Methodenartikel

Verbeterde ruimtelijke mapping van maagspierlagen van de muis met behulp van een aangepaste Swiss roll-techniek

DOI:

10.3791/69673

⸱

25 november 2025

 ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program and Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 2Gastroenterology Research Unit, Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science, 3Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic College of Medicine and Science

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een immunokleuringsmethode voor de hele maag, aangepast van de "Swiss roll"-techniek die oorspronkelijk voor de muisdarm is ontwikkeld.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ruimtelijke "omics"-technologieën bieden ongekende mogelijkheden om de biologie en interacties van individuele cellen van het maagneuromusculaire apparaat in hun natuurlijke weefselomgeving te bestuderen. De succesvolle toepassing van deze benaderingen en het beoordelen van structurele en moleculaire verschillen over het fundus, corpus en antrum vereisen echter consistente bemonstering en weefselorientatie. Hier rapporteren we een aangepaste "Swiss roll"-techniek die is afgestemd op de muizenmaag, waarmee alle belangrijke anatomische gebieden in één cryosectie kunnen worden ingebed en visualiseerd. Deze benadering legt de nadruk op vlakke fixatie en zorgvuldige positionering om secties met reproduceerbare oriëntatie en kwaliteit te genereren. Deze studie optimaliseerde ook immunofluorescentiekleuringscondities om hoogwaardige visualisatie van cellulaire markers te waarborgen. Dit protocol maakt uitgebreide, naast elkaar gerichte vergelijkingen van maagregio's mogelijk, terwijl weefselverlies en experimentele variabiliteit worden geminimaliseerd. Door het verbeteren van weefselbehoud en ruimtelijke oriëntatie biedt deze methode een praktisch en schaalbaar hulpmiddel voor onderzoekers die maagbiologie bestuderen in zowel fysiologische als pathologische contexten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De maag is een complex, J-vormig orgaan dat de slokdarm verbindt met de duodenum1. Het is verdeeld in drie hoofd anatomische gebieden: de fundus, het corpus en antrum1. Elk gebied van de gastrische tunica muscularis speelt een eigen fysiologische rol en draagt bij aan belangrijke maagfuncties zoals accommodatie, gehoorzaamheid, voedseltrituratie en het legenvan 1,2. Het bestuderen van veranderingen in de maagfysiologie en pathologie vereist gedetailleerde analyse van deze regio's en hun cellulaire architectuur.

Om grote weefselgebieden te visualiseren, passen onderzoekers vaak de "Swiss roll"-techniek aan, oorspronkelijk ontwikkeld voor de muisdarm 3,4,5,6. Deze studie paste de Swiss roll-techniek aan voor gebruik bij de muismaag om een nieuw protocol op te stellen. De maag wordt eerst gescheiden in zijn anatomische gebieden en in een vlakke oriëntatie gefixeerd. Het weefsel wordt vervolgens zorgvuldig opgerold en bewerkt voor cryosectie. Onjuiste Zwitserse rol kan kwetsbare epitheelstructuren beschadigen, vooral in de darm, wat leidt tot een slechte weefselkwaliteit voor immunokleuring. Het behouden van goed gefixeerd, correct georiënteerd weefsel met intacte cellulaire structuren is essentieel voor beeldvorming met hoge resolutie. Dit werk presenteert een nieuwe methode voor het genereren van Zwitserse rollen die alle maaggebieden binnen één cryoblok bevatten. Daarnaast wordt een geoptimaliseerd immunofluorescentiekleuringsprotocol beschreven voor de gastrische tunica muscularis, waardoor een gedetailleerde evaluatie van de maagfunctie mogelijk is. Dit protocol biedt een uitgebreide gids voor het verkrijgen van hoogwaardige immunofluorescentiebeelden door zorgvuldige voorbereiding van maagweefsel, Zwitserse rolverwerking en kleuring. Door de ingewikkelde morfologie van de gastrische tunica muscularis te behouden, vergemakkelijkt deze methode een dieper begrip van de structuur en functie ervan in zowel gezondheid als ziekte.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierproeven werden uitgevoerd volgens de richtlijnen uit de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De protocollen werden goedgekeurd door de Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee (A48315-15). De programma's en faciliteiten voor dierenzorg en -gebruik van de Mayo Clinic zijn beoordeeld en volledig geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Zwitserse roltechniek voor paraformaldehyde (PFA)-gefixeerde maagcryosecties

  1. Verdoof een C57BL/6J-muis (8-10 weken oud) via kooldioxide (CO₂) inademing gedurende minstens 3 minuten, gevolgd door een cervicale ontwrichting om euthanasie te waarborgen (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  2. Snijd de slokdarm, het duodenum en de ventrale en dorsale mesogastrie af om de maag te verwijderen.
  3. Plaats de maag in een met siliconen beklede schaal met koud fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS). Zet de slokdarm, fundus, corpus en duodenum aan als oriëntatiereferenties (Figuur 1A). De snijrichting wordt aangegeven door een rood gestippelde lijn in Figuur 1A.
  4. Verwijder voorzichtig vastzittend vet met een deuvelschaar en pincet.
  5. Snijd langs de ventrale mesenterie van de twaalfvingerige darm en de maag tot aan de pin bij het corpus, en plat het weefsel vervolgens voorzichtig (Figuur 1B).
  6. Gebruik een transferpipet gevuld met PBS om eventueel restvoedsel uit het maaglumen te spoelen.
  7. Rek voorzichtig de open buik om een vlakke oriëntatie te bereiken (Figuur 1C).
    VOORZICHTIG: Vermijd overrekking (dus meer dan 110% van de oorspronkelijke afmetingen) om de weefselarchitectuur te behouden.
  8. Dompel de maag 2 minuten onder in een koude 4% PFA om het weefsel licht vast te zetten en het rollen te vergemakkelijken.
  9. Speld het weefsel weer plat na de korte fixatie.
  10. Trim de buik langs de stippelvormige omtrek om een uniforme vorm te creëren die geschikt is voor rollen (Figuur 1C).
  11. Plaats het afgeknipte maagweefsel op PBS-bevochtigd filterpapier (Figuur 1D).
  12. Rol het weefsel op tot een Swiss roll-configuratie en zet het vast door een tandenstoker door het midden te steken.
    VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat de slijmvlieszijde tijdens het rollen naar boven wijst. Houd het duodenaluiteinde met een tang in één hand terwijl je met de andere hand de tandenstoker begeleidt, na kleine aanpassingen van gepubliceerde methoden.
  13. Eenmaal opgerold steek je een 30-G naald in om de vorm te bevestigen en buig je hem onder een hoek van 90° om de opgerolde buik te stabiliseren (Figuur 1E).
  14. Bevestig het opgerold weefsel in 4% PFA op 4 °C gedurende 6 uur.
  15. Breng het gefixeerde weefsel over naar 30% sucrose in PBS en incubeer bij 4 °C gedurende 12-16 uur voor cryoprotectie en voorkoming van ijskristallenvorming.
  16. Verwijder voorzichtig de stabiliserende naald.
  17. Leg het weefsel in een optimale snijtemperatuur (O.C.T.) compound met wegwerpbasismallen en vries het vervolgens in op droogijs (Figuur 1F).
  18. Zodra de mal volledig bevroren is, bewaar je de mal op -80 °C.
    VOORZICHTIG: Vermijd luchtbellen in de O.C.T., vooral rond het weefsel, omdat deze het doorsnijden belemmeren. Weefselblokken kunnen minimaal één jaar worden bewaard bij -80 °C.
  19. Voor het snijden moet je het blok minstens 1 uur in evenwicht brengen op -20 °C.
  20. Snijd het weefsel op 5 μm dikte met een cryostaat.
    VOORZICHTIG: Een dikte van 5-12 μm is over het algemeen geschikt voor musiene maagsecties 7,8 en kan worden aangepast op basis van experimentele behoeften. Secties kunnen tot 3 maanden worden opgeslagen bij -20 °C.

2. Immunofluorescentie kleuring van maagspierweefsel

  1. Met een hydrofobe barrièrepen tekent u een waterafstotende barrière rond elk weefselgedeelte op de microscoopglaas.
  2. Was de secties 5 minuten met koude PBS om de resterende O.C.T.-verbinding op te lossen.
  3. Blokkeer niet-specifieke binding door de secties te incuberen met 1% rundserumalbumine (BSA) in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT; 21-23 °C).
  4. Verwijder de 1% BSA met zuigkracht, en was de secties daarna drie keer met koude PBS gedurende 10 minuten op RT (21-23 °C).
  5. Blokkeren niet-specifieke binding verder door de secties te incuberen met een muis-op-muis IgG-blokkerende oplossing in PBS gedurende 1 uur bij RT (21-23 °C), wat de binding van endogeen IgG vermindert en de specificiteit verbetert bij gebruik van muisantilichaam IgG.
  6. Verwijder de blokkingsoplossing met zuigkracht, en was de secties drie keer met koude PBS gedurende 10 minuten elk op RT (21-23 °C).
  7. Herhaal BSA-blokkering 1 uur bij RT (21-23 °C).
  8. Incubeer de secties met primaire antistoffen. Anoctamin-1 (ANO1), KIT, beta-tubuline klasse III (TUBB3) verdund in koude 1% BSA met 0,3% Triton X-100. Gebruik in een apart experiment myosine heavy chain 11 (MYH11), E-cadherin en KIT. Broed 's nachts (12-16 uur) op 4 °C.
  9. Verwijder de primaire antistofoplossing met zachte zuiging. Was de secties drie keer met koude PBS gedurende 10 minuten per keer bij RT (21-23 °C).
  10. Incubeer de secties met secundaire antistoffen. Alexa Fluor (AF) 488 anti-konijn IgG, AF555 anti-muis IgG en AF647 anti-geit IgG (allemaal op 5 μg/mL; 1:400) in 1% BSA gedurende 1 uur bij RT (21-23 °C).
  11. Verwijder de secundaire antistofoplossing met afzuiging en was de secties drie keer met koude PBS gedurende 10 minuten op RT (21-23 °C).
  12. Kleur de secties met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, bij 1:300 verdunning) gedurende 1 uur bij RT (21°-23 °C).
    VOORZICHTIG: Neuronale kernen vertonen doorgaans zwakkere DAPI-signalen dan andere GI-celtypen; Een minimale incubatie van 1 uur wordt aanbevolen voor optimale visualisatie.
  13. Spoel de secties één keer af met ultrazuiver water om restzouten te verwijderen.
  14. Monteer de slides met Antifade Mountant.
  15. Sluit de hoeken van de deklaag af met niet-fluorescerende laklak. Verwijder overtollig montagemateriaal met zachte zuigkracht. Daarna sluit je de hele omtrek van het dekbedekking af.

3. Immunofluorescentiebeeldvorming met behulp van een confocale microscoop

  1. Stel multi-kanaals Z-stack acquisitie in in de confocale beeldvormingssoftware door lasers en detectoren te configureren voor DAPI, AF488, AF555 en AF647, zodat spectrale scheiding wordt gegarandeerd en signaalverzadiging wordt voorkomen.
    VOORZICHTIG: Pas het laservermogen en de belichtingstijd individueel aan voor elke fluorofoor om crosstalk te voorkomen en het signaal binnen het dynamisch bereik over alle kanalen te houden (Figuur 2A).
  2. Stel belichtingsparameters in in de confocale beeldsoftware om pixelverzadiging te voorkomen en signaaldetails in hoogintensiteitsgebieden te behouden (Figuur 2B).
    VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat signalen in alle kanalen binnen het dynamisch bereik blijven en niet verzadigd worden.
  3. Om de volledige maagrol vast te leggen, gebruik je een grote beeldopname-instelling (bijv. 6 × 6 velden) (Figuur 2C); Deze instelling moet echter worden aangepast afhankelijk van de totale grootte en strakheid van het opgerold weefsel.
  4. Verslaat 3D-beelden met Z-serie acquisitie in de confocale beeldvormingssoftware. De gedetailleerde workflow voor N-dimensionale (ND) verwerving wordt geïllustreerd in Figuur 2D.
  5. Selecteer de Z-stack optie om Z-serie imaging in te schakelen.
  6. Definieer het Z-bereik door de boven- en onderbrandpuntsposities zo in te stellen dat de volledige dikte van de hele maag omvat.
  7. Breng de bovenkant van de buik scherp en klik op de bovenste knop om de bovenste Z-limiet in te stellen.
  8. Stel de focus aan naar de onderkant van de maagspier en klik op de knop Onderaan om de onderste Z-limiet in te stellen.
  9. Stel het aantal Z-stack stappen in op 8 om de volledige diepte van de maagspier te overspannen.
  10. Klik op Run now om de Z-stack beeldacquisitie te starten.
  11. Genereer projecties met maximale intensiteit voor individuele en samengevoegde fluorescentiekanalen om driedimensionale gegevens in een tweedimensionaal beeld te visualiseren.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de nieuwe methode omvatten muisachtige maagrollen alle drie de belangrijkste regio's van de maag: fundus, corpus en antrum, samen met een klein deel van de slokdarm en de duodenum in één sectie. Door de hele maag in één sectie op te nemen, kan een uitgebreide regionale analyse mogelijk worden (Figuur 1). Hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) van hele beelden van de maagrollen toonde een goed bewaarde maagarchitectuur in alle regio's, waardoor de mucosale, submucosale en muscularis-lagen duidelijk zichtbaar werden (Figuur 3). Figuur 4 toont representatieve immunofluorescentie kleuring van interstitiële cellen van Cajal (ICC; pacemakercellen die ritmische langzame golven genereren onder de fasische darmmotiliteit; geïdentificeerd door KIT en ANO1), enterische neuronen (neuronen van het enterisch zenuwstelsel die gastro-intestinale motiliteit coördineren; geïdentificeerd door TUBB3-immunokleuring) en kernen (DAPI). In het maagslijmvlies wordt KIT ook tot expressie gebracht in Paneth- en bekercellen, zoals eerder gerapporteerd 9,10,11. ANO1 wordt ook sterk tot expressie gebracht in het maagepitheel, met name in de kolomvormige epitheelcellen van de fundus, wat overeenkomt met zijn rol in chloridetransport en mucosale secretie11. Daarnaast wordt TUBB3 tot expressie gebracht in bepaalde maagendocriene cellen en slijmafscheidende cellen, volgens gegevens uit de Human Protein Atlas12,13. Figuur 5 toont representatieve immunofluorescerende kleuring van gladde spiercellen gelabeld met MYH11, maagslijmvliesepitheelcellen gelabeld met E-cadherine, en ICC gelabeld met KIT. MYH11 wordt ook tot expressie gebracht in myofibroblasten in het maagslijmvlies, zoals eerder gerapporteerd14. Samen bevestigen deze immunofluorescentieresultaten dat ons protocol de weefselarchitectuur behoudt.

Figuur 1
Figuur 1: Bereiding van de "Swiss roll" van de muizenmaag voor cryosectie. (A) De hele maag wordt direct na verwijdering in een zwarte, met siliconen gecoate dissectieschaal geplaatst, gevuld met koud fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de weefselintegriteit te behouden. (B) De maag wordt geopend langs het midden van de duodenum. (C) De buik wordt voorzichtig uitgerekt en in de schaal gepind om plat te liggen zonder overmatige spanning. Langs het weefsel is een rood gestippelde lijn omlijnd om aan te geven waar het geknipt moet worden om het rollen te vergemakkelijken. (D) De geopende en gefixeerde maag wordt op PBS-gevochten filterpapier gelegd ter voorbereiding op het oprollen tot een compacte configuratie. De rode pijl toont de richting van de maagrol. (E) Weefselstukken worden ingebed in optimale snijtemperatuur (O.C.T.) verbinding en ingevroren op droogijs ter voorbereiding op cryosectie. (F) De bevroren blokken worden opgeslagen bij −80 °C en gecryosectied op 5 μm dikte voor downstream analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: ND-acquisitie-opstelling en verzadigingsvisualisatie tijdens Z-stack imaging. (A) Laser- en detectorinstellingen geconfigureerd in de confocale beeldvormingssoftware voor multikanaals spectrale beeldvorming. Er worden vier fluoroforen gebruikt: 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), Alexa Fluor 488 (AF488), Alexa Fluor 555 (AF555) en Alexa Fluor 647 (AF647), elk gekoppeld aan bijbehorende excitatielasers en emissiedetectoren. De spectraalgrafiek toont excitatie- en emissiecurves, waardoor aanpassingen mogelijk zijn om overpraat te minimaliseren en signaaldetectie te optimaliseren. (B) Belichtingsinstellingen worden individueel aangepast voor elke fluorofor om pixelverzadiging te voorkomen en details in gebieden met hoge intensiteit te behouden. (C) Grote beeldverwervingsinstellingen (bijv. 6 × 6 velden) maakt visualisatie van de gehele maagrol mogelijk; De grootte van het beeldveld moet worden aangepast aan de grootte en compactheid van het gerolde weefsel. (D) ND Acquisitievenster toont Z-stack parameterinstellingen. Het Z-bereik wordt gedefinieerd door de boven- en onderpositie van de maagspier te selecteren, met acht stappen die de volledige diepte van het weefsel vastleggen voor driedimensionale (3D) analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Afbeelding van een met hematoxyline en eosine gekleurde muismaag Swiss roll. Tegelscan toont het vermogen aan om de volledige maagrol van een 8 weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muis te visualiseren. Belangrijke anatomische gebieden zijn aangegeven, waaronder de slokdarm (rode gestippelde lijn), de onderste slokdarmsluitspier (paarse gestippelde lijn), de fundus (zwarte gestippelde lijn), het corpus (blauwe stippellijn), antrum (groene gestippelde lijn) en het duodenum (oranje gestippelde lijn). Schaalbalk: 1000 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Confocale beelden van een Zwitserse rol van een hele muismaag: ANO1, KIT, TUBB3. Bovenste panelen: Representatieve gestikte confocale beelden van een maagrol van een 8 weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muis, met immunokleuring voor ANO1 (groen), KIT (cyaan), TUBB3 (geel) en kernen (blauw). De gehele opgerolde maag, inclusief fundus, corpus en antrum, wordt gevisualiseerd. Schaalbalken: 1000 μm. Onderste panelen: Vergrote weergaven van het gebied dat wordt omlijnd door het wit gestippelde vakje in de bovenste panelen, met cellulaire details van interstitiële cellen van Cajal (ANO1+ en KIT+; gele pijlen) en enterische neuronen (TUBB3⁺; rode pijlen). Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5: Confocale beelden van een Zwitserse rol van een hele muismaag: MYH11, KIT, E-cadherine. Bovenste panelen: Representatieve gestikte confocale beelden van een maagrol van een 8 weken oude vrouwelijke C57BL/6J-muis, met immunokleuring voor MYH11 (groen), KIT (cyaan), E-cadherine (geel) en kernen (blauw). De gehele opgerolde maag, inclusief fundus, corpus en antrum, wordt gevisualiseerd. Schaalbalken: 1000 μm. Onderste panelen: Vergrote weergaven van het gebied, omlijnd door het wit gestippelde vakje in de bovenste panelen. Witte stippellijnen markeren het slijmvliesepitheel (E-cadherine) en de spierlaag (MYH11). Witte pijlen geven KIT+ interstitiële cellen van Cajal (ICC) aan. Schaalbalken: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met de nieuw geoptimaliseerde gastrische Swiss-roll methode worden alle drie de segmenten van de maag (fundus, corpus en antrum), samen met de slokdarm en duodenum, op één dia-diaat opgenomen. Deze uitgebreide inbedding stelt onderzoekers in staat structurele en moleculaire veranderingen in de gehele maag te analyseren en verlaagt de kosten van het doorsnijden en kleuren van reagentia (Figuur 1).

Door alle maaggebieden gelijktijdig aan dezelfde kleuringsoplossingen te laten zien tijdens de immunokleuring, zorgt dat voor consistentie en verbetert de nauwkeurigheid. Immunokleuring van maagbroodjes laat duidelijk de duidelijke lagen van de maagwand zien. Zoals weergegeven in Figuur 4 en Figuur 5, maakt deze methode visualisatie van morfologische verschillen tussen maagsegmenten mogelijk en maakt het detectie mogelijk van ICC (KIT en ANO1)10, neuronen (TUBB3)15, gladde spiercellen (MYH11), mucosale epitheelcellen (E-cadherine) en kernen.

Kleine aanpassingen kunnen worden aangebracht afhankelijk van de weefselconditie en het onderzoeksdoel. Het verwijderen van extra vastzittend vet kan bijvoorbeeld helpen om de vorm van de rol tijdens de fixatie te behouden. Het aanpassen van de sectiedikte kan ook helpen om de weefselstructuur te behouden of de hechting aan het glaasje te verbeteren. Een andere mogelijke verfijning is het gebruik van een metalen mal voor een consistenter snijden, zoals bij darm Swiss rolls16. Hoewel dit protocol zich richt op cryosecties, kan het worden aangepast voor paraffine-ingebedde weefsels. Hoewel paraffine-inbedding de weefselstructurele integriteit behoudt, maakt cryosectie snellere verwerking en betere antigeenbehoud mogelijk, waardoor het geschikter is voor immunofluorescentie.

Deze methode heeft wel beperkingen. Een vergroot, fibrotisch of verkalkt maag, vaak gezien bij aandoeningen zoals ontstekingen, obesitas, diabetes of veroudering, kan moeilijker te rollen zijn en kan uitdagingen vormen voor optimale kleuring 17,18,19,20. Ondanks deze beperking biedt deze techniek grote voordelen ten opzichte van traditionele regio-specifieke embedding. Het verwerken van alle maaggebieden onder identieke omstandigheden verbetert de consistentie, vermindert variabiliteit en bespaart zowel tijd als reagentia.

Deze benadering is vooral nuttig voor studies naar regio-specifieke veranderingen. Het ondersteunt ook ruimtelijke analyse van meerdere celtypen en kan worden gecombineerd met beeldgebaseerde kwantificatie. Al met al biedt deze nieuw geoptimaliseerde maag-Swiss-roll methode een praktisch en schaalbaar platform voor uitgebreide maagweefselanalyse op het gebied van gezondheid en ziekte.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd deels ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health: R01 DK057061 (T.O.), R01 DK121766 (Y.H.), R01 DK126827 (T.O.), R01 DK131455 (T.O.) en P30 DK084567 (Epigenomics and Spatial Biology Core, Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology). De financieringsinstanties hadden geen rol in het ontwerp van studies, data-analyse of het voorbereiden van manuscripten. De inhoud is volledig de verantwoordelijkheid van de auteurs. Wij danken Dr. Darren J. Baker en leden van het Dr. Baker Laboratory (afdeling Biochemie en Moleculaire Biologie, Mayo Clinic, Rochester, MN) voor het delen van laboratoriummiddelen en technische ondersteuning voor H&E-kleuring.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#5SF ForcepsFINE SCIENCE TOOLS11252-00
Bovine serum albumin SIGMA-ALDRICHA7906
ColdVision MC-LS LED light sourceSCHOTTMC-LS
Confocal software NikonNikon NIS-Elements Imaging Software
Cryoseal XYLEpredida9312-4
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dilactate)Thermo Fisher ScientificD3571
Dissection Dishes, LargeLiving Systems  InstrumentationSKU: DD-90
Donkey anti-goat AF647 pAbLife TechnologiesA21447Lot: 1739289 RRID:AB_2535864
Donkey anti-mouse AF555 pAbLife TechnologiesA31570Lot: 1774719 RRID:AB_2536180
Donkey anti-rabbit AF488 pAbLife TechnologiesA21206Lot: 2668665 RRID:AB_2535792
E-cadharin (1:400 dilution)BD Bioscience610181lot: 25510 RRID:AB_397580
EosinELITechGroup$SS-071C
Epoxy Coated ForcepsFINE SCIENCE TOOLS11210-10
EthanolSIGMA-ALDRICH459828-4L
FLEX TUBE 1.5 mLEppendorf22364111
Gauze SpongesFisherscientific22-362-178
Hardened Fine ScissorsFINE SCIENCE TOOLS14090-09
HematoxylinEpredia7211
KIT (0.2 µg/mL; 1:1000 dilution)R&D SystemsAF1356Lot: IEO0217101 RRID: AB_354750
LENS CLEANING SOLUTION 1OZ SPRAY BOTTLENikon77013066
Microscope Cover GlassFisher Scientific12541016
Microscope SlidesCardinalHealthM6133A
Minutien PinsFINE SCIENCE TOOLS26002-20
MYH11 (1:400 dilution)Biomedical TechnologiesBT-562RRID:AB_10013421
Nail polishSINFUL COLORS7.33855E+11
Needle 30 G x 1/2 in. BD Bioscience305106
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICH158127-500G
Personna Single Edge BladesThe Razor Blade Co.76247-652
ReadyProbes Mouse-on-Mouse IgG Blocking Solution (30x)Thermo Fisher ScientificR37621Lot: 3226230
SlowFade Diamond Antifade Mountant (Mounting media)Thermo Fisher ScientificS36972
StainTray 10 slides staining systemSimport ScientificM918-2
Stereo microscope 0.8x-5xNikonSMZ645
Sucrose SIGMA-ALDRICHS9378-1KG
Surface-Amps X-100 (Triton X)Thermo Fisher Scientific28314
TMEM16A (ANO1: 1:400 dilution)Abcamab53212 Lot: GP3295656-1 RRID: AB_883075
Transfer PipetFalcon357575
TUBB3 (1:400 dilution)Cell signaling technology4466Lot: 5 RRID: AB_1904176
Xylenes Fisher ScientificX3P-1GALLOT 206238

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chaudhry, S. R., Liman, M. N. P., Omole, A. E., Peterson, D. C. Anatomy, abdomen and pelvis: Stomach. , StatPearls. (2025).
  2. Sanders, K. M., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Baker, S. A. Ca(2+) dynamics in interstitial cells: Foundational mechanisms for the motor patterns in the gastrointestinal tract. Physiol Rev. 104 (1), 329-398 (2024).
  3. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": A simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  4. Li, S., You, S., Mao, K. Protocol for multiplex immunofluorescence imaging of mouse intestinal tumors. STAR Protoc. 6 (2), 103776(2025).
  5. Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. Improved Swiss-rolling technique for intestinal tissue preparation for immunohistochemical and immunofluorescent analyses. J Vis Exp. (113), e54161(2016).
  6. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal Swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin-embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  7. Hayashi, Y., et al. Platelet-derived growth factor receptor-alpha regulates proliferation of gastrointestinal stromal tumor cells with mutations in KIT by stabilizing ETV1. Gastroenterology. 149 (2), 420-432.e16 (2015).
  8. Hayashi, Y., et al. TRP53-mediated cell cycle arrest of precursors underlies interstitial cell of Cajal depletion during aging. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 11 (1), 117-145 (2021).
  9. Rothenberg, M. E., et al. Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice. Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).
  10. Gomez-Pinilla, P. J., et al. Ano1 is a selective marker of interstitial cells of Cajal in the human and mouse gastrointestinal tract. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1370-G1381 (2009).
  11. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl(-) secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  12. Uhlen, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  13. Uhlen, M., et al. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1920-1932 (2005).
  14. San Roman, A. K., Jayewickreme, C. D., Murtaugh, L. C., Shivdasani, R. A. Wnt secretion from epithelial cells and subepithelial myofibroblasts is not required in the mouse intestinal stem cell niche in vivo. Stem Cell Reports. 2 (2), 127-134 (2014).
  15. Drokhlyansky, E., et al. The human and mouse enteric nervous system at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1606-1622.e23 (2020).
  16. Jiang, Y., et al. Mapping and tracing Grem1(+) stromal cells in an Apc (Min/+) mouse utilizing cryopreserved intestinal sections prepared via modified Swiss-roll technique. iScience. 27 (11), 111173(2024).
  17. Izbeki, F., et al. Loss of Kitlow progenitors, reduced stem cell factor and high oxidative stress underlie gastric dysfunction in progeric mice. J Physiol. 588 (Pt 16), 3101-3117 (2010).
  18. Hayashi, Y., et al. Hyperglycemia increases interstitial cells of Cajal via MAPK1 and MAPK3 signaling to ETV1 and KIT, leading to rapid gastric emptying. Gastroenterology. 153 (2), 521-535.e20 (2017).
  19. Gao, F., et al. Hypoxia-inducible factor 1alpha stabilization restores epigenetic control of nitric oxide synthase 1 expression and reverses gastroparesis in female diabetic mice. Gastroenterology. 165 (6), 1458-1474 (2023).
  20. Kuro-o, M., et al. Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing. Nature. 390 (6655), 45-51 (1997).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Swiss Roll TechniqueGastric Muscle LayersSpatial OmicsImmunofluorescence StainingMouse StomachTissue OrientationCryosection EmbeddingGastric RegionsInterstitial CellsSmooth Muscle Cells

Gerelateerde artikelen