Methodenartikel

Een stapsgewijze procedure voor het produceren van kiemlijnchimera bij kip via primordiale kiemceltransplantatie

778 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69704

⸱

5 december 2025

 ,  , 
1Department of Agricultural Biotechnology and Research Institute of Agriculture and Life Sciences, Seoul National University, 2Department of International Agricultural Technology & Institute of Green Bioscience and Technology, Seoul National University

In dit artikel

Samenvatting

Vogelkiemlijnchimera's, gegenereerd door de transplantatie van oerkiemcellen (PGC's) in ontvangende embryo's, maken toepassingen mogelijk in transgenese, genbewerking en soortbehoud. Dit protocol beschrijft procedures voor PGC-isolatie, in vitro-uitbreiding , micro-injectie en donorverificatie, en biedt een betrouwbaar platform voor het produceren van kiemlijnchimera's en het bevorderen van vogelbiotechnologie.

Samenvatting

De generatie van kiemlijnchimeren bij kippen via transplantatie van primordiale kiemcellen (PGC's) biedt een robuust en reproduceerbaar platform voor vogeltransgenese, genoombewerking en soortbehoud. Traditionele benaderingen met blastodermale cellen uit EGK stadium X-embryo's worden beperkt door een lage efficiëntie van de kiemlijntransmissie door vroege scheiding van cellenlijnen. Daarentegen maken PGC-gemedieerde strategieën gebruik van de intrinsieke kiemlijncompetentie van deze unipotente cellen, waardoor betrouwbare opname in ontvangende gonaden mogelijk is. Hier presenteren we een stapsgewijs protocol voor het isoleren van PGC's uit HH stadium 26-28 embryo's, het onderhouden en uitbreiden ervan in vitro, en het transplanteren in de dorsale aorta van HH stadium 14-17 ontvangerembryo's. Kortdurende engraftment wordt gemonitord met fluorescerende markers zoals PKH26, terwijl langdurige bijdrage aan de kiemlijn wordt bevestigd door PCR-analyse van ontvangergonaden. Deze aanpak zorgt voor consistente generatie van kiemlijnchimera's, terwijl de levensvatbaarheid en functionele competentie van donor-PGC's behouden blijven. Daarnaast is de methode compatibel met genoombewerkingstools zoals CRISPR/Cas9 en transposon-gebaseerde vectoren, waardoor transgene en gen-bewerkte vogelmodellen worden geproduceerd. Naast fundamenteel onderzoek ondersteunt deze strategie ook natuurbeschermingsinspanningen via intersoortelijke kiemlijnoverdracht en genetisch behoud. Al met al biedt dit protocol een uitgebreid en betrouwbaar kader voor het manipuleren van de vogelkiemlijn, en biedt het een veelzijdig platform voor zowel fundamentele als toegepaste studies in pluimveebiotechnologie.

Inleiding

Primordiale kiemcel (PGC)-gemedieerde kiemlijnoverdracht is de meest efficiënte methode om genetische informatie over te dragen aan de volgende generatie bij vogels 1,2,3. Germline-chimera's, gedefinieerd als individuen die zowel donor- als gastheer-afgeleide kiemcellen dragen, maken overdracht van donorgenetisch materiaal naar nakomelingen mogelijk, wat toepassingen ondersteunt in transgenese, functionele genomica en het behoud van bedreigde soorten 4,5,6,7,8. In tegenstelling tot benaderingen die vertrouwen op blastodermale cellen, bieden PGC-gemedieerde strategieën een hogere efficiëntie en reproduceerbaarheid van de kiemlijnen, waardoor ze goed geschikt zijn voor nauwkeurige genetische manipulatie.

Bij vogelsoorten ontspringen PGC's in de centrale pellucida-regio van het blastoderm bij Eyal-Giladi en Kochav (EGK) stadium X9 en migreren vervolgens naar de kiemmaans via Hamburger en Hamilton (HH) stadium 4 tot10. Tussen HH-stadia 9 en 12 circuleren PGC's via embryonale bloedvaten voordat ze zich vestigen in de gonadale richel 11,12,13. Dit onderscheidende migratiepatroon maakt isolatie van PGC's in meerdere stadia mogelijk, waaronder de kiemhalve maan, circulerend bloed en de gonaden14. Opmerkelijk is dat PGC's die uit HH-stadium 26-28 geslachtsorganen zijn geoogst en in HH-stadium 14-17 ontvangerembryo's zijn getransplanteerd, aangetoond optimale kiembaarcompetentie en engraftmentefficiëntie te vertonen, wat een praktisch kader biedt voor gestandaardiseerde toepassing van dit protocol.

PGC's kunnen in vitro worden onderhouden en uitgebreid, terwijl de identiteit van de kiemlijn en de overdrachtsmogelijkheid behouden blijven, waardoor ze worden gebruikt voor stabiele genetische modificatie. PGC-gemedieerde productie van kiemlijnchimera is gebruikt om transgene vogels te genereren die recombinante eiwitten tot expressie brengen, de kiemlijnlijn traceren, geslachtsbepalingsroutes manipuleren en resistentie tegen infectieziekten verleen 6,15,16,17,18,19. Bovendien faciliteert PGC-transplantatie de interspecies kiemlijnoverdracht en het behoud van bedreigd vogelgermplasma 7,8,20,21,22,23, en PGC-cryopreservatie maakt langdurige genetische hulpbronnenbehoudmogelijk 24,25.

Hoewel andere stamceltypen, waaronder embryonale stamcellen (ESCs)26,27,28,29, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)30,31,32 en spermatogoniële stamcellen (SSCs)33,34, zijn onderzocht voor vogelkiemlijnmodificatie, blijft hun transmissie-efficiëntie van kiemlijnen lager dan die van PGC-gebaseerde systemen, die momenteel als de meest worden beschouwd betrouwbare bron van kiemlijn-competente cellen.

In kiemlijnchimera-studies is de keuze van donorras cruciaal om donor-afgeleide kiemcellen te onderscheiden van gastheer-afgeleide cellen. De Koreaanse Ogye Kip (KOC) bezit het recessieve i/i-allel dat verantwoordelijk is voor zwarte huid en veren, dat gemakkelijk te onderscheiden is van de White Leghorn-lijn met het dominante I/I-allel 35,36. Dit zichtbare verschil maakt ondubbelzinnig identificatie van donorafgeleide nakomelingen mogelijk tijdens de analyse van kiemlijnoverdracht, terwijl het ook het behoud van biodiversiteit ondersteunt vanwege de inheemse genetische waarde van KOC.

Al met al biedt PGC-gemedieerde kiemlijnchimeraproductie een robuust platform voor vogelbiotechnologie (Figuur 1). Door het specificeren van de optimale donor- (HH26-28) en ontvangerfase (HH14-17) en het integreren van gedefinieerde kweek- en validatiestappen, maakt dit protocol efficiënte kiemlijnoverdracht mogelijk en biedt het een praktisch kader voor de generatie van transgene en genoom-bewerkte vogels, evenals het behoud van waardevolle genetische vogels.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met kippen zijn goedgekeurd door het Institute of Laboratory Animal Resources, Seoul National University, Zuid-Korea (IACUC-goedkeuringsnummer: SNU-250226-4). Dieren werden onder gecontroleerde en hygiënische omstandigheden gehouden, met gesteriliseerd water en voer beschikbaar. Daarnaast werd al het chemisch en biologisch afval dat tijdens de procedures werd geproduceerd, waaronder trypsine/EDTA-oplossingen, PKH26-gelabelde cellen en embryonale of gonadale weefsels, behandeld en afgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor bioveiligheid en beheer van gevaarlijk afval van de Seoul National University. Alle reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel. PGC's, media en reagentia die worden gebruikt voor gonadmonsters en celkweek van donorembryo's moeten steriel zijn.

1. Isolatie van kippen-PGC's

  1. Bred vers bevruchte kippeneieren uit in het Eyal-Giladi en Kochav (EGK) stadium X bij 37 °C gedurende 5,5 dagen totdat de embryo's HH-stadia 26-28 bereiken.
    OPMERKING: Houd de luchtvochtigheid op 60%-65% om een normale embryonale ontwikkeling te waarborgen.
  2. Isoleer embryo's zorgvuldig uit de eicellen in HH-stadia 26-28 met behulp van steriele pincetten.
  3. Was embryo's met 1× PBS, plaats het embryo vervolgens op een houtskoolplaat en zet het vast met insectenspelden. Met een stereomicroscoop ontleed je zorgvuldig de gekoppelde embryonale gonaden met een geslepen tang.
    OPMERKING: Behandel de weefsels voorzichtig om schade te voorkomen en zorgt voor nauwkeurige isolatie van de gonaden. Door hun nabijheid van de mesonefrische nier in HH-stadia 26-28 kan er per ongeluk een kleine hoeveelheid nierweefsel worden verzameld; echter, zorgvuldige dissectie onder een stereomicroscoop en selectieve kweekomstandigheden zorgen ervoor dat alleen PGC's zich vermenigvuldigen en zuiverheid behouden.
  4. Overbreng de gepaarde gonaden, verzameld uit drie embryo's, in een buisje van 1,5 ml met 500 μL 0,05% trypsine/EDTA en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten om de cellen te dissociëren.
  5. Voeg 50 μL FBS toe om de trypsine te inactiveren.
  6. Centrifugeer op 200 × g gedurende 5 minuten op kamertemperatuur (ongeveer 20-25 °C). Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de celpellet te verstoren.
  7. Sussief de gedissocieerde gonadale cellen opnieuw in 1 ml van 1× PBS.

2. In vitroproliferatie van kip-PGC's

  1. Bereid PGC-kweekmedium voor (KO-DMEM aangevuld met 20% FBS, 2% kippenserum, nucleosiden, GlutaMAX, MEM niet-essentiële aminozuren, 2-mercaptoethanol, 10 mM natriumpyruvat, antibioticum-antimycoticum, 10 ng/mL bFGF) en verwarm het medium tot 37 °C.
  2. Voeg gedissocieerde gonadale cellen uit drie embryo's bij HH-stadia 26-28 toe (ongeveer 100-150 PGC's per embryo37,38) aan 1 mL voorverwarmd kweekmedium per put en verplat de cellen op een kweekplaat met 12 putjes.
  3. Wieg de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling van de cellen te garanderen.
  4. Houd PGC's op 37 °C met 5% CO₂, monitor dagelijks de morfologie en celdichtheid. PGC's blijven rond, brekend en doorgaans zwevend, terwijl somatische cellen hechtend zijn (Figuur 2A).
    OPMERKING: De kweekomstandigheden ondersteunen selectief de proliferatie van PGC's, waardoor PGC's kunnen uitbreiden terwijl somatische cellen geleidelijk worden geëlimineerd.
  5. PGC's die in een 12-well-plaat worden gekweekt, worden behouden door het kweekmedium elke 3-4 dagen te veranderen om optimale proliferatie en levensvatbaarheid te ondersteunen (Figuur 2B).
  6. Gebruik optioneel PGC-specifieke markers (bijv. CVH, DAZL, NAMG en POUV) om zuiverheid te verifiëren en geslachtsbepaling uit te voeren met PCR (Tabel 1).
    1. Bereid PGC-monsters voor voor RNA-extractie met het RNA Miniprep-systeem volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Voer RT-PCR uit (bijv. CVH, DAZL, NANOG en POUV) of immunokleuring met PGC-specifieke markers (SSEA1 en DAZL) volgens standaardprotocollen39 (Figuur 2C,D).
    3. Voer geslachtsbepalende PCR-analyse uit volgens standaardprotocollen40 (Figuur 2E).

3. Validatie van de kiembaarcompetentie van gekweekte PGC's met behulp van PKH26-labeling

  1. Oogst PGC's wanneer ze de log-groeifase bereiken, meestal met een dichtheid van ongeveer 1-5 × 105 cellen per put in een 12-well plaat.
  2. Pellet de cellen door te centrifugeren op 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (ongeveer 20-25 °C), opnieuw te suspenseren in 1× PBS en de levensvatbaarheid te beoordelen met trypan blue.
  3. Maak verdunningsmiddel C uit de PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit voor algemene celmembraanlabeling en breng het in evenwicht tot kamertemperatuur (ongeveer 20-25 °C).
  4. Reconstrueren de PKH26-kleurstof en bereiden een werkoplossing voor in verdunningsmiddel C bij een eindconcentratie van ongeveer 1-2 μM.
  5. Suspendeer de PGC-pellet opnieuw in 1 mL verdunningsmiddel C. Voeg snel 1 mL PKH26-oplossing toe (1:1 verhouding), meng voorzichtig en incubeer 2-5 minuten bij kamertemperatuur (ongeveer 20-25 °C).
  6. Voeg snel 1 mL PKH26 werkoplossing toe aan de celsuspensie (1:1 verhouding), meng voorzichtig door te pipetteren en incubeer op kamertemperatuur (ongeveer 20-25 °C) gedurende 2-5 minuten.
    OPMERKING: Overschrijd de aanbevolen incubatietijd niet.
  7. Stop de verkleuring door 2-4 keer het volume FBS of 1%-5% BSA toe te voegen in PBS.
  8. Centrifugeren op 200 × g, 5 minuten bij kamertemperatuur (ongeveer 20-25 °C); was drie keer met PGC-kweekmedium of 1× PBS + 0,1% BSA.
  9. Susstrueer cellen opnieuw in injectiebuffer (PGC-kweekmedium of 1× PBS + 0,1% BSA) bij een concentratie van 1-5 × 104 tot 1 × 105cellen/μL. Houd ze kort op ijs om levensvatbaarheid te behouden.
  10. Controleer de etikettering onder een fluorescentiemicroscoop vóór injectie (Figuur 3A).
  11. Injecteer meer dan 3.000 levensvatbare gelabelde PGC's, geteld met trypanblauw, in HH-stadium 14-17 embryo's en incubeer tot dag 6 (Figuur 3B).
  12. Bevestig kolonisatie van ontvangergonaden vóór dag 6 (Figuur 3C).

4. Transplantatie van donor-PGC's in het embryonale bloedvat van de ontvanger

  1. Bred de ontvangereieren uit tot HH-stadium 14-17 (37 °C, 60-70% luchtvochtigheid, schommelen op 45° elk uur).
  2. Bereid een glazen capillairmicropipette voor met behulp van borosilicaatglasbuis (1,0 mm buitendiameter, 0,5-0,75 mm binnendiameter). Trek de capillair eruit met een micropipettrekker en polijst de tip tot een binnendiameter van ongeveer 10-20 μm.
  3. Creëer een klein venster (ongeveer 0,5 cm × 0,5 cm) aan het puntige uiteinde van het eitje om micro-injectietoegang mogelijk te maken en verstoring van het embryo te minimaliseren.
    OPMERKING: Steriliseer het eierschaaloppervlak met 70% ethanol voordat je het raam opent om besmetting te voorkomen.
  4. Injecteer 2 μL van een suspensie met meer dan 3.000 PGC's in 1× PBS of HBSS in de dorsale aorta onder een stereomicroscoop.
    OPMERKING: Voer de injectie uit onder een stereomicroscoop om schade aan het embryo of de bloedvaten te voorkomen, en manipuleer voorzichtig de microinjectienaald om letsel te voorkomen.
  5. Sluit het eiraam af met paraffinefolie; Plaats het uiteinde van het ei naar beneden en broei tot het uitkomt bij 37,5 °C, 60-70% luchtvochtigheid, en wiebel elk uur op 45°.
    OPMERKING: Handhaven de juiste temperatuur en luchtvochtigheid om de levensvatbaarheid van het embryo en een succesvolle ontwikkeling te waarborgen.

5. Validatie van kiembamiera

  1. Verzamel de testis of eierstok van het G0-kuiken na het uitkomen.
  2. Extractie genomisch DNA uit de verzamelde gonadale weefsels om de vorming van kiemlijnchimera te bevestigen. Voer genomische DNA-extractie uit uit de verzamelde gonadale weefsels als volgt:
    1. Verzamel testikel- of eierstokweefsel, homogeniseer dit in 300 μl lysisbuffer (2 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1% SDS) met 1,5 μL proteïnase K, en incubeer bij 60 °C voor h om volledige lysis te garanderen.
    2. Voeg 100 μL eiwitprecipitatieoplossing (7 M ammoniumacetaat) toe, meng grondig en centrifugeer op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    3. Breng het supernatant (waterige fase) over naar een nieuwe buis, voeg 500 μL isopropanol toe om DNA neer te slaan en centrifugeer op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    4. Gooi het supernatant weg, voeg 1 mL 70% ethanol toe en centrifugeer op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    5. Verwijder de ethanol en laat de DNA-pellet 10 minuten aan de lucht drogen op kamertemperatuur.
    6. Eliuteer het DNA met 50 μL RNase-vrij water en meet de DNA-concentratie en zuiverheid met een spectrofotometer (A260/A280 ≈ 1,8).
    7. Pas het DNA aan op 10-5 ng per PCR-reactie.
  3. Voer PCR-versterking uit met soortspecifieke primers die zijn ontworpen (Tabel 1) onder de volgende omstandigheden: 94 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 35 cycli van 94 °C voor 30 seconden, 68 °C voor 30 seconden en 72 °C voor 30 seconden, plus een laatste verlenging bij 72 °C voor 5 minuten (Figuur 4A).
  4. Verzamel sperma van geslachtsrijpe G0-mannetjes, extraheer sperma-DNA met hetzelfde protocol en voer PCR uit met soortspecifieke primers (Figuur 4B).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In vitroproliferatie en karakterisering van Chicken PGC's
PGC-bevattende hele gonadale cellen werden geïsoleerd uit embryo's bij HH-stadia 26-28 en gekweekt onder gedefinieerde PGC-kweekcondities. In de loop van de tijd hechtten gonadale stromale cellen zich ofwel aan het kweekoppervlak of ondergingen ze degradatie, terwijl PGC's in suspensie bleven en actief begonnen te vermenigvuldigen (Figuur 2A). Na ongeveer twee weken kweek groeide de PGC-po...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De transplantatie van gekweekte primordiale kiemcellen (PGC's) in ontvangende embryo's biedt een betrouwbare methode om kiemlijnchimeren bij kippen te produceren. Dit protocol maakt gebruik van het intrinsieke kiemlijnpotentieel van PGC's en verbetert de experimentele consistentie ten opzichte van traditionele blastoderm-gebaseerde systemen, die gevoelig zijn voor mozaïek en ontwikkelingsvariabiliteit. Een cruciaal voordeel van deze methode is de selectieve in vitro expansie van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) [RS-2024-00418297] en het Cooperative Research Program for Agriculture Science and Technology Development [RS-2025-02213489] van de Koreaanse Rural Development Administration.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x PBS HycloneSH30256
2-MercaptoethanolGibco21985023
Antibiotic Antimycotic Solution (100X)Gibco15240062
Anti-DAZL antibodyAbcamab215718
Chicken Serum SterileRocklandD102-00-0500
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma aldrich9003-98-9
Drummond Microcaps Disposable Micropipets Drummond Scientific Company1-000-0500
EmbryoMax Nucleosides (100X)MerckES-008-D
FBS (Fetal Bovine Seurm Characterized, US-Sourced, 500ml)HycloneSH30919
GlutaMAX SupplementGibco35050061
KnockOut DMEMGibco10829018
MEM Non-Essential Amino Acids SolutionGibco11140050
Parafilm M Laboratory FilmAmcorPM996 
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane LabelingSigma aldrichPKH26GL-1KT
Purified anti-mouse/human CD15 (SSEA-1) AntibodyBiolegend125602
Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (146 aa) Protein R&D systems 233-FB
ReliaPrep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6011
Sodium Pyruvate (100 mM)Gibco11360070
Trypan blue solutionSigmaT8154-100ML
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol redGibco™15400054

Referenties

  1. van de Lavoir, M. C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
  2. Macdonald, J., Glover, J. D., Taylor, L., Sang, H. M., McGrew, M. J. Characterisation and germline transmission of cultured avian primordial germ cells. PLoS One. 5 (11), e15518(2010).
  3. Choi, J. W., et al. Basic fibroblast growth factor activates MEK/ERK cell signaling pathway and stimulates the proliferation of chicken primordial germ cells. PLoS One. 5 (9), e12968(2010).
  4. Macdonald, J., et al. Efficient genetic modification and germline transmission of primordial germ cells using piggyBac and Tol2 transposons. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), E1466-E1472 (2012).
  5. Park, T. S., Han, J. Y. PiggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9337-9341 (2012).
  6. Lee, H. J., et al. DMRT1 gene disruption alone induces incomplete gonad feminization in chicken. FASEB J. 35 (9), e21876(2021).
  7. Kang, S. J., et al. Reproduction of wild birds via interspecies germ cell transplantation. Biol Reprod. 79 (5), 931-937 (2008).
  8. Wernery, U., et al. Primordial germ cell-mediated chimera technology produces viable pure-line Houbara bustard offspring: potential for repopulating an endangered species. PLoS One. 5 (12), e15824(2010).
  9. Eyal-Giladi, H., Kochav, S. From cleavage to primitive streak formation: A complementary normal table and a new look at the first stages of the development of the chick. I. General morphology. Dev Biol. 49 (2), 321-337 (1976).
  10. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. J Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).
  11. Ukeshima, A., Yoshinaga, K., Fujimoto, T. Scanning and transmission electron microscopic observations of chick primordial germ cells with special reference to the extravasation in their migration course. J Electron Microsc (Tokyo). 40 (2), 124-128 (1991).
  12. Fujimoto, T., Ukeshima, A., Kiyofuji, R. The origin, migration and morphology of the primordial germ cells in the chick embryo. Anat Rec. 185 (2), 139-145 (1976).
  13. Meyer, D. B. The migration of primordial germ cells in the chick embryo. Dev Biol. 10, 154-190 (1964).
  14. Kim, Y. M., Han, J. Y. The early development of germ cells in chicken. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 145-152 (2018).
  15. Park, T. S., et al. Deposition of bioactive human epidermal growth factor in the egg white of transgenic hens using an oviduct-specific minisynthetic promoter. FASEB J. 29 (6), 2386-2396 (2015).
  16. Kim, Y. M., et al. The transgenic chicken derived anti-CD20 monoclonal antibodies exhibits greater anti-cancer therapeutic potential with enhanced Fc effector functions. Biomaterials. 167, 58-68 (2018).
  17. Rengaraj, D., et al. Dissecting chicken germ cell dynamics by combining a germ cell tracing transgenic chicken model with single-cell RNA sequencing. Comput Struct Biotechnol J. 20, 1654-1669 (2022).
  18. Park, J. S., et al. Production of recombinant human IgG1 Fc with beneficial N-glycosylation pattern for anti-inflammatory activity using genome-edited chickens. Commun Biol. 6 (1), 589(2023).
  19. Idoko-Akoh, A., et al. Creating resistance to avian influenza infection through genome editing of the ANP32 gene family. Nat Commun. 14 (1), 6136(2023).
  20. Ono, T., Yokoi, R., Aoyama, H. Transfer of male or female primordial germ cells of quail into chick embryonic gonads. Exp Anim. 45 (4), 347-352 (1996).
  21. Reynaud, G. The transfer of turkey primordial germ cells to chick embryos by intravascular injection. J Embryol Exp Morphol. 21 (3), 485-507 (1969).
  22. Liu, C., et al. Production of chicken progeny (Gallus gallus domesticus) from interspecies germline chimeric duck (Anas domesticus) by primordial germ cell transfer. Biol Reprod. 86 (4), 101(2012).
  23. van de Lavoir, M. C., et al. Interspecific germline transmission of cultured primordial germ cells. PLoS One. 7 (5), e35664(2012).
  24. Naito, M., Tajima, A., Tagami, T., Yasuda, Y., Kuwana, T. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring. J Reprod Fertil. 102 (2), 321-325 (1994).
  25. Tajima, A., Naito, M., Yasuda, Y., Kuwana, T. Production of germline chimeras by transfer of cryopreserved gonadal primordial germ cells (gPGCs) in chicken. J Exp Zool. 280 (3), 265-267 (1998).
  26. Carsience, R. S., Clark, M. E., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos. Development. 117 (2), 669-675 (1993).
  27. Petitte, J. N., Liu, G., Yang, Z. Avian pluripotent stem cells. Mech Dev. 121 (9), 1159-1168 (2004).
  28. Petitte, J. N., Clark, M. E., Liu, G., Verrinder Gibbins, A. M., Etches, R. J. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells. Development. 108 (1), 185-189 (1990).
  29. Pain, B., et al. Long-term in vitro culture and characterisation of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities. Development. 122 (8), 2339-2348 (1996).
  30. Rossello, R. A., et al. Mammalian genes induce partially reprogrammed pluripotent stem cells in non-mammalian vertebrate and invertebrate species. Elife. 2, e00036(2013).
  31. Lu, Y., et al. Avian-induced pluripotent stem cells derived using human reprogramming factors. Stem Cells Dev. 21 (3), 394-403 (2012).
  32. Kim, Y. M., Park, Y. H., Lim, J. M., Jung, H., Han, J. Y. Technical note: Induction of pluripotent stem cell-like cells from chicken feather follicle cells. J Anim Sci. 95 (8), 3479-3486 (2017).
  33. Han, J. Y., et al. Production of quail (Coturnix japonica) germline chimeras by transfer of Ficoll-enriched spermatogonial stem cells. Theriogenology. 154, 223-231 (2020).
  34. Pramod, R. K., et al. Isolation, characterization, and in vitro culturing of spermatogonial stem cells in Japanese Quail (Coturnix japonica). Stem Cells Dev. 26 (1), 60-70 (2017).
  35. Park, T. S., et al. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos. Biol Reprod. 68 (5), 1657-1662 (2003).
  36. Chang, I. K., et al. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells. Cell Biol Int. 21 (8), 495-499 (1997).
  37. Nakamura, Y., et al. Migration and proliferation of primordial germ cells in the early chicken embryo. Poult Sci. 86 (10), 2182-2193 (2007).
  38. Kuwana, T. Migration of Avian Primordial Germ Cells toward the Gonadal Anlage: (avian/PGC/migration/presumptive gonad/chimera). Dev Growth Differ. 35 (3), 237-243 (1993).
  39. Jung, K. M., Kim, Y. M., Ono, T., Han, J. Y. Size-dependent isolation of primordial germ cells from avian species. Mol Reprod Dev. 84 (6), 508-516 (2017).
  40. Ogawa, A., et al. Molecular characterization and cytological mapping of a non-repetitive DNA sequence region from the W chromosome of chicken and its use as a universal probe for sexing carinatae birds. Chromosome Res. 5 (2), 93-101 (1997).
  41. Park, K. J., et al. Gamma-irradiation depletes endogenous germ cells and increases donor cell distribution in chimeric chickens. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46 (10), 828-833 (2010).
  42. Nakamura, Y., et al. Germline replacement by transfer of primordial germ cells into partially sterilized embryos in the chicken. Biol Reprod. 83 (1), 130-137 (2010).
  43. Song, Y., D'Costa, S., Pardue, S. L., Petitte, J. N. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion. Mol Reprod Dev. 70 (4), 438-444 (2005).
  44. Lee, H., et al. Compensatory proliferation of endogenous chicken primordial germ cells after elimination by busulfan treatment. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 136(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Primordiale kiemcellenPGC transplantatieaviaire transgenesegenoomredigeringkippenembryo sinterspecies kiemlijnoverdrachtCRISPR Cas9fluorescerende markersPCR analyse van gonaden

Gerelateerde artikelen