Multiplexed Immunofluorescentietest voor ruimtelijke beoordeling van senescence-markers in vivo

Samenvatting

Multiplexed immunofluorescentie maakt sequentiële labeling van meerdere antilichaammarkers binnen één weefselsectie mogelijk om ruimtelijke analyse van weefselarchitectuur en celpopulaties te ondersteunen. Hier wordt een workflow gepresenteerd voor multiplexdetectie van senescentie-geassocieerde, structurele en immuunmarkers, inclusief handmatige en geautomatiseerde preparat, iteratieve beeldvorming en single-cell analyse met behulp van digitale pathologiesoftware.

Samenvatting

Multiplexed immunofluorescentie (IF) kleuring vertegenwoordigt een stapsgewijze verandering in verfijning ten opzichte van traditionele IF-beeldvorming, waardoor sequentiële detectie van meerdere antistofmarkers binnen één weefselsectie mogelijk is. Dit vergemakkelijkt profilering van een breder scala aan celtypen en weefselstructuren, en maakt het ook mogelijk om de ruimtelijke relatie tussen deze te beoordelen op een manier die niet haalbaar is met sequentiële doorsneden. Er is geen enkele universele marker van senescentie, en het wordt nu algemeen erkend dat senescence-signaturen variëren per celtype, senescentie-trigger en tijd sinds inductie. Daarom bieden de combinatorische benaderingen die multiplex IF biedt een krachtig hulpmiddel om onbevooroordeelde detectie van senescente cellen binnen één weefselsectie mogelijk te maken.

Hier werden weefselmicroarrays gebruikt met kernen van 34 menselijke weefseltypen. Deze werden gekleurd met een combinatie van structurele, immuun- en senescentiebiomarkers in een 10-plex assay, met beelden die werden gemaakt met een multiplex dia-scanner. Deze methode maakt het mogelijk om de overvloed en ruimtelijke verspreiding van senescente cellen in weefsel te beoordelen. Sequentiële kleuring, beeldvorming en kleurstofinactivatiecycli werden gebruikt om multiplexdatasets te genereren, waarbij beelden werden verkregen met een multiplexfluorescentiedia-scansysteem. Protocollen voor zowel handmatige preparatvoorbereiding als geautomatiseerde verwerking met een dia-kleuringsapparaat worden beschreven, samen met single-cell segmentatie en ruimtelijke analyse met digitale pathologiesoftware. Al met al bieden deze methoden een uitgebreide gids voor het kleuren, beeldvorming en ruimtelijke analyse van senescentie-geassocieerde biomarkers in weefselmonsters, evenals een algemenere gids voor multiplexbeeldvorming.

Inleiding

Senescentie is een complex terminale cellot dat is aangetoond dat het bijdraagt aan een breed scala aan processen, waaronder veroudering, kanker en immuunfunctie, evenals normale weefselhomeostase¹. Er is echter geen universele biomarker van senescentie beschreven, en identificatie is gebaseerd op de beoordeling van een reeks zogenaamde hallmarks². IF-beeldvorming van weefsel is beperkt tot de beoordeling van één of twee biomarkers binnen één sectie, waardoor de beoordeling van combinaties van markers binnen hetzelfde monster een uitdaging maakt³. Dit probleem wordt verergerd door het opkomende beeld van heterogeniteit van senescente cellen op enkelcelniveau⁴, en een tekort aan in vivo senescentiekenmerken², waardoor de selectie van smalle detectiepanelen moeilijk wordt in nieuwe contexten of met waardevolle monsters ^5,6.

Multiplexed IF-beeldvorming heeft als doel deze beperking te overwinnen door de sequentiële detectie van meerdere biomarkers binnen één weefselsectie³ te faciliteren. Dit is mogelijk door het gebruik van fluorescerend getagde oligonucleotidereporters of het gebruik van gelabelde primaire antilichamen waarvan het fluorescerende signaal wordt gedoofd via een kleurstofinactivatieproces⁷. In beide gevallen wordt sequentiële beeldvorming gebruikt om een ruimtelijk opgelost paneel van biomarkers op te bouwen, wat voordelen biedt ten opzichte van traditionele IF-methode voor sequentiële weefselkleuring. Door het genereren van deze complexe profielen binnen één weefselmonster kunnen een groter aantal senescente fenotypen, celtypen en weefselstructuren worden gedetecteerd, wat een geavanceerde beoordeling van hun ruimtelijke relaties en distributie mogelijk maakt⁷.

Hoewel de complexiteit van gemultiplexte IF-beeldvormingsprofielen aanzienlijk hoger ligt dan die van traditionele IF, zijn markerpanelen doorgaans beperkt tot <100 biomarkers vanwege praktische beperkingen³. Deze omvatten zowel het potentiële verlies van epitoopantigeniciteit, signaalintensiteiten of weefselintegriteit bij elke volgende ronde als de uitdaging om grote combinaties van antilichamen te optimaliseren die noodzakelijkerwijs geen kruisreactiviteit^{hoeven te} bevatten ^8,9. Het bepalen van de optimale samenstelling van elke ronde antilichamen is daarom een belangrijke overweging bij het ontwerp van multiplexpanelen. Daardoor is de algehele "plex" kleiner dan die van technieken zoals ruimtelijke transcriptomiek. Aangezien multiplex IF eiwitten kwantificeert in plaats van transcriptniveaus, kunnen de twee technieken als complementair worden beschouwd en gecombineerd worden in grootschalige "multi-omics" pijplijnen¹⁰.

Hier werden menselijke weefselmicroarrays met kernen van 34 weefseltypen gefotografeerd. Deze werden gekleurd met een combinatie van structurele, immuun- en senescentiebiomarkers in een 10-plex assay: Pan-cytokeratine (PANCK), CD31, alfa-gladde musculus actine (aSMA), keratine 15 (K15), vimentine, FOXP3, CD8, Ki67, p16 en Lamin B1. Gedetailleerde stapsgewijze protocollen voor zowel de handmatige voorbereiding van dia's als een aanpassing om automatisering via een geautomatiseerde dia-kleurmaker te integreren, zijn beschikbaar. Representatieve experimentele vergelijkingen tonen aan dat laatstgenoemde zowel de weefselintegriteit verbetert als, voor de meerderheid van de markers, fluorescentiesignaal¹¹. Tot slot wordt een stapsgewijze handleiding verstrekt voor de analyse van gemultiplexeerde weefselmicroarray-beelden via HALO digitale pathologiesoftware, inclusief single-celsegmentatie en ruimtelijke analyse van biomarkerexpressie. Representatieve resultaten tonen de technische haalbaarheid aan van detectie en kwantificatie van senescente cellen op basis van het biomarkerpanel (in tegenstelling tot een uitgebreide biologische validatie van senescentieclassificatie).

Al met al wordt deze methodologie gepresenteerd als gids voor de multiplexbeoordeling van senescentiebiomarkers in vivo , evenals als een algemenere gids voor multiplexing (Figuur 1).

Protocol

Ethische verklaring

De weefselmonsters die in dit werk waren opgenomen, waren overtollig aan de diagnostische vereisten uit het archief van Barts Health NHS, monsters werden verkregen in overeenstemming met alle relevante institutionele en regelgevende richtlijnen en goedgekeurd onder ethische protocollen 10/H0704/65 en 05/QO605/140.

1. Voorberediging van de dia, antigeenophalen en blokkeren

Opmerking: Tenzij anders vermeld, worden alle stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur (~20–25 °C) onder standaard laboratoriumomstandigheden.

1. Initiële samplemontage
   1. Om optimale weefselretentie te garanderen, wordt formaline-vaste paraffine (FFPE) weefselmonsters op hoogwaardige microscopie-glaasjes (positief geladen) gemonteerd, bereid uit een nieuw pakket om minimaal ladingsverlies te garanderen.
   2. Zorg ervoor dat secties niet dikker zijn dan 5 μm met een maximale grootte van 4 x^{2 cm,} centraal gemonteerd om zichtbaarheid binnen het kijkvenster van de Coverslipless Slide Holder te garanderen.
   3. Voer monstervoorbereiding uit handmatig via een ontmaskeringskamer of geautomatiseerd via een geautomatiseerde stainer.
2. Decloakingkamer
   1. Bak tot 24 dijentaas een nacht op 60 °C met het weefsel naar boven gericht.
   2. Verwijder en hydrateer monsters opnieuw met opeenvolgende 5-minuten incubaties in xyleen (voer stap twee keer uit) en verlaag de ethanolconcentraties (100%, 100%, 90%, 70%) door de glaasjes volledig onder te dompelen in elk reagens.
   3. Was de slides door 5 minuten onder te dompelen in PBS (stap twee keer uitvoeren).
   4. Permeabilize slides door 10 minuten te onderdompelen in 0,3% Triton X 100, verdund in PBS.
   5. Was de slides door 5 minuten onder te dompelen in PBS.
   6. Bereid de ontmaskeringskamer voor door de volgende reagentia aan elk van de afzonderlijke secties toe te voegen:
      1. 500 mL ddH₂O in de hoofdkamer.
      2. 250 mL ddH₂O in de centrale reservoirpositie op het metalen rekmandje.
      3. 250 mL pH 6 Antigeen ontmaskeringsoplossing 1 (ARS1) in de linker reservoirpositie op het metalen rekmandje.
      4. 250 mL pH 9 Antigeen ontmaskeringsoplossing 1 (ARS2) in de rechter reservoirpositie op het metalen rackmandje (verdund in ddH₂O uit 10x voorraad).
   7. Dompel monsters onder in ARS1-oplossing en leg een stoomstrip over alle drie de reservoirs.
   8. Plaats het deksel op de ontmantelingskamer en draai om het in de gesloten positie te vergrendelen, zodat de drukafvoerwaarde plat op de druksteel ligt.
   9. Selecteer en start een protocol dat stijgt tot een vooraf ingestelde temperatuur van 110 °C en 4 minuten blijft staan.
   10. Tijdens de verwarmingsfase, wanneer het temperatuurindicatorpaneel 70 °C aangeeft, start je een timer van 20 minuten. Het systeem bereikt temperatuur, houdt stand en begint de druk te verlagen gedurende deze periode.
   11. Decompress het systeem volledig door het drukafvoerventiel voorzichtig te kantelen met een pincet en het deksel te openen. Controleer de stroomstrook om te controleren of de temperatuur is bereikt.
   12. Verplaats de monsters van de ARS1-oplossing naar de ARS2-oplossing. Plaats het deksel van de kamer er weer op (maar vergrendel of herdruk niet op) en start een timer van 20 minuten.
   13. Verwijder het reservoirmandje met de glijbanen naar het werkblad.
   14. Laat het mandje 10 minuten op kamertemperatuur op het aanrecht staan.
   15. Was monsters door het 5 minuten onder te dompelen in PBS (voer deze stap vier keer uit).
   16. Blokmonsters door het onder te dompelen in PBS met 10% donkey Serum en 0,3% BSA gedurende 1 uur.
   17. Was monsters door 5 minuten onder te dompelen in PBS.
   18. Tegenkleurmonsters door het onderdompelen in DAPI (1 μg·^mL-1) verdund in PBS gedurende 15 minuten.
   19. Was monsters door 5 minuten onder te dompelen in PBS.
   20. Bevestig de slides in Coverslipless Slide Holders.
3. Auto slide stainer (bijv. Bond RXm)
   1. Plaats wash, ER1 en ER2 bulkreagentia in de onderste lade.
   2. Zet het systeem aan om te initialiseren.
   3. Zorg ervoor dat afvalcontainers leeg zijn en dat alle andere reagentia boven het minimumniveau liggen.
   4. Bereid de reagensarm voor door de potposities te vullen met de volgende reagentia op de vereiste volumes die het systeem aangeeft voor het totale aantal slides:
      1. Plaats een lege pot met PBS in de reagensarm.
      2. Plaats reagenspot met 0,3% Triton X-100, verdund in PBS, in de reagensarm.
      3. Plaats de reagenspot met blokkerende buffer – 10% donkey serum in 0,3% BSA in PBS in de reagensarm.
      4. Plaats een reagenspot met DAPI (1 μg·^mL-1) verdund in PBS in de reagensarm.
   5. Plaats de hele reagensarm (met voorbereide containerpotten) in het systeem.
   6. Volg de instructies op het scherm en stel een geautomatiseerd kleuringsprotocol op dat de volgende stappen bevat die 's nachts uitgevoerd moeten worden:
      1. Bak 10 uur op 60 °C.
      2. Incubeer met 0,3% Triton X-100 verdund in PBS (10 min).
      3. Was met bulk wash reagens (vooraf geprogrammeerde routine).
      4. Incubeer met Epitope Retrieval 1 (ER1) bulk reagens (20 min, 100 °C).
      5. Was met bulk wash reagens (vooraf geprogrammeerde routine).
      6. Incubeer met Epitope Retrieval 2 (ER2) bulk reagens (20 min, 100 °C).
      7. Was drie keer met bulk wash reagens (vooraf geprogrammeerde routine).
      8. Incubeer met Blocking Buffer - 10% donkey serum en 0,3% BSA in PBS (1 uur).
      9. DAPI (1 μg·^mL-1 in PBS) vier keer gedurende 5 minuten telkens.
      10. Wash (voorgeprogrammeerde routine).
   7. Zorg ervoor dat alle toevoegingsvolumes op 150 μL zijn ingesteld en dat de voorbereidingsstap wordt ingesteld op dewax via het keuzemenu.
   8. Voeg details toe voor maximaal 30 dia's en print barcodelabels.
   9. Verwijder de schuifplaat en plaats de slides met de kant naar boven in. Voeg bedektegels toe over elke slide met de uitkant naar boven. Plaats de barcodelabels zodat ze van boven naar onder op de dia lezen.
   10. Plaats de schuiflade terug in de autostainer en vergrendel via de knop voor de voorkant.
   11. Druk op de startknop voor elke schuifarm die momenteel met slides geladen is.
       Opmerking: Het volledige protocol duurt ~15 uur om te draaien (inclusief 10 uur bakken). De starttijd kan worden vertraagd om rehydratatiewassingen te besparen.
   12. Bevestig de glijbanen in Coverslipless Slide Holders na voltooiing van de cyclus.
4. Laadend Dekselsliploze Schuifhouder
   1. Plaats schuifstukken in de Coverslipless Slide Holder, waarbij je de boven- en rechterranden uitlijnt met de metalen stoppen.
   2. Vergrendel de schuif met de plastic nokken (beide tegelijk gebruiken) door naar de gesloten hangslot te draaien.
   3. Controleer of de slede volledig plat zit en niet in de houder wiegt.
   4. Plaats de Coverslipless Slide Holder-inzetkamer over de schuif door met twee handen de zijbek in te knijpen om de druk te beperken en breuken te voorkomen.
   5. Laad de Coverslipless Slide Holder via de inlaatpoort met 2 mL montagemedium dat bestaat uit 50% glycerol in PBS.
   6. Voeg een barcodelabel toe aan de dia-kant zelf aan de linkerkant van de slide, in beide oriëntaties.
   7. Ga verder met beeldvorming.

2. Multiplexbeeldvorming

1. Regioselectie en autofluorescentiebeeldvorming
   1. Open de multiplex imaging acquisitiesoftware (bijv. Mx workflow (4.2.0.4)) en maak een protocol met de benodigde rondes/biomarkers en belichtingstijden met behulp van de protocol publisher wizard.
      Opmerking: Bepaal vooraf de toewijzing van elk antilichaam aan de beschikbare kanalen. Beperk zwakke markers (dus die met langere belichtingstijden) tot Cy5- en Cy7-kanalen die de minste autofluorescentie hebben. Maximaal 4 antilichamen per ronde kunnen worden gebruikt in het multiplex fluorescentiebeeldvormingssysteem.
   2. Als virtuele H&E-afbeeldingen nodig zijn, zorg dan dat het Cy3-kanaal is verkregen.
   3. Voeg de dia's toe aan een protocol (met het barcodenummer) via de batch creator-tool om een multiplex-experimentworkflow te creëren.
   4. Laad de preparaat in de microscoop via de acquisitiesoftware (4.2.0.4) en volg de workflow door interessegebieden te tekenen via de 2x en 10x beeldstappen voor elke dia. Zorg er bij het selecteren van regio's voor dat elk gezichtsveld minstens twee buren heeft om stikproblemen te voorkomen.
   5. Minimaliseer het aantal lege glazen dat wordt afgebeeld om stitching-problemen te voorkomen en verkort de looptijden door lege velden niet te selecteren.
   6. Voer de 20x autofluorescentiebeeldvorming uit met de belichtingstijden die in stap 2.1.1 zijn ingesteld en volg de kwaliteitscontrolehandleiding (QC). Controleer visueel of er geen onscherpe gebieden of artefacten zijn. Als deze worden geïdentificeerd, faal dan de kwaliteitscontrole en reimage.
      Opmerking: Er is geen enkele maatstaf voor acceptabele QC-strengheid, en succes hangt af van de vereiste experimentele uitlezingen en hoe waardevol het monster is. Scherp gefocust weefsel met voldoende kleurintensiteit moet idealiter visueel scherp en helder overkomen. Kleine gebieden van weefselloslating/-afbraak worden vaak waargenomen, die niet verbeteren met extra beeldvorming en kunnen worden getolereerd als de rest van het monster goed is gefotografeerd. Als er grote heldere artefacten worden waargenomen (bijvoorbeeld stof), is het het beste om deze te verwijderen door de glaasglaa schoon te maken en opnieuw te beelden.
   7. Genereer achtergrondbeelden die worden afgetrokken van het uiteindelijke biomarkersignaal, in een proces dat herhaald wordt voor elke multiplexronde.
      Opmerking: Alle multiplexkogels worden automatisch uitgelijnd via de acquisitiesoftware.
2. Gebruik van een robotische plaatbehandelaar
   1. Zorg ervoor dat de acquisitiesoftware gesloten is.
   2. Open de Robotic-integratiesoftware en klik op start.
   3. Plaats de gestapelde Coverslipless Slide Holder in de invoerstapel.
   4. Zorg ervoor dat de outputstack leeg is.
   5. Open de Robotic Plate Handler Control Software (bijv. Harmony robotica software (3.2.0)) en volg de wizard, waarbij je ervoor zorgt dat het juiste type en nummer van de plaat zijn geselecteerd.
   6. Klik op start en de plaatbehandelaar laadt de microscoop, die automatisch de juiste workflowfase weet dankzij de diabarcode.
      OPMERKING: Als je de robotische loader gebruikt voor de onderstaande biomarker-beeldvormingsstappen, is het essentieel om de optie "dynamisch ingestelde belichtingstijden" in de software te hebben uitgezet en vooraf ingestelde belichtingstijden te gebruiken.
3. Sequentiële biomarkerkleuring, kleurstofinactivatie en multiplexbeeldvorming
   1. Centrifugeer antilichamen op 13.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur om artefacten te beperken.
   2. Bereid de antistofoplossing voor in PBS met 0,3% BSA.
      Opmerking: De uiteindelijke antistofconcentraties zullen variëren, maar een verdunning van 1:200 is een goed uitgangspunt voor optimalisatie van een nieuw antilichaam.
   3. Verwijder het montagemateriaal door uit de poort van de Coverslipless Slide Holder te pipetteren en was door 2 mL PBS met 0,01% Tween 5 minuten toe te voegen (herhaal deze stap drie keer).
   4. Verwijder PBS en voer antilichaamkleuring uit door 350 μL antistofoplossing, verdund in PBS, in de poort te pipetten. Dit volume is geoptimaliseerd om volledige monsterbedekking binnen de kleuringskamer te garanderen.
   5. Broeuw 1 uur op kamertemperatuur op het aanrecht.
   6. Verwijder de antilichaamoplossing door te pipetten via de Coverslipless Slide Holder-poort en was door 2 mL PBS toe te voegen met 0,01% Tween gedurende 5 minuten (herhaal deze stap drie keer).
   7. Verwijder PBS en voeg 2 mL montagemateriaal toe.
   8. Steek de Coverslipless Slide Holder in de microscoop om de automatische ronde specifieke beeldvorming te starten.
   9. Na voltooiing vordert de workflow door QC-stappen zoals aangegeven op het scherm te doorgeven.
   10. Verwijder het montagemateriaal door uit de poort van de Coverslipless Slide Holder te pipetteren en was door 2 mL PBS met 0,01% Tween 5 minuten toe te voegen (herhaal deze stap drie keer).
   11. Bereid de kleurstofinactivatieoplossing vers voor met 7 mL ddH₂O, 2 mL 0,5M NaHCO₃ en 1 mL 30% H2_O2. Bereid deze oplossing direct voor gebruik voor en breng deze direct aan op de slides.
       Let op: waterstofperoxide moet worden behandeld met geschikte laboratoriumpersoonlijke beschermingsmiddelen.
   12. Verwijder PBS en voeg 2 ml kleurstofinactivatie per dia, direct nadat H₂O_{2 aan} de werkoplossing is toegevoegd.
   13. Incubeer 15 minuten op het werkblad in de schuifhouder.
   14. Verwijder de inactivatieoplossing van de kleurstof door uit de Coverslipless Slide Holder-poort te pipetten en was deze 5 minuten in 2 mL PBS met 0,01% Tween.
   15. Verwijder PBS en voeg 2 mL montagemateriaal toe.
   16. Steek de houder van de Coverslipless Slide Holder in de microscoop om automatische ronde specifieke 20x autofluorescentiebeeldvorming te starten.
   17. Na voltooiing vordert de workflow door QC-stappen zoals aangegeven op het scherm te doorgeven.
   18. Herhaal stappen 2.3.1 tot 2.3.17 voor zoveel rondes/markers als nodig is. (De procedure is door de fabrikant tot 10 patronen gevalideerd, hoewel weefselintegriteit de primaire bepalende factor van deze limiet zal zijn).

3. Geautomatiseerde HighPlex-analyse via digitale pathologiesoftware

1. Data laden en segmenteren van TMA
   1. Sleep en drop gemultiplexeerde IF-afbeeldingen in het tabblad "studies" in de Digital Pathology Software.
      1. Virtuele H&E-afbeeldingen moeten afzonderlijk worden geïmporteerd.
   2. Voor weefselmicroarray (TMA) monsters gebruik de "TMA-module". Dit maakt het mogelijk om per kern te labelen, waardoor het bijhouden van gegevens veel eenvoudiger is dan het behandelen van de dia als geheel.
   3. Om een TMA-blok te maken, navigeer je eerst naar blokkadeacties en maak je een nieuwe TMA-kaart.
      1. Dit kan handmatig worden ingevoerd of met een Excel-spreadsheet via de importwizard.
   4. Segmenteer de TMA door met de rechtermuisknop op het monster in het tabblad studies te klikken en "Segment TMA" te selecteren.
   5. Selecteer de grootte van de kernen en lijn ze uit op de kaart door de rode vakjes te verplaatsen. Klik op opslaan zodra het klaar is.
   6. Analyse en data-export kunnen nu op een kerngewijze manier worden uitgevoerd.
      Opmerking: De volgende pijplijn kan ook worden uitgevoerd op volledige weefselsecties zonder gebruik van de TMA-module.
2. Segmentatie van één doelwit
   1. Ga naar het tabblad analyse.
   2. Klik in het keuzemenu "instellingen acties" op laden en selecteer de HighPlex fluorescentieanalysemodule.
      1. Voor deze resultaten werd v5.2.2 gebruikt.
      2. Bij kleurstofselectie vul je de markers handmatig in of via de functie "autofill doften".
      3. Bij nucleaire detectie kies een segmentatietype dat past bij de versie van HALO (hier wordt de traditionele, niet-AI-versie beschreven).
      4. Stel de nucleaire contrastdrempel in om kernen op te nemen (meestal in het bereik van 0,4 – 0,6).
         1. Stel de minimale kernintensiteit in om kernen op te pikken (meestal niet lager dan 0,05).
         2. Verlaag de maximale beeldhelderheid tot ongeveer 0,4, afhankelijk van de intensiteit van het DAPI-signaal (verlaagd van 1 vanwege het dynamisch bereik van 16-bits beelden).
         3. Pas verdere parameters aan, zoals segmentatieagressie, vulgaten en groottefilters, afhankelijk van het weefseltype.
      5. Herhaal dit proces voor membraan- en cytoplasmadetectie.
         1. Voor traditionele cytoplasmadetectie is een kraagradius tussen 2 en 5 vaak een goed uitgangspunt.
3. Biomarker positieve drempelselectie
   1. Elke biomarker die bij de kleurstofselectie wordt geselecteerd, wordt gemeten op ruwe intensiteitswaarden.
   2. Stel voor elke marker een binaire (positief versus negatief) of meerdere (hoog, middel, laag, negatief) drempelclassificaties in, en pas de waarden aan met behulp van de schuifregelaars in de nucleaire, cytoplasmatische of membraancompartimenten afhankelijk van het kleuringspatroon.
      1. Om een binaire drempel in te stellen, pas je alleen de onderste schuifregelaar aan om de afkapwaarde te bepalen.
      2. Beoordeel de prestaties met behulp van het realtime tuningvenster in het menu "Analyseren" en door het analysemasker aan en uit te zetten om te vergelijken met ruwe kleuringsniveaus.
   3. Maak combinaties van markers door gebruik te maken van de functie "fenotypes".
      1. Logische gating bevat EN/OF positief/negatief voor alle markers, waardoor een onbeperkte matrix over alle vlekken kan worden geconstrueerd.
   4. Stel save objectdata in op waar als single target data nodig is (vereist voor ruimtelijke analyse).
   5. Sla het protocol op en selecteer in het tabblad studies alle dia's voor analyse, klik met de rechtermuisknop en analyseer met het gewenste protocol.

4. Resultaten herzien

1. Ruimtelijke beoordeling in digitale pathologiesoftware
   1. Bekijk alle resultaten in het tabblad "resultaten" van de digitale pathologiesoftware.
   2. De samenvattingstabel bovenaan zal gemiddelden bevatten van alle kenmerken in de huidige afbeelding.
      1. Dit geldt voor één enkele kern als het apart wordt geopend.
   3. De onderste tabel toont de enkele doelgegevens voor elke functie.
      1. Onderzoek individuele datapunten door te selecteren uit de tabel of door op de afbeelding te klikken.
   4. Filter fenotypes, markerpositiviteit of intensiteitsdrempels in de juiste kolommen. Deze kunnen vervolgens worden uitgezet door te navigeren naar: "object action" > "plot" > "spatial plot".
   5. Zodra dit voor verschillende groepen is gedaan, kan ruimtelijke analyse worden uitgevoerd.
   6. Selecteer de knop "ruimtelijke analyse" en selecteer de opties zoals nodig:
      1. Dichtstbijzijnde buur: Zal de afstand tot de dichtstbijzijnde observatie van een bepaald celtype van een ander celtype vinden.
      2. Nabijheidsanalyse: Meet in banden rond een geselecteerd celtype en kwantificeert zowel het aantal als de afstand van elk ander celtype.
      3. Infiltratieanalyse: Meet in banden de afstand naar een gespecificeerde annotatielaag (gemarkeerd op de afbeelding via de annotatietool) waarin een bepaald celtype wordt gevonden.
      4. Density Heatmap: Genereert een visualisatie van de verdeling van een celtype door het hele beeld.
   7. Ruimtelijke analyse kan worden uitgevoerd op alle TMA-cores via de knop "spots result" onder slide actions en het keuzemenu "results actions".
2. Resultaten exporteren uit Digitale pathologiesoftware
   1. Resultaten kunnen worden geëxporteerd vanuit het tabblad TMA door te navigeren naar de "slide actions" > "export".
   2. Alleen samenvattende gegevens of volledige analyse van één doelwit kunnen worden geëxporteerd via het geavanceerde tabblad.
   3. Genereer data als .csv bestanden die vervolgens geanalyseerd kunnen worden in software zoals R om populatieniveau-analyse van biomarkerintensiteit over alle cellen te maken. Enkele objectkenmerken zijn onder andere: Sample ID, unieke object-ID (per cel), ruwe intensiteitswaarden voor elke marker, fenotypeclassificaties en ruimtelijke coördinaten.

Resultaten

10-plex IF en gekoppelde virtuele H& E-beelden werden gegenereerd voor 136 weefselmicroarray-kernen die 34 menselijke weefseltypen omvatten over twee preparaten die met verschillende methodologieën zijn gemaakt (Figuur 2). Deze representatieve beelden tonen succesvolle multiplexkleuring met behouden weefselmorfologie en duidelijke detectie van meerdere biomarkers over microarraykernen van weefsels. De ene slide maakte gebruik van de geautomatiseerde slidestainer, de andere het handmatige paradevoorbereidingsproces. Een grotere incidentie van weefselartefacten werd waargenomen met de handmatige decloaking-kamergebaseerde methode, inclusief weefselloslating, evenals verloren of verschuifte kernen (Figuur 3). Deze artefacten verminderen het analyseerbare weefselgebied per monster of kern, waardoor de downstream multiplex-beeldanalyse wordt beïnvloed. Deze observaties bevestigen dat het protocol betrouwbare multiplexkleuring en beeldvorming mogelijk maakt over diverse weefseltypen.

Succesvolle multiplexbeeldvorming wordt aangetoond door behouden weefselmorfologie, consistente uitlijning over kleuringsrondes en duidelijke, specifieke biomarkersignalendetectie. Daarentegen worden suboptimale uitkomsten gekenmerkt door weefselloslating, signaalverlies of beeldvormingsartefacten die analyseerbare gebieden verminderen en de downstream analyse belemmeren.

Vervolgens werden het kleuringsprofiel van markers zoals PANCK (epitheelweefsel), CD31 (endotheelweefsel), aSMA (stromaal weefsel), keratine 15 (K15; basaal epitheel), vimentine (mesenchymale cellen), Ki67 (proliferatiemarker), CD8 (cytotoxische T-cellen) en FOXP3 (TREG's) vergeleken over beide preparatisatietechnieken, met een kleine vermindering van het signaal kwalitatief (visueel) waargenomen met de handmatige methode (Figuur 4A)). Door gebruik te maken van biomarkerclassificatiedrempels in Digital Pathology Software, werden de monsters gestratificeerd in positieve en negatieve populaties voor elk van de ~630K cellen in de dataset (Figuur 4B). Kwantitatieve beoordeling van het markersignaal werd uitgevoerd met intensiteitsmetingen afkomstig uit de digitale pathologieanalyseworkflow. Schattingen van de populatiedichtheid (waarbij het gebied onder de curve 100% van de bevolking vertegenwoordigt) en mediane intensiteitswaarden toonden bescheiden stijgingen van 5/8 biomarkers binnen positieve populaties bij gebruik van de geautomatiseerde diakleuring vergeleken met het handmatige proces (Figuur 4C).

Na het voltooien van het panel werden de hierboven beschreven markers vervolgens gekoppeld aan verdere biomarkers voor Lamin B1 (nucleair membraan) en p16 (cycline-afhankelijke kinaseremmer), waardoor de relatieve weefselabundantie en de verdeling van alle 10 markers in één monster zichtbaar werden (Figuur 5). Het vermogen om een groot aantal biomarkers te profileren is van bijzonder belang in het veld van senescentie, dat afhankelijk is van de beoordeling van meerdere orthogonale markers om een geldige classificatie^{te garanderen 2}. Hier konden we de veranderingen in Lamin B1-intensiteit binnen p16 hoge en lage populaties profileren. Belangrijk is dat, omdat dit een multiplexmonster was, deze cellen in een ruimtelijke context konden worden geplaatst door te vergelijken met de verdeling van andere celtypen binnen hetzelfde weefsel (Figuur 6A). Via de Digital Pathology Software classificatiedrempel werd deze kleuring gekwantificeerd om aan te tonen dat de p16-positieve cellen geassocieerd waren met lagere niveaus van Lamin B1 dan hun negatieve tegenhangers (Figuur 6B), een profiel dat overeenkomt met eerder beschreven senescentie-geassocieerde markerpatronen¹². We observeerden ook dat Lamin B1-negatieve cellen hogere niveaus van p16 hadden (Figuur 6C). Met behulp van de fenotypefunctie in de Digital Pathology Software (die cellen classificeert op basis van single-celsegmentatie en drempeling van meerdere markers), werd de combinatie van deze markers vervolgens gebruikt om een populatie cellen als senescent te definiëren, dat wil zeggen dat ze zowel p16-positief als Lamin B1-negatief zijn. Vervolgens werd het aandeel van deze cellen over alle kernen per weefseltype gekwantificeerd, samen met elk van de 10 markers afzonderlijk (Figuur 6D). Deze output maakt kwantitatieve vergelijking mogelijk van biomarker-gedefinieerde celpopulaties over meerdere weefseltypen binnen de multiplexdataset. Hoewel de analysepijplijn op single-celniveau werkt, wordt de huidige dataset voornamelijk gepresenteerd met behulp van populatieniveauverdelingen. De relatief lage hoeveelheid p16-positieve cellen in deze dataset kan de statistische kracht voor robuuste cel-voor-cel correlatieanalyse tussen p16 en Lamin B1 beperken, en daarom moeten dergelijke relaties met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd.

Figuur 1: Schema dat de volledige multiplex immunofluorescentieworkflow toont. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van multiplex beeldvorming: (A-B): Virtueel H& E-beelden gegenereerd uit de DAPI-kleuring en Cy3-autofluorescentie van ronde 1 om de weefselintegriteit van de preparaten te visualiseren die zijn voorbereid met behulp van de geautomatiseerde glaaskleurings- of handmatige preparatvoorbereidingsprocessen. (C-D): Multiplex-IF-kleuring van alle biomarkers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbeelden van artefacttypes: Representatieve voorbeelden van verschillende soorten artefacten die voornamelijk tijdens de preparatvoorbereiding van de preparaat kunnen worden gegenereerd. Gedeeltelijke weefselloslating kan worden waargenomen als onscherpe gebieden en kan problemen veroorzaken met de weefseluitlijning in volgende rondes. Ontbrekende kernen verminderen de experimentele kracht en komen vaak onevenredig vaak voor bij gevoelige weefseltypen. Verschoven of overlappende kernen ontstaan wanneer een kern losraakt van zijn positie op de TMA maar aan een ander gebied blijft hangen, waardoor het verlies van monster wordt verergerd doordat de verborgen kern moeilijk te analyseren is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van BOND autostainer en handmatig fluorescentiesignaal voor slide-voorbereiding: (A): Representatieve IF-kleuring voor structurele markers pan cytokeratine (PANCK), CD31 en alfa gladde spieractine (aSMA). Een samenvoeging van deze drie afbeeldingen wordt weergegeven in de eerste kolom. (B): Digital Pathology Software binaire classificatie-analysemaskers, die positieve markerdetectie aangeven over verschillende celtypes: CD31 (rood), FOXP3 (turquoise), Ki67 (geel), CD8 (wit), PANCK (groen). Wit vakje geeft het digitale zoomgebied aan in de onderste panelen. (C): Kwantificatie van biomarkerintensiteit in celpopulaties gegroepeerd op weefselvoorbereidingsmethode (een geautomatiseerde dia-kleuring = rood, Manual = blauw) en markerpositiviteit (donker = negatief, licht = positief). Het gebied onder elke dichtheidsplot vertegenwoordigt 100% van de geanalyseerde celpopulatie. AF = Autofluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Volledig multiplexpaneel: Representatieve beelden van appendixweefsel met A-B: volledig 10-plex IF-paneel C: PANCK (groen), D: CD31 (rood), E:aSMA (geel), F: K15 (roze), G: Vimentin (wit), H: Lamin B1 (turquoise), I:p16 (goud), J: Ki67 (felgeel), K: CD8 (felgroen) en L: FOXP3 (paars). Wit vakje = digitale zoom (Merge, CD31, aSMA, K15, Vim, LB1, p16), gestippelde doos = digitale zoom (Ki67, CD8, FOXP3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Detectie van senesescentiemarker: (A): Representatieve IF uit beelden van het alvleesklierweefsel die contrasterende kleurpatronen van Lamin B1 (turquoise) en p16 (goud) tonen, samen met ruimtelijke relatie met andere markers PANCK (groen), CD31 (rood) en Vimentin (wit). (B): Kwantificatie van de intensiteit van de lamin B1 (LB1) kern in p16 positieve en negatieve celpopulaties. (C): Kwantificatie van p16-cellulaire intensiteit in Lamin B1 (LB1) positieve en negatieve celpopulaties. Het dichtheidsplotgebied onder de curve vertegenwoordigt 100% van de bevolking. (D): Z-score genormaliseerde heatmap van gemiddelde kernpercentage positiviteit voor elk biomarker- of senescencefenotype (p16+/LB1-ve) over weefseltypen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Multiplexed IF-beeldvorming via geautomatiseerde platforms faciliteert de generatie van genuanceerde profielen van een groot panel biomarkers binnen enkelweefselsecties¹³. In combinatie met digitale pathologiesoftware, zoals HALO, maakt dit het mogelijk om zowel de overvloed als de ruimtelijke relaties van celtypen ten opzichte van elkaar te onderzoeken, evenals hun verspreiding via verschillende weefselstructuren³. Dit heeft het potentieel om aanzienlijke waarde toe te voegen aan het vakgebied van senescentie, dat afhankelijk is van profileringscombinaties van kenmerken voor een robuuste classificatie van senescente cellen, die op hun beurt aanzienlijke heterogeniteit bezitten en dus enkelvoudige doelcelprofilering vereisen, wat niet mogelijk is met sequentiële weefselsecties¹⁴. Bovendien varieert de last van senescente cellen per weefsel, kan het zich tijdens de veroudering met verschillende snelheden ophopen, en is er een vastgesteld tekort aan betrouwbare in vivo markers van ouderdom, waardoor het gebruik van een groter panel biomarkers wenselijk is in nieuwe contexten waar meer flexibiliteit vereist kan zijn ^5,15,16. Belangrijk is dat eerdere studies hebben aangetoond dat de accumulatie en temporele dynamiek van senescente cellen sterk weefselafhankelijk zijn, met aanzienlijke variatie in zowel de hoeveelheid als het ontstaan tussen orgaansystemen, wat aantoont dat senescentie niet synchroon plaatsvindt tussen weefsels. Alternatieve ruimtelijke profileringstechnieken, zoals ruimtelijke transcriptomiek of beeldvorming van massacytometrie, kunnen complementaire moleculaire informatie bieden; Multiplex immunofluorescentie meet echter direct eiwitexpressie en maakt hoogresolutie ruimtelijke analyse van celfenotypes binnen intacte weefselsecties mogelijk. De sequentiële aard van multiplex IF leent zich ook voor een iteratieve ontdekkingspijplijn.

Multiplex IF-beeldvorming kan worden uitgevoerd in workflows met hoge doorvoer door te integreren met een geautomatiseerde dia-stainer. Naast het bieden van aanzienlijke voordelen op het gebied van standaardisatie, lijkt de geautomatiseerde preparatvoorbereiding ook te leiden tot minder artefacten dan een handmatige benadering met een onthullingskamer, omdat er minder weefselloslating en verloren kernen werden waargenomen. Deze waarnemingen zijn echter gebaseerd op kwalitatieve vergelijkingen, en verdere kwantitatieve evaluatie zou nodig zijn om formeel verschillen in door verwerking veroorzaakte weefselschade vast te stellen. Dit is een bijzonder probleem bij vetweefseltypen zoals huid en borsten. Bovendien maakt het Coverslipless Slide Holder-systeem integratie met robotische plaathanteerders mogelijk, wat een hogere doorvoer mogelijk maakt en de tijd van de operator vermindert door workflowverbeteringen zoals nachtelijke beeldvormingsrondes. Hoewel automatisering naar verwachting de doorvoersnelheid en standaardisatie zal verbeteren, werd kwantitatieve benchmarking van deze verbeteringen in deze studie niet formeel beoordeeld en moet deze worden geïnterpreteerd als een praktische observatie in plaats van als een gemeten uitkomst. Met monsters die als weefselmicroarrays zijn voorbereid, wordt het haalbaar om deze uitgebreide analyses te genereren voor honderden patiëntenmonsters over een relatief laag aantal preparaten, wat toekomstige studies naar senescente cellen in klinische^{weefselmonsters} mogelijk kan maken^.

Hoewel lichte toename in markerintensiteiten met de geautomatiseerde dia-kleuringsmachine ten opzichte van het handmatige preparatproces werd waargenomen, is dit voordeel in de praktijk gering, aangezien een laag signaal meestal kan worden overwonnen door langere belichtingstijden of aanpassingen aan analysedrempels. Verschillende belangrijke stappen hebben een cruciale invloed op het succes van de assay, waaronder optimalisatie van antistoffen, multiplexpanelontwerp en selectie van beeldvormingsparameters. Zorgvuldige validatie van antistofcompatibiliteit, signaalintensiteit en weerstand tegen herhaalde kleuringscycli is essentieel om reproduceerbare en hoogwaardige multiplexdata te garanderen. Veel belangrijker is de optimalisatie van ronden en kanaalselectie van biomarkers. Deze worden afzonderlijk en in combinatie op testmonsters beoordeeld om te waarborgen dat er geen kruisreactiviteit tussen antistoffen is, en om aan te tonen dat kleurstofinactivatie en epitoopdetectie mogelijk zijn in de gewenste rondes. Het wordt aanbevolen zwakke of minder overvloedige markers te gebruiken in de Cy5- en Cy7-kanalen, die doorgaans een lagere autofluorescentie vertonen. Het uiteindelijke paneel wordt getest op het weefseltype dat geïnteresseerd is, aangezien sommige veelgebruikte optimalisatieweefsels (bijv. amandelen) vaak lagere concentraties en blootstellingstijden vereisen dan experimentele instellingen, die ook kunnen verschillen in eigenschappen zoals autofluorescentie. Dergelijke positieve controleweefsels kunnen echter nuttig zijn wanneer de aanwezigheid van celtypen onzeker is in experimentele weefsels, omdat een gebrek aan signaal niet gemakkelijk te onderscheiden is van het ontbreken van doelcellen. Nauwkeurigheid bij deze paneloptimalisaties binnen het doelweefseltype is de belangrijkste experimentele stap om een succesvolle assay te garanderen, om het verlies van biomarkers bij de laatste experimentele runs te minimaliseren. De meeste problemen ontstaan door kruisreacties van antilichamen, onvoldoende signaal door lage antistofconcentraties of lage signaal-ruis in FITC/Cy3-kanalen. Daarnaast is antigeenbehoud onder herhaalde kleurstofinactivatiestappen zowel antilichaam- als weefselafhankelijk, wat het gebruik van uitgebreide optimalisatiestappen verder noodzakelijk maakt om de juiste panel- en rondesamenstellingen voor de experimentele monsters te selecteren. Een belangrijke beperking van multiplex immunofluorescentieworkflows is de afhankelijkheid van hoogwaardige antilichamen, samen met de stabiliteit van epitopen over herhaalde kleurings- en kleurstofinactivatiecycli.

Al met al vertegenwoordigt de gemultiplexeerde beeldvorming, gekoppeld aan automatiseringsplatforms, een grote verandering in verfijning voor de IF-beoordeling van in vivo weefselmonsters, wat een uitgebreide ruimtelijke analyse van complexe panelen biomarkers op enkelcelniveau mogelijk maakt. Toekomstige toepassingen van deze workflow omvatten grootschalige profilering van senescentie-geassocieerde biomarkers over diverse weefseltypen en integratie met opkomende ruimtelijke omics-benaderingen om cellulaire heterogeniteit binnen complexe weefselomgevingen verder op te lossen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
30% Waterstofperoxide (H2O2)	Merck	H1009
Antigeen unmasking oplossing 1 (H3300) (ARS1)	Vector Labs.	H-3300	Bereid met 12,5 ml Antigen Unmasking Solution + 237,5 ml ddH2O
Antigeen unmasking oplossing 2 (ARS2)	Sigma	T6066 / E5134	Bereid 10x stock (12,9 g Trizma base, 3,7 g EDTA, 5 mL Tween 20, 995 mL ddH20).
Bovine Serum Albumine (BSA)	Merck	A2153
Bulk Dewaxing Oplossing	Leica	AR9222
Bulk Epitope Retrieval 1 (ER1)	Leica	AR9961
Bulk  Epitope Retrieval (ER2)	Leica	AR9640
Bulk Wash Oplossing	Leica	AR9590
DAPI	Merck	D3571
Dubbel gedistilleerd water (ddH20)	N/A	N/A
DMSO	Merck	472301
Ezelserum	Merck	D9663
EDTA	Merck	E5134
Glycerol	Merck	G5516
NaHCO3	Merck	S5761
Fosfaat Buffered Saline (PBS)	Merck	BP399
Propyl Gallaat	Merck	P3130
Natrium Bicarbonaat	Merck	S5761
Triton X 100	Merck	H5141
Trizma Base	Merck	T6066
Tween20	Merck	P1379
Andere verbruiksartikelen of apparatuur
Decloaking kamer	BioCare	DC2012
Steam strips	BioCare	613QC
Bond RXm Auto Slide Stainer	Leica	HIS2330	Verwezen naar als geautomatiseerde slide stainer
Cell DIVE	Leica	29429159	Verwezen naar als multiplex fluorescendiebeeldvormingssysteem
Click Well slide houders	Leica	29463259	Verwezen naar als Well Coverslipless Slide Holder
Antilichaam Lijst
CD31 (Pecam-1)	Cell Signalling	61255	Clone: 89C2 Fluorofoor: AF555 Verdunning: 1 op 50
CD8a	BioLegend	372906	Clone: C8/144B Fluorofoor: Alexa 647 Verdunning: 1 op 100
CDKN2A/p16	Santa Cruz	sc-56330 AF647	Clone: jc8 Fluorofoor: Alexa 647 Verdunning: 1 op 200
FOXP3	BioLegend	320114	Clone: 206D Fluorofoor: Alexa 647 Verdunning: 1 op 50
Keratine 15	Abcam	ab194065	Clone: EPR1614Y Fluorofoor: AF_488 Verdunning: 1 op 200
Ki67	Abcam	ab215226	Clone: EPR3610 Fluorofoor: AF555 Verdunning: 1 op 50
Lamin B1	Abcam	ab194106	Clone: EPR8985(B) Fluorofoor: AF_488 Verdunning: 1 op 100
PanCK_AE1/AE3	Thermofisher	53-9003-82	Clone: AE1/AE3 Fluorofoor: AF_488 Verdunning: 1 op 100
SMA	R&D systems	IC1420S	Clone: 1A4 Fluorofoor: Alexa 750 Verdunning: 1 op 100
Vimentin	Cell Signalling	69227	Clone: D21H3 Fluorofoor: Alexa 750 Verdunning: 1 op 100