Is teicoplanineresistentie gedetecteerd door het geautomatiseerde systeem in Staphylococcus spp-stammen betrouwbaar?

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de betrouwbaarheid van een geautomatiseerd systeem (VITEK 2) te evalueren voor het bepalen van teicoplanine-gevoeligheid in Staphylococcus-isolaten door vergelijking met bouillonmicroverdunning (BMD), met toepassingen om resistentie te bevestigen en passende antimicrobiële therapie te sturen.

Samenvatting

In totaal werden 467 Staphylococcus aureus (S. aureus) en 66 coagulase-negatieve Staphylococcus (CoNS) isolaten, verzameld tussen juni 2022 en december 2024, in deze studie opgenomen. Teicoplanine gevoeligheidstesten werden uitgevoerd met behulp van het geautomatiseerde antimicrobiële gevoeligheidstestsysteem, bouillonmicroverdunning (BMD) en een gradiënttestmethode. Methicillineresistentie werd vastgesteld in 71,7% van de S. aureus-isolaten en in alle CoNS-isolaten. In deze studie werden 13 S. aureus-isolaten en 4 CoNS-isolaten geïdentificeerd als teicoplanine-resistent door een geautomatiseerd gevoeligheidstestsysteem. Alle 13 S. aureus-isolaten bleken vatbaar te zijn voor teicoplanine door zowel de gradiënttest als BMD. Alle vier CoNS-isolaten werden door de gradiënttest als vatbaar geïdentificeerd, terwijl BMD twee isolaten als vatbaar en twee als resistent classificeerde. Teicoplanineresistentie werd vastgesteld in vier stammen [S. capitis (n = 1) en S. haemolyticus (n = 3)] onder de CoNS-isolaten door BMD. De vier teicoplanineresistente CoNS-stammen die door BMD werden geïdentificeerd, werden geïsoleerd uit bloedkweken; drie werden verkregen van pediatrische patiënten en één van een volwassen patiënt. Over het algemeen was de methicillineresistente S. aureus (MRSA) dosering relatief hoog in de studie, en waren alle CoNS-isolaten methicillineresistent. Daarnaast bleken geautomatiseerde systemen onbetrouwbaar te zijn voor het bepalen van teicoplanineresistentie, en isolaten die als resistent zijn geïdentificeerd, moeten worden bevestigd door BMD. Aangezien teicoplanine een laatste redmiddel is dat wordt gebruikt voor de behandeling van pathogenen zoals MRSA en methicillineresistente CoNS, moet de vatbaarheid ervan nauwlettend worden gevolgd.

Inleiding

Staphylococcus aureus (S. aureus) is een van de meest klinisch significante Staphylococcus-soorten vanwege het brede scala aan virulentiefactoren en het vermogen om ernstige infecties in diverse weefsels en organen te veroorzaken. Het is verantwoordelijk voor huid- en zachte weefselinfecties, diepe weefselinfecties, luchtweginfecties, urineweginfecties en bloedbaaninfecties, en blijft een van de belangrijkste ziekteverwekkers in ziekenhuisomgevingen ^1,2. In het bijzonder is methicillineresistente S. aureus (MRSA) wereldwijd een belangrijke oorzaak van gezondheidsgerelateerde infecties en blijft het een belangrijke oorzaak van postoperatieve wondinfecties ^2,3. Coagulase-negatieve stafylokokken (CoNS), hoewel onderdeel van de normale huidflora, zijn de afgelopen jaren steeds vaker betrokken geraakt bij zowel lokale als systemische infecties. Deze toename heeft geleid tot frequentere antimicrobiële gevoeligheidstests en daardoor een grotere detectie van resistentie tegen glycopeptide-antibiotica zoals teicoplanine⁴.

Omdat S. aureus- en CoNS-stammen vaak resistentie vertonen tegen β-lactam antibiotica, worden glycopeptide-antibiotica, voornamelijk vancomycine en teicoplanine, veel gebruikt voor de behandeling van deze infecties5. De toenemende prevalentie van resistente gram-positieve nosocomiale pathogenen heeft geleid tot het toenemende gebruik van glycopeptiden, wat heeft bijgedragen aan een afname van de bacteriële vatbaarheid voor deze agentia ^5,6. Vancomycine en teicoplanine hebben een vergelijkbare antimicrobiële effectiviteit; Meerdere studies hebben echter aangetoond dat teicoplanine geassocieerd is met minder bijwerkingen, met name een verminderde nefrotoxiciteit ^7,8. Daarom wordt teicoplanine vaak beschouwd als een geschikt alternatief voor vancomycine in specifieke patiëntenpopulaties, waaronder die met neutropenie, bacteriëmie of verminderde nierfunctie ^9,10.

Snelle en nauwkeurige bepaling van glycopeptide-gevoeligheid is belangrijk vanwege het wijdverbreide gebruik van deze middelen bij methicillineresistente Staphylococcus-infecties en de toenemende meldingen van glycopeptide-resistente stammen¹¹. Er zijn verschillende laboratoriummethoden beschikbaar om de gevoeligheid voor glycopeptiden bij Staphylococcus-soorten te beoordelen, waaronder agarverdunning, gradiënttesten, bouillonmicroverdunning (BMD) en geautomatiseerde antimicrobiële gevoeligheidstestsystemen⁵. Eerdere studies hebben discrepanties gemeld tussen geautomatiseerde systemen en referentiemethoden bij het detecteren van verminderde vatbaarheid of resistentie tegen glycopeptiden, met name teicoplanine, bij Staphylococcus-soorten ^4,11.

De huidige studie had als doel de betrouwbaarheid te evalueren van het geautomatiseerde antimicrobiële gevoeligheidstestsysteem voor het bepalen van teicoplanine-gevoeligheid in Staphylococcus-isolaten , vergeleken met de bouillonmicroverdunningsmethode, de referentiestandaard. Evaluatie van de prestatiekenmerken van het geautomatiseerde systeem kan klinische laboratoria helpen de geschiktheid ervan te beoordelen voor routinematige detectie van glycopeptide-gevoeligheid in de klinische praktijk.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie op 27 januari 2025 (protocolnummer: HRU/25.02.03). De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki.

1. Studieontwerp

Deze retrospectieve studie evalueerde de prestaties van het geautomatiseerde antimicrobiële gevoeligheidstestsysteem voor het bepalen van teicoplanine-gevoeligheid bij Staphylococcus-soorten , waarbij de resultaten werden vergeleken met de bouillonmicroverdunningsmethode (BMD) en een gradiënttestmethode.

2. Isolatieselectie

1. Verzameling klinische isolaten
   1. Bevat in totaal 467 S. aureus - en 66 coagulase-negatieve Staphylococcus (CoNS) isolaten, verkregen uit diverse klinische monsters tussen juni 2022 en december 2024.
   2. Verwerk alle klinische monsters volgens routinematige microbiologische procedures in het diagnostisch laboratorium.
   3. Neem slechts één isolaat per patiënt mee in de analyse. Sluit herhaalde isolaten uit die zijn verkregen van verschillende monsters van dezelfde patiënt uit.
2. Eerste identificatie en screening
   1. Identificeer alle isolaten op soortniveau met behulp van matrix-ondersteunde laser-desorptie-ionisatie tijd-van-vlucht massaspectrometrie (MALDI-TOF MS).
   2. Test S. aureus en CoNS-isolat op methicillineresistentie en teicoplanine-gevoeligheid met VITEK 2 AST-P664-kaarten en het geautomatiseerde gevoeligheidstestsysteem.
   3. Noteer de minimale inhibitorische concentratie (MIC) waarden die door het geautomatiseerde gevoeligheidstestsysteem worden gegenereerd voor latere vergelijking.
3. Isolatieopslag en subcultuur
   1. Bewaar isolaten bij −80 °C in tryptische sojabouillon, aangevuld met 20% glycerol, volgens een geautomatiseerd gevoeligheidstestsysteem.
   2. Voor referentietests ontdooi je isolaten bij kamertemperatuur en kweek je ze twee keer op 5% schapenbloedagar.
   3. Incubeer platen bij 37 °C gedurende 24 uur na elke passage om zuiverheid en levensvatbaarheid te waarborgen.

3. Antimicrobiële gevoeligheidstesten

1. Bouillonmicroverdunning (BMD)
   1. Bereiding van Teicoplanine-oplossingen
      1. Bereid een voorraadoplossing van teicoplaninepoeder met een concentratie van 2560 mg/L in kation-gecorrigeerde Mueller-Hinton-bouillon (CAMHB).
   2. Bouillonmicroverdunningsprocedure
      1. Voer bouillonmicroverdunningstests uit met steriele 96-put U-bodem microplaten.
      2. Doseer 100 μL CAMHB in elke put. Verdun de teicoplaninevoorraadoplossing tienvoudig en voeg 100 μL toe aan de eerste put.
      3. Bereid twee seriële verdunningen voor over putten 1–10 om de uiteindelijke antibioticaconcentraties te verkrijgen variërend van 64 tot 0,125 μg/mL.
      4. Gebruik put 11 als groeicontrole met CAMHB en bacteriële inoculum. Gebruik put 12 als negatieve controle die alleen CAMHB¹² bevat.
   3. Inoculumvoorbereiding en incubatie
      1. Suspendeer zuivere bacteriekolonies in steriele zoutoplossing en pas de suspensie aan tot een troebelheid gelijk aan een 0,5 McFarland-standaard.
      2. Bereid een verdunning van 1:100 voor in CAMHB en voeg 100 μL van de bacteriële suspensie toe aan putten 1–11 om een uiteindelijke inoculumconcentratie van ongeveer 5 × 10⁵ CFU/mL te bereiken.
      3. Incubeer de microplaten bij 37 °C gedurende 24 uur onder omgevingsomstandigheden¹².
   4. MIC-bepaling en interpretatie
      1. Definieer de minimale remmende concentratie (MIC) als de laagste concentratie teicoplanine die de zichtbare bacteriegroei na incubatie volledig remt.
      2. Interpreteer MIC-waarden volgens de Europese Commissie voor Antimicrobiële Gevoeligheidstesten (EUCAST) versie 14.0 richtlijnen¹³.

4. Kwaliteitscontrole

1. Gebruik Staphylococcus aureus ATCC 29213, met een teicoplanine MIC referentiebereik van 0,25–1 mg/L, als kwaliteitscontrolestam.

5. Statistische analyse

1. Methodevergelijking
   1. Vergelijk teicoplanine MIC-resultaten verkregen met het geautomatiseerde gevoeligheidstestsysteem met die verkregen met de BMD-referentiemethode.
   2. Definieer categorische overeenstemming (CA) als concordante vatbare of resistente resultaten tussen de twee methoden.
2. Foutclassificatie
   1. Definieer zeer grote fouten (VME) als isolaten die door het geautomatiseerde vatbaarheidstestsysteem als vatbaar worden gecategoriseerd maar door BMD als resistent worden gecategoriseerd.
   2. Definieer grote fouten (MET) als isolaten die als resistent worden gecategoriseerd door het geautomatiseerde gevoeligheidstestsysteem maar door BMD gevoelig zijn.
3. Prestatiecriteria
   1. Beschouw methodeprestaties als acceptabel wanneer de categorische overeenstemming ≥90% is en de percentages van VME en ME ≤3%, volgens gepubliceerde evaluatiecriteria^14,15.

Resultaten

In totaal werden 533 isolaten uit klinische monsters over een periode van 2,5 jaar opgenomen in de analyse. Alle methicillineresistente CoNS (MR-CoNS) isolaten en 71,7% van de S. aureus-isolaten bleken methicillineresistent te zijn. Wonduitstrijkjes waren de meest voorkomende klinische monsters met S. aureus-isolaten , terwijl MR-CoNS-isolaten het vaakst werden teruggevonden uit bloedkweken (Figuur 1).

Discussie

Antimicrobiële resistentie is een van de grootste bedreigingen voor de wereldwijde volksgezondheid en draagt bij aan hogere zorgkosten, mislukking van behandelingen en^sterfte. De incidentie van zowel in de gemeenschap als in het ziekenhuis verkregen infecties veroorzaakt door Staphylococcus aureus blijft nationaal en wereldwijd toenemen. Methicillineresistentie wordt in het bijzonder geassocieerd met verhoogde morbiditeit en sterfte; Daarom worden resiste...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Cation-Adjusted Mueller Hinton Broth	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland	CM0405B	Voor bacteriegroei in de bouillon microdilutiemethode
MALDI-TOF MS	VITEK MS, BioMérieux, Frankrijk	410893	Voor bacterie identificatie
McFarland standaard	bioMérieux, Frankrijk	95060-958	Standaardisatie van bacterie inoculum
Petrischalen	RTA, Türkiye	2102	Voor medium voorbereiding en bacterie cultivatie
Pipettip 20 - 200 μL	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland	Z740105	Voor de verdeling van cation-aangepaste Mueller–Hinton bouillon (CAMHB) in U-bodem microplaten en voorbereiding van seriële verdunningsreeksen
Schapenbloed agar	RTA, Türkiye	2001	Isolatie en cultivatie van micro-organismen
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection	29213	Referentiestam gebruikt in dit onderzoek
Teicoplanine poeder	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland	T0578	Antibiotica
Tryptische sojaboon bouillon	Merck, Duitsland	1.054.590.500	Isolatie en cultivatie van micro-organismen
U bodem plaat	Thermo Fisher Scientific	163320	Voor antimicrobiële gevoeligheidstesten met de bouillon microdilutiemethode
VITEK 2 AST-P664 kaarten	bioMérieux, Frankrijk	414197	Voor antimicrobiële gevoeligheidstesten
VITEK2 Compact	bioMérieux, Frankrijk	4700030	Voor antimicrobiële gevoeligheidstesten