minuten en 35-45% MPB in 1,7 min, met een debiet van 200 nL/min. Programmeer de autosampler om het monster opnieuw te suspenderen in 0,1% FA + 0,01% DDM voor 'droge' opname.
3. Stel de MS-acquisitiemethode in om data-onafhankelijke acquisitie (DIA) uit te voeren:
   OPMERKING: Deze instellingen zijn specifiek voor een Thermo Exploris 480 uitgerust met FAIMS Pro Duo en kunnen verschillen afhankelijk van je instrument. Het wordt aanbevolen om die te gebruiken die gangbaar zijn voor DIA single-cell proteomics met vergelijkbare m/z-bereiken zoals hieronder beschreven.
   1. Stel de MS in op een volledige scan van 300-1100 m/z met een resolutie van 120.000, AGC-doel van 300%, maximale injectietijd van 246 ms en FAIMS CV van -50 V.
   2. Stel de MS/MS in op een DIA-scan van 300-1100 m/z met een resolutie van 60.000, isolatievenster van 50 m/z, HCD-botsingsenergie van 27%, eerste massa van 120 m/z, AGC-doel van 1000%, maximale injectietijd van 118 ms, en FAIMS CV van -50 V.
4. Verwijder de folieafdichting van de 384-wellplaat met de single cells. Reconstrueren van het bulkmonster bij 100 cellen/μL in 0,1% FA + 0,01% DDM en 10 μL overbrengen in een lege put, zoals P24. Daarna sluit je de plaat af met een doorboorbare rubberen mat en laad je deze in de autosampler.
5. Queue-up runs: voer eerst de bulksamples uit en daarna de sets single cells.

19. Data-analyse

1. Voer de ruwe data uit met EpiProfile2.1 om de output te krijgen met de peptidoform-abundanties voor de cellen die zijn gelabeld met propionaanhydride.
   OPMERKING: Monsters moeten worden verkregen op een thermo-instrument om EpiProfile 2.1 te kunnen gebruiken voor gegevensverwerking. Deze software extraheert ongeveer 250 peptidovormen met de canonieke versie, maar is bewerkbaar afhankelijk van het organisme, aanvullende aanpassingen, mutaties, enzovoort^.
2. Voer de ruwe data uit met EpiProfile2.1_D5 om de output te krijgen met de peptidoform-abundanties voor de cellen gelabeld met propionaanhydride-d10.
3. Voer de mapping uit door de metadata te koppelen aan de Epiprofile-uitvoer met het quantQC-programma.
4. Filter mislukte monsters eruit door te vergelijken met de blanco's.
5. Filter peptidoforms eruit die niet in minstens 50% van de monsters zitten.
6. Filter peptidoforms eruit waarvan het signaal van de eenheidscelintensiteit niet groter is dan het 150%-signaal in blanco's.
7. Verkrijg de resultaattabel (Figuur 7A) en verwerk de gegevens verder indien nodig.

Results

Om de toepassing van onze single-cell histon proteomics-workflow met ons systeem te demonstreren, analyseerden we sferoïden van HepG2/C3A-cellen behandeld met 5 mM natriumbutyraat gedurende 24 uur. Na LC-MS/MS-verwerving werden ruwe gegevens verwerkt met EpiProfile voor zowel lichte (propionanhydride) als zware (propionaanhydride-d10) labeling, waarbij genormaliseerde gegevens werden verkregen die de hoeveelheden peptiden en histonmarkeringen weergeven. Het QuantQC R-pakket werd vervolgens gebruikt om de acquisitiemetada...

Discussion

Het vermogen om histon posttranslationele modificaties op enkelcelniveau te meten, vormt een cruciale stap richting het begrijpen van de werkelijke heterogeniteit van chromatineregulatie. Traditionele bulkmethoden hebben onschatbare inzichten opgeleverd in de gemiddelde verdeling van hPTM's over weefsels, maar maskeren toch cel-tot-cel variabiliteit die steeds meer wordt erkend als biologisch betekenisvol⁵. Enkelcellige proteomische benaderingen stellen ons nu in ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	Bio-Rad	2239480
1000 µL wide bore pipet tips	Fisher Scientific	14222703
200 µL wide bore pipet tips	Fisher Scientific	14222730
384 well PCR plate Lo Bind	Eppendorf	30129547
96-well vacuum manifold	Millipore	MAVM0960R
Acetonitrile, Optima LC-MS/MS grade	Fisher Scientific	A955-1
Adhesive PCR plate foils	Thermo Fisher	AB0626
Anhydrous Acetonitrile	Fisher Scientific	AA42311AK	Labels stock solution for bulk
Arg-C Ultra, Mass Spec Grade	Promega	VA1831
Cell culture grade water	Corning	25-055-CV
CellenVIALs	SCIENION	/	Catalog number comes with a quote
DMSO, Anhydrous	Thermo Fisher	D12345	Labels stock solution
DTT	Sigma	D0632-5G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Fisher Scientific	MT17205CV
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	MT35010CV
Formic acid	Thermo	28905
Formic acid 98%–100% for LC-MS LiChropur	Sigma	5330020050
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Pure)	Thermo Fisher	11344041
HPLC grade acetonitrile	Fisher Scientific	A955-4
HPLC grade water	Fisher Scientific	W5-4
Hydroxylamine solution 50 wt. % in H2O	Sigma	438227-50ML
L-glutamine	Fisher Scientific	MT25015CI
n-Dodecyl-beta-Maltoside (DDM) Detergent	Fisher Scientific	BN2005
Non-essential amino acids	Fisher Scientific	MT25025CI
Orbitrap Exploris 480 Mass Spectrometer	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldehyde 16% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710-S
PDC-CM (type 2 coating)	SCIENION	/	Catalog number comes with a quote
Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	MT3002CI
Phosphate-buffered saline (PBS),10x, pH 7.4, RNase-free	Thermo Fisher	AM9625
Pierce Dimethylsulfoxide (DMSO), LC-MS Grade	Thermo Fisher	85190
Pipette gun	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Propionic anhydride ≥99%	Sigma	240311-50G
Propionic anhydride-d10 ≥98 atom % D, ≥99% (CP)	Sigma	615692-1G
Refrigerated centrifuge	Thermo	75-217-420
SciCHIP H1 coated glass slides	SCIENION	/	Catalog number comes with a quote
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates)	Thermo	15308325	Savant SPD1010
Sterile hood	Thermo	1375
Sterile serological pipettes	Fisher Scientific	1367549
SYTOX Green Dead Cell Stain, for flow cytometry	Thermo Fisher	S34860
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher	12604013
Vortex	Sigma	Z258415
Water bath	Fisher Scientific	FSGPD10