Dit protocol beschrijft de Nijmegen Hemostasis Assay, die gelijktijdige, tijdsgebonden meting van trombine- en plasmingeneratie mogelijk maakt om een geïntegreerde beoordeling van stolling en fibrinolyse te bieden. De assay heeft als doel de karakterisering van het hemostatische evenwicht in onderzoek en klinische omgevingen te verbeteren, buiten het bereik van conventionele hemostatische tests.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De Nijmegen Hemostasis-assay: gelijktijdige fluorogene meting van trombine- en plasminegeneratie in één put
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Trombine en plasmine spelen beide een centrale rol in hemostase, waarbij ze respectievelijk de stolling en fibrinolyse reguleren. Conventionele hemostatische assays richten zich vaak op geïsoleerde componenten of beperkte fasen van hemostase; Zo evalueren geactiveerde partiële tromboplastinetijd en protrombinetijd alleen de initiatie van fibrinevorming, terwijl factoractiviteitsassays de functie van individuele stollingsfactoren beoordelen. Hoewel waardevol, missen deze assays een volledig beeld van het algehele proces van secundaire hemostase en fibrinolyse, die zich dynamisch in de loop van de tijd ontvouwen. De Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) pakt deze beperking aan door gelijktijdige, tijdsgebonden meting van trombine- en plasmingeneratie in één microplaatput mogelijk te maken. Door gebruik te maken van twee synthetische fluorogene substraten met verschillende excitatie- en emissiespectra en zonder kruisreactiviteit, maakt de assay een nauwkeurige kwantificering van beide enzymen parallel mogelijk. Hemostase wordt gestart in bloedplaatjesarm plasma met behulp van weefselfactor, calcium- en weefseltype plasminogenactivator, en fluorescentie wordt elke 30 seconden geregistreerd over 70 minuten bij 37 °C. Enzymactiviteitscurves worden gegenereerd met behulp van kalibratiestandaarden, waaruit parameters zoals vertragingstijd, trombinepotentiaal, fibrine-lysetijd en plasminpiekhoogte worden afgeleid. De assay vangt betrouwbaar gelijktijdige trombine- en plasmineproductie met goede precisie binnen en tussen de assay en detecteert modulatie van stolling en fibrinolyse door effectoren zoals heparine, geactiveerd eiwit C en epsilon-aminocaproïnezuur. In klinische monsters werd significant verminderde trombineproductie waargenomen bij patiënten met stollingsfactortekorten, terwijl patiënten met fibrinolytische aandoeningen verhoogde plasminegeneratieprofielen vertoonden. Door metingen van trombine- en plasmingeneratie te combineren, biedt de NHA een uitgebreid inzicht in het hemostatische evenwicht buiten conventionele assays. Deze geïntegreerde aanpak biedt veelbelovend onderzoek en klinische toepassingen, zoals de karakterisering van hemostatische fenotypen, beoordeling van bloedingen en trombotisch risico, en monitoring van gerichte therapeutische interventies. Dit protocol beschrijft de NHA-procedure die tot doel heeft het begrip en de beoordeling van het hemostatische evenwicht te vergroten.
Inleiding
Hemostase is het resultaat van een dynamische balans tussen stolling en fibrinolyse. Trombine en plasmine zijn de belangrijkste enzymen die deze processen aansturen: trombine zet fibrinogeen om in fibrine, terwijl plasmine fibrine afbreekt om stolsels op te lossen. Verstoring van dit evenwicht kan leiden tot bloedingen of trombotische gebeurtenissen 1,2. De laboratoriumtests die in de klinische praktijk worden gebruikt om hemostase te evalueren, richten zich doorgaans op geïsoleerde stappen van stolling of fibrinolyse, wat slechts beperkt inzicht geeft in de algehele hemostati....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures waarbij menselijk plasma werden uitgevoerd, werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de medische ethische commissie van Arnhem-Nijmegen. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle donoren voorafgaand aan de monsterafname.
1. Voorbereiding van buffers, reagentia en plasmamonsters
- Bereid bufferoplossingen voor
- Weeg 1,2 g Tris (p.a.) en los op in 180 mL van 0,9% NaCl.
- Stel de pH aan naar 7,4 met HCl.
- Breng het uiteindelijke volume naar 200 mL met 0,9% NaCl om een 50 mM Tris-150 m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vertegenwoordigende trombine- en plasminegeneratiecurves verkregen met de Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) worden weergegeven in Figuur 3. De signaalintensiteit van elke curve wordt uitgedrukt als een percentage ten opzichte van het gelijktijdig gemeten normale pooled plasma (NPP) monster. Een monster met NPP wordt bij elke run opgenomen als interne controle om de geldigheid van de assay te verifiëren en de vergelijkbaarheid tussen runs te waarborgen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) is een fluorogene test met twee enzymen die gelijktijdige, tijdsgebonden metingen van trombine- en plasminegeneratie in bloedplaatarme plasma mogelijk maakt. Door beide processen in één put vast te leggen, faciliteert de methode een hoge-resolutie kinetische analyse van secundaire hemostase en fibrinolyse. Deze dubbele meting biedt duidelijke methodologische voordelen ten opzichte van conventionele assays en is met succes toegepast in de studie van teko.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
W.L. van Heerde is oprichter en medewerker van Enzyre BV en mede-eigenaar van Van Heerde Holding BV, aandeelhouder van Enzyre. Enzyre heeft financiering ontvangen voor contractonderzoek van Takeda en Novo Nordisk. W.L van Heerde heeft ook reissubsidies ontvangen van SOBI en CAF-DCF. De overige auteurs geven geen concurrerende financiële belangen aan.
Dankbetuigingen
Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de doelstellingen van EuroBloodNet.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materiaal | |||
| Calciumchloridedihydraat (CaCl2.2H2O) | Merck | 1.02382 | |
| Cephaline (C.K. Prest 5 APTT reagent kit) | Stago | 00847 | Stabiel gedurende 6 maanden bij -20 °C. |
| Gedestilleerd water | Noteer de datum van opening. Gebruik binnen 1 dag na eerste opening. | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Merck | 1.02950.0500 | |
| Humaan alfa-trombine | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | De doos bevat een bijsluisbrief met een certificaat van analyse. Het volume buffer dat moet worden toegevoegd, is afhankelijk van de opgegeven concentratie en moet worden aangepast zodat 1 µL toegevoegde humane trombine in 120 µL reagens een eindconcentratie van 76 nmol/L oplevert. |
| Humaan plasmine | Enzyme Research Laboratories | HPlas | De doos bevat een bijsluisbrief met een certificaat van analyse. Het volume buffer dat moet worden toegevoegd, is afhankelijk van de opgegeven concentratie en moet worden aangepast zodat 1 µL toegevoegde humane plasmine in 120 µL reagens resulteert in een eindconcentratie van 200 nmol/L. |
| Normaal gepoold plasma | In-house bereiding | Niet van toepassing | Stabiel gedurende 3 uur na ontdooien als het op ijs wordt bewaard. |
| Patiëntenplasma | Niet van toepassing | Niet van toepassing | |
| Plasmine substraat (CBZ-L-fenylalanine-L-arginine amide)-rodamine-morfolino ureum | Symeres | Stabiel gedurende 6 maanden bij -80 °C. | |
| Recombinant humaan weefselfactor (TF): Innovin | Dade Behring | B4212 | Stabiel gedurende 6 maanden bij -80 °C. |
| Recombinant weefsel-type plasminogenaar activator (tPA): Alteplase/Actilyse | Boehringer Ingelheim | Stabiel gedurende 12 maanden bij -80 °C. | |
| Tris(hydroxylmethyl)aminomethaan (H2NC(CH2OH)3) | Merck | 1.08382.2500 | |
| Tris-NaCl buffer, pH 7,4 (TBS) | In-house bereiding | Niet van toepassing | |
| Tris-NaCl-CaCl2 buffer, pH 7,4 (TBS-Ca) | In-house bereiding | Niet van toepassing | |
| Trombine substraat Bz-bèta-Ala-Gly-Arg-7-amino-4-methylcoumarine | Symeres | Stabiel gedurende 6 maanden bij -80 °C. | |
| Apparatuur | |||
| Fluostar Optima fluorimeter / microplaatlezer met temperatuurregeling en reagentinjectors | BMG Labtech | ||
| 96-wells microplaat, polystyreen, vlakke bodem, zwart, medium bindingsoppervlak (Microlon equivalent) | Greiner BIO-ONE | 655076 | |
| Analytische weegschaal (bovenlader) | |||
| Blauwe pipettetips (voor 100-1000 µL) | |||
| Citraat Bloedverzamelbuisjes 3mL (3,2% Citraat) | BD Vacutainer | ||
| IJsemmer | |||
| IJsmachine | |||
| Incubator / microplaat shaker | |||
| Magneetroerder | |||
| Microcentrifugebuisjesrek | |||
| Microcentrifugebuisjes, afsluitbaar | |||
| pH-meter | |||
| Pipettips 0,1-10 µL, niet-steriel | |||
| Pipetten (2, 10, 20, 100 en 1000 µL) | |||
| Schroevendraaier (gebruikt als sonde) | |||
| Buismixer | |||
| Waterbad | |||
| Gele pipettetips (voor 20-200 µL) |
Referenties
- Chapin, J. C., Hajjar, K. A. Fibrinolysis and the control of blood coagulation. Blood Rev. 29 (1), 17-24 (2015).
- Furie, B. Pathogenesis of thrombosis. Hematology. 2009 (1), 255-258 (2009).
- Teruya, J., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
