Methodenartikel

De Nijmegen Hemostasis-assay: gelijktijdige fluorogene meting van trombine- en plasminegeneratie in één put

DOI:

10.3791/69701

⸱

27 februari 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Radboud university medical center, 2Hemophilia Treatment Center Nijmegen-Eindhoven-Maastricht, 3Enzyre BV, Noviotech Campus, 4Department of Laboratory Medicine, Radboudumc Laboratory of Diagnostics, Radboud university medical center, 5Department of Laboratory Medicine, Laboratory of Hematology, Radboud university medical center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de Nijmegen Hemostasis Assay, die gelijktijdige, tijdsgebonden meting van trombine- en plasmingeneratie mogelijk maakt om een geïntegreerde beoordeling van stolling en fibrinolyse te bieden. De assay heeft als doel de karakterisering van het hemostatische evenwicht in onderzoek en klinische omgevingen te verbeteren, buiten het bereik van conventionele hemostatische tests.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombine en plasmine spelen beide een centrale rol in hemostase, waarbij ze respectievelijk de stolling en fibrinolyse reguleren. Conventionele hemostatische assays richten zich vaak op geïsoleerde componenten of beperkte fasen van hemostase; Zo evalueren geactiveerde partiële tromboplastinetijd en protrombinetijd alleen de initiatie van fibrinevorming, terwijl factoractiviteitsassays de functie van individuele stollingsfactoren beoordelen. Hoewel waardevol, missen deze assays een volledig beeld van het algehele proces van secundaire hemostase en fibrinolyse, die zich dynamisch in de loop van de tijd ontvouwen. De Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) pakt deze beperking aan door gelijktijdige, tijdsgebonden meting van trombine- en plasmingeneratie in één microplaatput mogelijk te maken. Door gebruik te maken van twee synthetische fluorogene substraten met verschillende excitatie- en emissiespectra en zonder kruisreactiviteit, maakt de assay een nauwkeurige kwantificering van beide enzymen parallel mogelijk. Hemostase wordt gestart in bloedplaatjesarm plasma met behulp van weefselfactor, calcium- en weefseltype plasminogenactivator, en fluorescentie wordt elke 30 seconden geregistreerd over 70 minuten bij 37 °C. Enzymactiviteitscurves worden gegenereerd met behulp van kalibratiestandaarden, waaruit parameters zoals vertragingstijd, trombinepotentiaal, fibrine-lysetijd en plasminpiekhoogte worden afgeleid. De assay vangt betrouwbaar gelijktijdige trombine- en plasmineproductie met goede precisie binnen en tussen de assay en detecteert modulatie van stolling en fibrinolyse door effectoren zoals heparine, geactiveerd eiwit C en epsilon-aminocaproïnezuur. In klinische monsters werd significant verminderde trombineproductie waargenomen bij patiënten met stollingsfactortekorten, terwijl patiënten met fibrinolytische aandoeningen verhoogde plasminegeneratieprofielen vertoonden. Door metingen van trombine- en plasmingeneratie te combineren, biedt de NHA een uitgebreid inzicht in het hemostatische evenwicht buiten conventionele assays. Deze geïntegreerde aanpak biedt veelbelovend onderzoek en klinische toepassingen, zoals de karakterisering van hemostatische fenotypen, beoordeling van bloedingen en trombotisch risico, en monitoring van gerichte therapeutische interventies. Dit protocol beschrijft de NHA-procedure die tot doel heeft het begrip en de beoordeling van het hemostatische evenwicht te vergroten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemostase is het resultaat van een dynamische balans tussen stolling en fibrinolyse. Trombine en plasmine zijn de belangrijkste enzymen die deze processen aansturen: trombine zet fibrinogeen om in fibrine, terwijl plasmine fibrine afbreekt om stolsels op te lossen. Verstoring van dit evenwicht kan leiden tot bloedingen of trombotische gebeurtenissen 1,2. De laboratoriumtests die in de klinische praktijk worden gebruikt om hemostase te evalueren, richten zich doorgaans op geïsoleerde stappen van stolling of fibrinolyse, wat slechts beperkt inzicht geeft in de algehele hemostatische balans. Bij patiënten met een vermoedelijke bloedingsneiging worden routinematige screeningstests zoals protrombinetijd (PT) en geactiveerde partiële tromboplastinetijd (aPTT) vaak gebruikt om te screenen op tekortkomingen aan stollingsfactoren. Deze assays meten echter de tijd tot de eerste fibrinevorming en vangen de vorming van trombine niet op na het begin van stollings, waar de meeste fysiologisch relevante trombineactiviteit plaatsvindt 1,2,3. Daardoor kunnen ze normale resultaten opleveren bij patiënten met milde tekortenaan stollingsfactor 3,4,5,6,7,8. Om deze specifieke tekortkomingen te identificeren, worden coagulation factor-activiteitsassays gebruikt. Hoewel informatief voor de diagnose, beoordelen deze assays individuele eiwitten in isolatie en weerspiegelen ze niet het algehele hemostatische evenwicht. Als gevolg hiervan correleren factorniveaus bij patiënten met milde tekorten vaak slecht met het bloedfenotype 9,10. Dit bemoeilijkt de klinische risicobeoordeling en het optimaliseren van patiëntbeheer, inclusief het tijdstip en de dosering van de therapie, evenals interventies als reactie op trombotische of ernstige hemorragische gebeurtenissen. Deze beperkingen benadrukken de noodzaak van assays die een meer omvattend beeld bieden van het hemostatische proces in de loop van de tijd en mogelijk helpen de kloof tussen laboratoriumresultaten en klinische presentatie te overbruggen.

De Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) is ontwikkeld om deze beperkingen aan te pakken door gelijktijdige, tijdsgebonden meting van trombine- en plasmingeneratie in bloedplaatarme plasma 8,9 mogelijk te maken. Het gebruikt twee synthetische fluorogene substraten met verschillende excitatie- en emissiespectra om beide enzymen in dezelfde microplaatput te kwantificeren zonder kruisreactiviteit. Enzymgeneratiecurves maken het mogelijk om kwantitatieve parameters af te leiden die de dynamiek van secundaire stolling en fibrinolyse weerspiegelen, waaronder vertragingstijd, trombinepiekhoogte, fibrinelysetijd en plasminepiekhoogte. De NHA biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande trombinegeneratie-assays, zoals het Calibrated Automated Thrombogram (CAT), Ceveron s100 en ST Genesia, die waardevolle informatie over trombinedynamiek bieden maar fibrinolytische activiteit niet beoordelen 10,11,12,13. Stolsellysis-tests vangen op hun beurt aspecten van fibrinolyse vast, maar missen informatie over trombinegeneratie14. Dit beperkt hun bruikbaarheid bij het evalueren van de complexe interacties die het algehele hemostatische evenwicht bepalen. Hoewel sommige laboratoriummethoden trombine- en plasminegeneratiemetingen combineren, vereisen deze doorgaans aparte putten of parallelle assays, wat de temporele uitlijning en doorvoervan 15 beperkt. Globale assays zoals tromboelastografie (TEG) en rotatie-tromboelastometrie (ROTEM) leveren complementaire informatie door primaire hemostase, secundaire stolling en fibrinolyse16,17 vast te leggen. Stroomkamersystemen vormen een andere opkomende maar experimentele benadering om totale hemostase onder stromingsconditieste beoordelen 18. Hoewel deze globale assays een bredere fysiologische context bieden, zijn ze over het algemeen minder gevoelig voor milde bloedingsstoornissen 19,20,21. Door tegelijkertijd trombine- en plasmingeneratie in dezelfde reactie goed te meten, combineert de NHA de gevoeligheid van conventionele TGA's met het geïntegreerde beeld van globale assays, waardoor directe beoordeling van secundaire hemostase, fibrinolyse en hun interacties mogelijk is.

Trombinegeneratie-assays hebben al veelbelovend laten zien voor translationele toepassingen, zoals individuele bloedingen en trombotische risicoprofilering en therapiemonitoring 22,23,24,25. In klinisch onderzoek heeft de NHA een verminderde trombineproductie aangetoond bij patiënten met hemofilie A, hemofilie B en zeldzame tekorten aan stollingsfactoren, evenals verhoogde plasminproductie bij hyperfibrinolytische aandoeningen zoals α2-antiplasmattekort 26,27,28,29. Verschillen in beide routes zijn ook waargenomen bij patiënten met hypofibrinogenemie, een aandoening die geassocieerd wordt met zowel bloedingen als een verhoogd risico op trombose. In deze populatie correleerden lagere fibrinogenniveaus met verminderde plasminaangeneratie, waarschijnlijk door het ontbreken van plasminogenbindende plaatsen, terwijl patiënten met een geschiedenis van trombose een toename van trombinegeneratie30 vertoonden. Daarnaast detecteert de assay de effecten van therapeutische middelen, waaronder antistollings, procoagulantia en antifibrinolytica8. In een eerdere studie stelden we een standaardisatie- en normalisatiebenadering voor om de reproduceerbaarheid te verbeteren en de vergelijking van resultaten tussen runs en laboratoria mogelijk te maken, een essentiële stap richting klinische implementatie28. Dit protocol beschrijft de volledige procedure en analytische aanpak van de NHA voor implementatie in klinisch onderzoek of translationele omgevingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures waarbij menselijk plasma werden uitgevoerd, werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de medische ethische commissie van Arnhem-Nijmegen. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle donoren voorafgaand aan de monsterafname.

1. Voorbereiding van buffers, reagentia en plasmamonsters

  1. Bereid bufferoplossingen voor
    1. Weeg 1,2 g Tris (p.a.) en los op in 180 mL van 0,9% NaCl.
    2. Stel de pH aan naar 7,4 met HCl.
    3. Breng het uiteindelijke volume naar 200 mL met 0,9% NaCl om een 50 mM Tris-150 mM NaCl-buffer (TBS) te verkrijgen.
    4. Verdeel de TBS in twee 50 mL buizen.
    5. Gebruik de resterende 100 mL TBS om de calciumhoudende buffer te bereiden. Los 7,34 g CaCl 2,2H 2O op in 100 mL TBS om een Tris-NaCl-CaCl2-buffer te verkrijgen (TBS-Ca, pH 7,4).
    6. Aliquot de TBS-Ca in twee 50 mL buizen.
    7. Bewaar beide buffers op 4 °C en gebruik ze binnen een week.
  2. Bereid fluorogene substraten voor
    1. Los 53,2 mg van het trombinesubstraat (Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC) op in 4 mL Tris-NaCl-buffer.
      OPMERKING: De doos bevat een folder met een analysecertificaat. Het volume buffer dat toegevoegd moet worden hangt af van de gespecificeerde concentratie en moet worden aangepast zodat 1 μL toegevoegde menselijke trombine in 120 μL reagens een uiteindelijke concentratie van 76 nmol/L oplevert.
    2. Aliquot 100 μL in Eppendorf-buizen en opslag bij −80 °C.
    3. Ontdooi een aliquot van trombine-specifiek fluorogeen substraat 10 minuten bij kamertemperatuur voordat je het gebruikt. Vortex en blijf op ijs tijdens het experiment.
    4. Los de inhoud van één buisje plasminesubstraat (CBZ-L-Phe-Arg-rhodamine) op in 1.955 μL DMSO.
      OPMERKING: De doos bevat een folder met een analysecertificaat. Het volume buffer dat toegevoegd moet worden hangt af van de gespecificeerde concentratie en moet worden aangepast zodat 1 μL toegevoegd menselijk plasmin in 120 μL reagens een uiteindelijke concentratie van 200 nmol/L oplevert.
    5. Aliquot 60 μL in Eppendorf-buizen en opslag bij −80 °C.
    6. Ontdooi een aliquot van plasmine-specifiek fluorogeen substraat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voordat je het gebruikt. Vortex en houd deze op kamertemperatuur tijdens het experiment.
      OPMERKING: Dit substraat is opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) en mag niet worden afgekoeld om neerslag te voorkomen.
  3. Bereid triggerreagentia voor
    1. Reconstrueren de gelyofilieerde cefaline door 1 ml gedestilleerd water toe te voegen. Vortex grondig totdat het volledig is opgelost.
      OPMERKING: Cefaline wordt gereconstitueerd om fosfolipiden te leveren, die essentieel zijn om meerdere stollingsreacties te katalyseren en zo fysiologisch relevante stolling in de assay mogelijk te maken.
    2. Aliquot 60 μL in Eppendorf-buizen (voldoende voor 20 putten) en opgeslagen bij −20 °C.
    3. Ontdooi een aliquot voor gebruik en laat het ijskoud staan. Vortex kort voordat het pipetten.
    4. Reconstrueren de inhoud van één flesje recombinant menselijk weefselfactor (TF) in 4 ml gedestilleerd water.
    5. Aliquot 60 μL in Eppendorf-buizen en opslag bij −80 °C.
    6. Ontdooi kort een aliquot van TF en vortex.
    7. Bereid een verdunning van TF van 1:500 voor door sequentiële verdunning:
      1. Voeg 6 μL TF toe aan 54 μL TBS-buffer. Vortex.
      2. Neem 6 μL van deze verdunning en voeg 54 μL TBS toe. Vortex.
      3. Neem 20 μL van deze tweede verdunning en voeg 80 μL TBS toe om een uiteindelijke concentratie van 0,28 pM te bereiken. Vortex.
    8. Reconstrueren van de inhoud van één buisje (20 mg) weefseltype plasminogenactivator (tPA) in 20 mL gedestilleerd water om een uiteindelijke concentratie van 580.000 IU/mL te verkrijgen (verifiseer batch-specifieke concentratie).
    9. Aliquot 50 μL in Eppendorf-buizen en opgeslagen bij −80 °C.
    10. Ontdooi kort een aliquot van tPA en vortex.
    11. Bereid een verdunning van tPA van 1:50 voor door 20 μL tPA toe te voegen aan 980 μL Tris-NaCl buffer, waarmee een uiteindelijke concentratie van 11.600 IU/mL wordt bereikt. Vortex.
  4. Bereid plasmamonsters voor
    1. Verzamel veneus bloed in 3 mL citraatbuizen met 3,2% citraat, waarbij minimaal 2,7 mL (90% vulling) wordt afgenomen.
    2. Gebruik de eerste buis niet na venipunktie; Gooi het weg om activatie door weefselfactor te voorkomen.
    3. Draai de buis minstens 10 keer direct na het verzamelen om.
    4. Centrifugeer binnen 2 uur op kamertemperatuur, eerst op 2.500 × g gedurende 5 minuten, gevolgd door 10.000 × g gedurende 10 minuten.
    5. Gebruik een wegwerppipet om het plasma net boven de cellaag op te vangen.
    6. Aliquot plasma in gelabelde cryovialen, snap-freeze in vloeibare stikstof en bewaar bij −80 °C.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het monster vrij is van stolsels. Gebruik alleen verse of eenmaal ontdooide plasma. Eén CTAD-buis is voldoende voor duplicaatanalyse.

2. Instrumentvoorbereiding en software-installatie

  1. Bereid de fluorescentieplaatlezer voor
    1. Zet de platenlezer aan en laat deze in evenwicht komen tot 37 °C.
    2. Stel de volgende basisparameters in:
      1. Greiner 96-well, plat-bottom, zwart.
      2. Algemene instellingen: Positioneringsvertraging: 0,1 s; Aantal kinetische vensters: 1.
      3. Kinetisch venster: Aantal cycli: 140; Starttijd van de meting: 0,0 s; Aantal flashes per put per cyclus: 10; Cyclustijd: 30 seconden.
      4. Optisch: Topoptiek
      5. Filterinstellingen: Aantal monochromatische filters: 2. Excitatiefilter: 355 nm voor trombine; 485 nm voor plasmine. Emissiefilter: 460 nm voor trombine, 520 nm voor plasmine. Winst: 600.
    3. Definieer de indeling met maximaal 20 putten per plaat.
    4. Ga naar Concentraties/Volumes/Trillen en bevestig de volgende instellingen. Pomp 1 = 20 μL; Pomp 2 = 0 μL; Snelheid = 420 μL/s.
  2. Bereid het injectiesysteem voor
    1. Verwijder en spoel de injectienaalden in een container met buffer.
    2. Stel het spoelvolume in op 2.500 μL en spoel de pompen met 37 °C Tris/NaCl buffer.
    3. Reset het spoelvolume naar 500 μL.

3. Assay-opstelling in microplaatformaat

  1. Microplaat-shaker opstelling
    1. Stel de microplaatschudder in op 37 °C en controleer de temperatuur voor gebruik.
    2. Stel de schudsterkte in op 1100 rpm.
    3. Gebruik deze shaker voor alle mengstappen in de assay om homogene distributie van reagens en consistente enzymatische activiteit te waarborgen.
  2. Voeg reagentia toe aan de putten
    1. Ontdooi patiëntplasma en normaal gepoold plasma (NPP) in een 37 °C waterbad tot maximaal 10 minuten.
    2. Meng grondig en controleer volledige ontdooiing (geen cryoprecipitaat).
    3. Voeg 80 μL patiëntplasma of NPP toe aan de vooraf geselecteerde putten. Gebruik voor elk monster een verse pipettip.
      OPMERKING: Neem bij elke assay-uitvoering een NPP-monster op om rekening te houden met variabiliteit tussen de runs (zie verder in stap 5.6).
    4. Voeg 2 μL cephalin toe.
    5. Voeg 2 μL weefselfactor toe (1:500 verdunning). Meng kort met een bordshaker.
    6. Voeg 10 μL Tris-NaCl buffer toe. Meng kort met een bordshaker.
    7. Voeg 4 μL trombinesubstraat toe.
    8. Voeg 2 μL plasminesubstraat toe. Meng kort met een bordshaker.
  3. Voorincubatie
    1. Steek de microplaat in de plaatlezer.
    2. Laat de plaat enkele minuten in evenwicht komen bij 37 °C.

4. Bereiding en injectie van het startreagens

  1. Bereid het reagens voor voor pomp 1
    1. Combineer 672 μL Tris/NaCl-buffer, 192 μL Tris/NaCl/CaCl₂-buffer en 96 μL tPA (vanaf stap 1.2.5). Vortex grondig.
    2. Steek twee gaten in de dop van de reagensbuis.
    3. Steek de pompslang door één gat naar de onderkant van de buis.
  2. Prim en start de assay
    1. Gebruik de software om de pomp te primen met 500 μL van het reagens.
    2. Plaats de injectienaalden weer in hun aangewezen positie.
    3. Begin onmiddellijk met de fluorescentiemeting.
  3. Handmatige start van de assay
    OPMERKING: Deze handmatige initiatieprocedure biedt een alternatief voor de geautomatiseerde injectieworkflow zoals beschreven in stappen 2.2, 4.1 en 4.2.
    1. Bereid het startreagens voor zoals beschreven in 4.1.1 direct voor gebruik.
    2. Verwijder de microplaat van de plaatlezer en voeg snel handmatig 20 μL van het startreagens toe aan elke put met behulp van een gekalibreerde pipet of multikanaalpipet voor snellere behandeling.
    3. Geef de plaat onmiddellijk terug aan de lezer en start de fluorescentiemeting zonder vertraging.
      OPMERKING: Minimaliseer de tijd tussen toevoeging van reagens en het starten van de meting (<10 s per rij) om variabiliteit te verminderen.
  4. Kinetische uitlezing
    1. Neem elke 30 seconden fluorescentie op gedurende 70 minuten.
    2. Houd de plaat tijdens de meting op 37 °C.

5. Data-analyse

  1. Bereid de data voor voor analyse
    1. Exporteer de kinetische fluorescentiegegevens van de plaatlezer als een tabel met tijdstippen en fluorescentiewaarden per put.
    2. Zet de ruwe fluorescentiegegevens om in enzymgeneratiecurves door de eerste afgeleide te berekenen met Excel of een ander programma.
    3. Plot de enzymgeneratiecurves voor elke put om de enzymatische reactie te visualiseren.
      OPMERKING: Deze curves geven de snelheid van trombine- of plasmingeneratie over tijd weer en komen overeen met de grafische output die in de figuren wordt getoond.
  2. Analyseer trombinegeneratiecurves
    1. Identificeer de volgende parameters van de trombinegeneratiecurve (zie Figuur 1):
      1. Vertragingstijd: Het tijdstip waarop de trombinegeneratiecurve consequent stijgt en 8% van de tophoogte van de trombine bereikt.
      2. Trombinepiekhoogte: De maximale signaalwaarde op de y-as (d.w.z. maximale trombinegeneratiesnelheid).
      3. Thrombinepiek: De tijd vanaf het begin van de test tot de thrombinepiekhoogte.
      4. Trombinepotentiaal (oppervlakte onder de trombinegeneratiecurve): Het gebied onder de curve vanaf de vertragingstijd totdat het trombinesignaal terugkeert naar de basislijn.
        OPMERKING: Het trombinepotentiaal weerspiegelt de totale trombine-genererende capaciteit van het monster onder assayomstandigheden.
  3. Analyseer plasminegeneratiecurves
    1. Identificeer de volgende parameters uit de plasmingeneratiecurve (zie Figuur 2):
      1. Fibrine-lysetijd: De tijd vanaf het begin van plasminvorming (d.w.z. het moment waarop de plasmingeneratiecurve consequent stijgt en 8% van de plasminpiekhoogte bereikt) tot het punt waarop de plasminepiek wordt bereikt.
      2. Plasminpiekhoogte: Het eerste duidelijke maximum in de curve, overeenkomend met de initiële burst in plasmingeneratie, wordt bepaald op het punt waarop de tweede afgeleide van de plasmingeneratiecurve (gebaseerd op een drie-minuten voortschrijdend gemiddelde) nul bereikt na het begin van plasmingeneratie.
      3. Plasminepotentiaal (oppervlakte onder de plasmingeneratiecurve): Het gebied onder de curve vanaf het begin van plasmingeneratie tot het moment van de plasminpiek.
        OPMERKING: Signaalfluctuaties treden wel op na de initiële plasminpiek en worden niet meegenomen in de analyse van de plasminegeneratieparameters.
  4. Haal parameters handmatig uit of met aangepaste software
    1. Gebruik Microsoft Excel, GraphPad Prism of een aangepast script (bijvoorbeeld in Python of R) om kinetische parameters te extraheren.
    2. Bewaar de ruwe data, uitgezette krommen en berekende parameters in een gestructureerd formaat voor archivering en toekomstige referentie.
      OPMERKING: Als je macro's gebruikt, controleer dan de correctheid van alle parameters visueel en handmatig voordat je vertrouwt op geautomatiseerde uitvoer. Onze macro voor dataconversie is op aanvraag beschikbaar.
  5. Standaardisatie en normalisatie
    1. Stel een fysiologische referentie vast door 40 individuele monsters van gezonde donoren te meten parallel aan het NPP-monster dat voor normalisatie wordt gebruikt. Voer deze stap één keer per NPP-batch uit.
    2. Bereken de gemiddelde trombine- en plasmingeneratieparameters van de gezonde donoren en bepaal hun verhouding tot de overeenkomstige NPP-waarden die in dezelfde run zijn verkregen.
    3. Voor elk patiëntenmonster in een bepaalde run normaliseert u eerst de trombine- of plasminegeneratieparameter naar de NPP-waarde die in diezelfde run is gemeten.
    4. Deel dit resultaat door de gezonde donor-tot-NPP-verhouding die eerder voor dezelfde NPP-batch is vastgesteld (zie stap 5.6.2). Dit levert een relatieve waarde op die genormaliseerd is naar het gemiddelde gezonde individu, met standaardisatie voor inter-run variatie met behulp van NPP.
    5. Druk parameterwaarden uit als percentages ten opzichte van de gemiddelde waarde van gezonde individuen (gedefinieerd als 100%). Presenteer de resultaten van de patiëntmonster dienovereenkomstig.
      OPMERKING: De relatieve parameterwaarden voor elk individueel patiëntenmonster worden berekend met de volgende formule, waarbij run a verwijst naar de meetrun van het patiëntenmonster, en run b naar de referentierun waarbij gezonde donormonsters parallel werden gemeten met dezelfde NPP-batch. Ons Excel-bestand met de berekeningen voor datanormalisatie is op aanvraag beschikbaar.
      figure-protocol-1

6. Generatie van kalibratiecurves

  1. Bereid de trombinekalibratiecurve voor
    1. Reconstrueren de gelyofilieerde menselijke α-trombine zoals aangegeven in het datasheet van de fabrikant.
      OPMERKING: Als het datasheet bijvoorbeeld reconstitutie in 100 μL water specificeert om 3,34 mg/mL te leveren, komt dit overeen met 0,334 mg in 100 μL.
    2. Verdun de gereconstitueerde trombine met 1:10 in Tris/NaCl-buffer.
      OPMERKING: Dit levert een standaardconcentratie op van ongeveer 9,1 nmol/mL (0,0091 nmol/μL), gebaseerd op een molecuulgewicht van 36.700 g/mol.
    3. Bereid een verdunningsreeks voor in de Tris/NaCl-buffer om de uiteindelijke trombineconcentraties in de assay te bereiken variërend van 0 tot 152 nmol/L.
    4. Pipette-trombine in geselecteerde putten die al buffer bevatten om een totaalvolume van 100 μL per put te bereiken.
    5. Bereid de substraatoplossing voor Pomp 1 voor door 300 μL Tris/NaCl-buffer te mengen met 200 μL trombinesubstraat uit stap 1.2.2.
    6. Verdunn deze oplossing verder door 400 μL van het mengsel te combineren met 360 μL Tris/NaCl-buffer.
    7. Voeg 20 μL van deze substraatmix toe aan elke kalibratieput, waardoor het totale assayvolume op 120 μL komt.
    8. Meng de plaat voorzichtig en steek hem in de plaatlezer. Voer de kinetische assay 25 cycli uit, met dezelfde fluorescentie-instellingen als beschreven in sectie 2.
    9. Exporteer de ruwe fluorescentiegegevens en bepaal de initiële helling (snelheid van toename van fluorescentie per cyclus) voor elke trombineconcentratie met behulp van GraphPad Prism of vergelijkbare software.
    10. Genereer een standaardcurve door de initiële helling ten opzichte van de trombineconcentratie uit te zetten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat alle buffers voorverwarmd zijn tot 37 °C en dat enzymen op ijs worden behandeld. Maak altijd verse verdunningen en meng grondig. De resulterende standaardcurve wordt gebruikt om de relatieve trombineactiviteit in onbekende monsters te berekenen met behulp van de macro beschreven in sectie 5.
  2. Voorbereiding van de plasminkalibratiecurve
    1. Reconstrueren gelyofilieerd plasmin in gedestilleerd water (bijv. 0,543 mL) volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Plasmine heeft een molecuulgewicht van 75.400 g/mol. De resulterende voorraadconcentratie is ongeveer 24,3 nmol/mL (0,024 nmol/μL), uitgaande van 1 mg in 0,543 mL.
    2. Bereid een verdunningsreeks voor in de Tris/NaCl-buffer om de uiteindelijke plasmineconcentraties in de assay te bereiken variërend van 66 tot 532 nmol/L.
    3. Pipetteer plasmine in putten met een Tris/NaCl-buffer om een eindvolume van 100 μL per put te bereiken.
    4. Bereid de substraatoplossing voor Pomp 1 voor door 680 μL Tris/NaCl-buffer te mengen met 80 μL plasmine/rhodamine-substraat (voorverdund 1:1 indien nodig) vanaf stap 1.2.5.
    5. Voeg 20 μL van deze substraatoplossing toe aan elke kalibratieput, waardoor het totale volume op 120 μL komt.
    6. Meng de plaat voorzichtig en steek hem in de plaatlezer. Voer de kinetische assay 25 cycli uit met dezelfde fluorescentie-instellingen als beschreven in Sectie 2.
    7. Exporteer de ruwe fluorescentiegegevens en bepaal de initiële helling van de fluorescentietoename voor elke plasmineconcentratie door lineaire regressie toe te passen op de lineaire fase van de kinetische kromme met behulp van GraphPad Prism of vergelijkbare software.
    8. Genereer een standaardcurve door de initiële helling versus plasminconcentratie uit te zetten.
      OPMERKING: Vanwege variatie in plasmineactiviteit per batch moet de kalibratie bij elke nieuwe batch worden herhaald. Als er onverwacht hoge activiteit wordt waargenomen, wordt een 1:2 verdunning van de voorraad aanbevolen voordat de kalibratiereeks wordt voorbereid.
  3. Gebruik de kalibratiecurve voor kwantificatie
    1. Gebruik de kalibratiecurves die in Sectie 6 zijn gegenereerd om fluorescentiehellingswaarden om te zetten in relatieve enzymactiviteit.
    2. Gebruik alleen het lineaire deel van de kalibratiecurve voor het interpoleren van onbekende monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vertegenwoordigende trombine- en plasminegeneratiecurves verkregen met de Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) worden weergegeven in Figuur 3. De signaalintensiteit van elke curve wordt uitgedrukt als een percentage ten opzichte van het gelijktijdig gemeten normale pooled plasma (NPP) monster. Een monster met NPP wordt bij elke run opgenomen als interne controle om de geldigheid van de assay te verifiëren en de vergelijkbaarheid tussen runs te waarborgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) is een fluorogene test met twee enzymen die gelijktijdige, tijdsgebonden metingen van trombine- en plasminegeneratie in bloedplaatarme plasma mogelijk maakt. Door beide processen in één put vast te leggen, faciliteert de methode een hoge-resolutie kinetische analyse van secundaire hemostase en fibrinolyse. Deze dubbele meting biedt duidelijke methodologische voordelen ten opzichte van conventionele assays en is met succes toegepast in de studie van teko...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.L. van Heerde is oprichter en medewerker van Enzyre BV en mede-eigenaar van Van Heerde Holding BV, aandeelhouder van Enzyre. Enzyre heeft financiering ontvangen voor contractonderzoek van Takeda en Novo Nordisk. W.L van Heerde heeft ook reissubsidies ontvangen van SOBI en CAF-DCF. De overige auteurs geven geen concurrerende financiële belangen aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de doelstellingen van EuroBloodNet.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
Calciumchloridedihydraat (CaCl2.2H2O)Merck1.02382
Cephaline (C.K. Prest 5 APTT reagent kit)Stago00847Stabiel gedurende 6 maanden bij -20 °C. 
Gedestilleerd waterNoteer de datum van opening. Gebruik binnen 1 dag na eerste opening.
Dimethylsulfoxide (DMSO)Merck1.02950.0500
Humaan alfa-trombineEnzyme Research LaboratoriesHT 1002aDe doos bevat een bijsluisbrief met een certificaat van analyse. Het volume buffer dat moet worden toegevoegd, is afhankelijk van de opgegeven concentratie en moet worden aangepast zodat 1 µL toegevoegde humane trombine in 120 µL reagens een eindconcentratie van 76 nmol/L oplevert.
Humaan plasmineEnzyme Research LaboratoriesHPlasDe doos bevat een bijsluisbrief met een certificaat van analyse. Het volume buffer dat moet worden toegevoegd, is afhankelijk van de opgegeven concentratie en moet worden aangepast zodat 1 µL toegevoegde humane plasmine in 120 µL reagens resulteert in een eindconcentratie van 200 nmol/L.
Normaal gepoold plasmaIn-house bereidingNiet van toepassingStabiel gedurende 3 uur na ontdooien als het op ijs wordt bewaard.
PatiëntenplasmaNiet van toepassingNiet van toepassing
Plasmine substraat (CBZ-L-fenylalanine-L-arginine amide)-rodamine-morfolino ureumSymeresStabiel gedurende 6 maanden bij -80 °C. 
Recombinant humaan weefselfactor (TF): InnovinDade BehringB4212Stabiel gedurende 6 maanden bij -80 °C. 
Recombinant weefsel-type plasminogenaar activator (tPA): Alteplase/ActilyseBoehringer IngelheimStabiel gedurende 12 maanden bij -80 °C. 
Tris(hydroxylmethyl)aminomethaan (H2NC(CH2OH)3)Merck1.08382.2500
Tris-NaCl buffer, pH 7,4 (TBS)In-house bereidingNiet van toepassing
Tris-NaCl-CaCl2 buffer, pH 7,4 (TBS-Ca)In-house bereidingNiet van toepassing
Trombine substraat Bz-bèta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-methylcoumarineSymeresStabiel gedurende 6 maanden bij -80 °C. 
Apparatuur
Fluostar Optima fluorimeter / microplaatlezer met temperatuurregeling en reagentinjectorsBMG Labtech
96-wells microplaat, polystyreen, vlakke bodem, zwart, medium bindingsoppervlak (Microlon equivalent)Greiner BIO-ONE655076
Analytische weegschaal (bovenlader)
Blauwe pipettetips (voor 100-1000 µL)
Citraat Bloedverzamelbuisjes 3mL (3,2% Citraat)BD Vacutainer
IJsemmer
IJsmachine
Incubator / microplaat shaker
Magneetroerder
Microcentrifugebuisjesrek
Microcentrifugebuisjes, afsluitbaar
pH-meter
Pipettips 0,1-10 µL, niet-steriel
Pipetten (2, 10, 20, 100 en 1000 µL)
Schroevendraaier (gebruikt als sonde)
Buismixer
Waterbad
Gele pipettetips (voor 20-200 µL)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chapin, J. C., Hajjar, K. A. Fibrinolysis and the control of blood coagulation. Blood Rev. 29 (1), 17-24 (2015).
  2. Furie, B. Pathogenesis of thrombosis. Hematology. 2009 (1), 255-258 (2009).
  3. Teruya, J., et al. A normal aPTT does not guarantee adequate coagulation factor levels. Anesthesiology. 94 (3), 542(2001).
  4. Puetz, J., Hugge, C., Moser, K. Normal aPTT in children with mild factor XI deficiency. Pediatr Blood Cancer. 65 (4), pbc.26910(2018).
  5. Toulon, P., et al. In vitro sensitivity of different activated partial thromboplastin time reagents to mild clotting factor deficiencies. Int J Lab Hematol. 38 (4), 389-396 (2016).
  6. Massignon, D., et al. Prothrombin time sensitivity and specificity to mild clotting factor deficiencies of the extrinsic pathway:evaluation of eight commercial thromboplastins. Thromb Haemost. 75 (4), 590-594 (1996).
  7. Burns, E. R., et al. Paradoxic effect of multiple mild coagulation factor deficiencies on the prothrombin time and activated partial thromboplastin time. Am J Clin Pathol. 100 (2), 94-98 (1993).
  8. van Geffen, M., et al. A novel hemostasis assay for the simultaneous measurement of coagulation and fibrinolysis. Hematology. 16 (6), 327-336 (2011).
  9. van Geffen, M., et al. Pharmacodynamics of recombinant activated factor VII and plasma-derived factor VII in a cohort of severe FVII deficient patients. Thromb Res. 132 (1), 116-122 (2013).
  10. Hemker, H. C., et al. The calibrated automated thrombogram (CAT):a universal routine test for hyper- and hypocoagulability. Pathophysiol Haemost Thromb. 32 (5-6), 249-253 (2002).
  11. Kristensen, S. R., et al. Thrombin generation measured on ST Genesia, a new platform in the coagulation routine lab:assessment of analytical and between-subject variation. Res Pract Thromb Haemost. 6 (1), e12654(2022).
  12. Hemker, H. C., Béguin, S. Phenotyping the clotting system. Thromb Haemost. 84 (5), 747-751 (2000).
  13. Tripodi, A. Thrombin generation assay and its application in the clinical laboratory. Clin Chem. 62 (5), 699-707 (2016).
  14. Valke, L., et al. Fibrinolytic assays in bleeding of unknown cause:improvement in diagnostic yield. Res Pract Thromb Haemost. 6 (2), e12681(2022).
  15. van Geffen, M., van Heerde, W. L. Global haemostasis assays, from bench to bedside. Thromb Res. 129 (6), 681-687 (2012).
  16. Luddington, R. J. Thrombelastography/thromboelastometry. Clin Lab Haematol. 27 (2), 81-90 (2005).
  17. Hartmann, J., et al. Viscoelastic testing:an illustrated review of technology and clinical applications. Res Pract Thromb Haemost. 7 (1), 100031(2023).
  18. Schoeman, R. M., et al. Flow chamber and microfluidic approaches for measuring thrombus formation in genetic bleeding disorders. Platelets. 28 (5), 463-471 (2017).
  19. Bavinck, A. P., et al. Viscoelastic testing in patients with very rare bleeding disorders of secondary hemostasis:a scoping review. Thromb Res. 2025, 109449(2025).
  20. Mansouritorghabeh, H., et al. The utility of total thrombus-formation analysis system (T-TAS) in the thrombosis and hemostasis field:a scoping review. Int J Lab Hematol. 47 (2), 201-211 (2025).
  21. Lecchi, A., et al. Flow-chamber device (T-TAS) to diagnose patients suspected of platelet function defects. Blood Transfus. 22 (1), 55-64 (2024).
  22. Zekavat, O. R., et al. Comparison of thrombin generation assay with conventional coagulation tests in evaluation of bleeding risk in patients with rare bleeding disorders. Clin Appl Thromb Hemost. 20 (6), 637-644 (2014).
  23. Brummel-Ziedins, K. E., et al. Thrombin generation and bleeding in haemophilia A. Haemophilia. 15 (5), 1118-1125 (2009).
  24. Al Dieri, R., et al. Thrombin generation:what have we learned. Blood Rev. 26 (5), 197-203 (2012).
  25. Binder, N. B., et al. Clinical use of thrombin generation assays. J Thromb Haemost. 19 (12), 2918-2929 (2021).
  26. Verhagen, M. J. A., et al. In patients with hemophilia, a decreased thrombin generation profile is associated with a severe bleeding phenotype. Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100062(2023).
  27. Haisma, B., et al. Enhanced thrombin and plasmin generation profiles in alpha-2-antiplasmin-deficient patients:data from the Rare Bleeding Disorders in the Netherlands study. Res Pract Thromb Haemost. 8 (7), 102604(2024).
  28. Haisma, B., et al. Comparative analysis of thrombin generation platforms for patients with coagulation factor deficiencies:a comprehensive assessment. Thromb Res. 240, 109045(2024).
  29. van Geffen, M., et al. Retrospective evaluation of bleeding tendency and simultaneous thrombin and plasmin generation in patients with rare bleeding disorders. Haemophilia. 18 (4), 630-638 (2012).
  30. Haisma, B., et al. genotype, and laboratory assessment of congenital fibrinogen disorders:data from the Rare Bleeding Disorders in the Netherlands study. Thromb Res. 249, 109317(2025).
  31. Bouma, B. N., Meijers, J. C. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI, plasma procarboxypeptidase B, procarboxypeptidase R, procarboxypeptidase U). J Thromb Haemost. 1 (7), 1566-1574 (2003).
  32. Marx, P. F. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor. Curr Med Chem. 11 (17), 2335-2348 (2004).
  33. Rijken, D. C., Lijnen, H. R. New insights into the molecular mechanisms of the fibrinolytic system. J Thromb Haemost. 7 (1), 4-13 (2009).
  34. Depasse, F., et al. Thrombin generation assays are versatile tools in blood coagulation analysis:a review of technical features, and applications from research to laboratory routine. J Thromb Haemost. 19 (12), 2907-2916 (2021).
  35. Subcommittee on Control of Anticoagulation of the SSC of the ISTH. Towards a recommendation for the standardization of the measurement of platelet-dependent thrombin generation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1859-1861 (2011).
  36. Duarte, R. C. F., et al. Standardization and evaluation of the performance of the thrombin generation test under hypo- and hypercoagulability conditions. Hematol Transfus Cell Ther. 41 (3), 244-252 (2019).
  37. Dargaud, Y., et al. Effect of standardization and normalization on imprecision of calibrated automated thrombography:an international multicentre study. Br J Haematol. 139 (2), 303-309 (2007).
  38. Ninivaggi, M., et al. Recommendations for the measurement of thrombin generation:communication from the ISTH SSC Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibodies. J Thromb Haemost. 19 (5), 1372-1378 (2021).
  39. Duchemin, J., et al. Influence of coagulation factors and tissue factor concentration on the thrombin generation test in plasma. Thromb Haemost. 99 (4), 767-773 (2008).
  40. Miszta, A., et al. A high-fat diet delays plasmin generation in a thrombomodulin-dependent manner in mice. Blood. 135 (19), 1704-1717 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Trombinegeneratiehemostatische balansstollingsanalysefibrinolyseanalyseplaatjesarm plasmafluorescentieplaatlezerweefselfactor

Gerelateerde artikelen