Isolatie van pericyten uit muiscorticaal weefsel met FACS voor single-cell sequencing

Samenvatting

Om muishersencorticale pericyten te verkrijgen die voldoen aan de eisen van scRNA-seq, presenteren we een kritisch geoptimaliseerd FACS-protocol gebaseerd op CD13/CD31⁻-selectie. Onze belangrijke verfijningen verbeteren de levensvatbaarheid van cellen en de integriteit van RNA aanzienlijk, waardoor betrouwbare transcriptomische profilering mogelijk wordt.

Samenvatting

Pericyten, als kernonderdeel van de neurovasculaire eenheid, spelen een essentiële rol bij het behouden van de integriteit van de bloed-hersenbarrière en het reguleren van de cerebrale hemodynamica homeostase door modulatie van de microvasculaire tonus. Disfunctie van pericyten wordt in verband gebracht met diverse neurologische aandoeningen. Om de heterogeniteit van pericyten te onderzoeken en hun mechanismen bij neurovasculaire ziekten bij enkelcelresolutie te verduidelijken, hebben we een geoptimaliseerd en reproduceerbaar protocol ontwikkeld voor het isoleren van hersenpericyten van muizen die geschikt zijn voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq). Deze methode bouwt voort op de gevestigde CD13^+/CD31-sorteerstrategie, maar bevat belangrijke verbeteringen die specifiek zijn afgestemd op scRNA-seq-toepassingen. Kort gezegd werden hersenen geoogst van drie volwassen C57BL/6 muizen. Het hersenweefsel werd mechanisch gedissocieerd en onderworpen aan enzymatische vertering om eencellige suspenties te verkrijgen. Na sequentiële centrifugatie werd de uiteindelijke celpellet opnieuw opgehangen in 20% bovine serumalbumine (BSA) oplossing, een cruciale stap die we introduceerden om stress en aggregatie te minimaliseren, waardoor de levensvatbaarheid en RNA-kwaliteit voor sequencing werden gemaximaliseerd. Deze geoptimaliseerde, op FACS gebaseerde benadering maakt het mogelijk om levensvatbare muizen-hersenpericyten robuust te isoleren, waarmee ze voldoen aan de strenge eisen voor scRNA-seq, en biedt een krachtig hulpmiddel om pericytenheterogeniteit en hun pathologische rol bij neurovasculaire ziekten te ontleden.

Inleiding

Pericyten zijn een belangrijk type cel dat zich langs microvaten bevindt, meestal ingebed in het capillaire basale membraan en endotheelcellen^{omhult 1}. In de hersenen vormen pericyten, samen met endotheelcellen, astrocyten en andere celtypen, de neurovasculaire eenheid en zijn ze integraal onderdeel van de structuur en functie van de bloed-hersenbarrière (BBB). Pericyten spelen essentiële rollen bij de regulatie van de cerebrale bloedstroom, de vervorming van de vaaten en het behoud van de vasculaire homeostase. Ze behouden de integriteit van de BBB door nauwe fysieke interacties en paracriene signalering met naburige cellen²; het transendotheliale transport dynamisch reguleren via endocytose en de expressie van specifieke transporterproteïnen; en bijdragen aan cerebrale hemodynamische stabiliteit door hun contractiele en relaxerende activiteiten³. Disfunctie van pericyten, evenals veranderingen in hun dekking of dichtheid, kan leiden tot vasculaire disregulatie en neurologische tekorten, wat uiteindelijk leidt tot pathologische veranderingen die geassocieerd worden met diverse neurologische aandoeningen⁴. De inherente heterogeniteit van pericyten vormt echter aanzienlijke uitdagingen voor verdere mechanistische studies.

Met de vooruitgang van single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) technologie hebben steeds meer studies scRNA-seq gebruikt om cellulaire heterogeniteit te onderzoeken en belangrijke doelwitten te identificeren in de pathogenese en progressie van ziekten. Veelgebruikte pericytenmarkers zijn onder andere bloedplaatje-afgeleide groeifactorreceptor-beta (PDGFR-β)⁵, neuron-gliaal antigeen 2 (NG2) en alfa-gladde spieractine (α-SMA). Deze markers hebben echter relatief lage specificiteit⁶, omdat ze tegelijkertijd andere vaatcellen, zoals gladde spiercellen, en neurale voorlopercellen zoals oligodendrocyten-voorlopercellen kunnen labelen, waardoor het moeilijk is om pericyten van andere hersencellen te onderscheiden. Op zoek naar een robuuster alternatief wendden we ons tot CD13 (Aminopeptidase N, APN), een marker die in eerdere studies algemeen erkend wordt om zijn sterke en consistente expressie in cerebrovasculaire pericyten 7,8,9,10. In onze studie voerden we immunofluorescentiekleuring uit op hersenweefselsecties, en de resultaten bevestigden CD13-expressie in pericyten, wat de effectiviteit ervan toonde bij het onderscheiden van pericyten van endotheelcellen, aangezien het CD13-signaal uitsluitend geassocieerd was met perivasculaire cellen en afwezig was in CD31⁺-endotheelcellen. (Figuur 1A). Het is echter belangrijk op te merken dat CD13-expressie niet volledig exclusief is voor pericyten; Detecteerbare niveaus worden ook waargenomen in gladde spiercellen van arteriolen en venulen (Figuur 1B,C).

Figuur 1: Immunofluorescentiekleuring toont CD13-expressie in hersenvaatpericyten en gladde spiercellen, zonder detecteerbaar signaal in endotheelcellen. (A) Representatieve immunofluorescentiebeeldvorming van de arteriol-capillaire overgangszone in de hersenmicrovasculatuur. De samengevoegde afbeelding toont CD13⁺ pericyet (groen) die CD31⁺ endotheelcellen (rood) omhult. α-SMA⁺ gladde spiercellen (cyaan) zijn gelokaliseerd in het arterioliaire gebied en ontbreken in de haarvaten. (B) Dwarsdoorsnede van een arteriol. De beelden tonen duidelijke co-lokalisatie van CD13⁺ pericyet (groen) en α-SMA⁺ gladde spiercellen (cyaan) in de omliggende gladde spierlaag, waarmee CD13-expressie in arteriolar gladde spiercellen wordt bevestigd. (C) Dwarsdoorsnede van een venule. Evenzo is CD13 (groen) detecteerbaar in de gladde spiercellen (pijlpunten) van de venulaire wand van de α-SMA. Schaalbalk: 20 μm (A-C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om muiscorticale vasculaire pericyten te verkrijgen die voldoen aan de eisen voor scRNA-seq, voerden we fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) uit met behulp van CD13⁺/CD31⁻ antilichaamlabeling voor pericytenisolatie¹¹. Aanvankelijk werden CD45- en CD41-markers gebruikt om hematopoëtische cellen uit hersenweefselsuspensies¹² uit te sluiten. Vervolgens werden pericyten verrijkt door te selecteren voor CD13^+-cellen, en werden endotheelcellen verder uitgesloten door te gaten voor CD31-populaties, waardoor de doelpopulatie van pericyten¹³ werd geïsoleerd.

We erkennen dat de CD13-positieve selectiestap gelijktijdig CD13-expressieve gladde spiercellen van zowel arteriolen als venulen opvangt. Om te voldoen aan de kritieke vereisten voor scRNA-seq en het maximaliseren van pericytenretentie, hebben we deze markercombinatie strategisch gekozen om pericytenopbrengst in de sorteerfase te prioriteren. Hoewel deze aanpak leidt tot co-isolatie van een kleine populatie gladde spiercellen, maximaliseert het effectief het herstel van alle potentiële pericyten tijdens de voorlopige verrijkingsfase. Deze stapsgewijze gatingstrategie minimaliseert het initiële celverlies aanzienlijk. Daarnaast gebruikten we, om de levensvatbaarheid en opbrengst van pericyten te maximaliseren, ook een 20% BSA-oplossing voor post-dissociatiecelresuspensie en filtratie, waardoor afval effectief werd verwijderd terwijl de levensvatbaarheid en zuiverheid^{van gesorteerde cellen behouden bleven}.

Met deze methode hebben we met succes de pericyten van de hersenvaaten onderscheiden van andere celtypen, waardoor we preparaten van hoge zuiverheid en levensvatbaarheid bereikten die voldoen aan de strenge eisen van scRNA-seq. Deze techniek biedt een solide basis voor latere diepgaande onderzoeken naar de rol van pericyten in verschillende ziektecontexten.

Protocol

In deze studie gebruikten we drie volwassen C57BL/6J muizen (3 maanden oud, 20-25 g). Alle muizen werden ondergebracht in een licht/donker-cyclus van 12 uur met strikt gecontroleerde temperatuur en vochtigheid, met vrije toegang tot voedsel en water voorafgaand aan de experimenten. Alle experimentele procedures met proefdieren werden goedgekeurd door de Commissie voor Laboratoriumdierverzorging en Ethiek van het Instituut voor Microcirculatie, de Chinese Academie van Medische Wetenschappen en het Peking Union Medical College, en werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de relevante richtlijnen voor dierenwelzijn.

1. Voorbereiding van reagens

1. 30% (wt/vol) glucoseoplossing: Los 15 g glucose op in 50 mL UltraPure DNase/RNase-vrije dH₂O. Om volledige oplossing te garanderen, voeg je eerst glucose toe aan 20 mL UltraPure DNase/RNase-vrije dH₂O en meng je grondig. Voeg vervolgens UltraPure DNase/RNase-vrije dH₂O toe aan een eindvolume van 50 mL. Filter de oplossing en bewaar tot 6 maanden op 4 °C.
2. DNase I (10 mg/mL): Los 50 mg DNase I op in 5 mL steriel ddH₂O. De voorraadoplossing kan tot 2 maanden worden bewaard bij -20 °C.
   OPMERKING: Herhaalde vries-dooicycli moeten strikt worden vermeden om verlies van enzymatische activiteit te voorkomen. Om vries-ontdooi-effecten te minimaliseren, aliquot 150 μL van de oplossing in steriele microcentrifugebuizen vóór het initiële bevriezing, en ontdooi individuele aliquots indien nodig voor experimenten.
3. 2% (vol/vol) Fetaal Bovin Serum (FBS) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): Bereid 1× PBS door 5 mL 10× PBS te mengen met 45 mL UltraPure DNase/RNase-vrije dH₂O. Voeg 1 mL FBS toe aan 49 mL 1× PBS en meng grondig.
   OPMERKING: Bereid deze oplossing vers voor tijdens Stap 2.1.2. Wees 15 mL toe per weefselmonster.
4. Collagenase en dispase (CD) enzymstockoplossing: Los 100 mg Dispase en 100 mg Collagenase afzonderlijk op in elk 1 mL UltraPure DNase/RNase-vrije dH₂O. Combineer oplossingen om een eindvolume van 2 mL te verkrijgen (100 mg/mL enzymconcentratie).
   OPMERKING: Aliquot 500 μL in steriele microcentrifugebuizen en opslag bij -20 °C. Vortex vóór gebruik om verlies van activiteit door vries-dooicycli te voorkomen. Het is belangrijk op te merken dat de poedervorm ernstige huid- en oogirritatie en ademhalingsproblemen kan veroorzaken. Hanteer het altijd met een chemische dampkap terwijl je nitril handschoenen en een N95-masker draagt. In geval van blootstelling spoel je het getroffen gebied onmiddellijk met voldoende water en zoek medische hulp.
5. CD-enzym werkoplossing: Meng 1,5 mL CD-enzymvoorraadoplossing met 43,5 mL 2% (vol/vol) FBS in PBS (vanaf stap 1.3) door een zachte inversie.
   OPMERKING: Bereid je direct voor voor weefseldissociatie voor (Stap 2.3.4). Dit volume is geoptimaliseerd voor drie muizen; pas het proportioneel aan indien nodig.
6. 22% (vol/vol) Percoll-oplossing: Combineer 11 mL Percoll, 5 mL 10× PBS en 34 mL UltraPure DNase/RNase-vrije dH₂O om een 50 mL oplossing te bereiden.
   OPMERKING: Filtersteriliseer via een 0,22 μm PES-membraan. Het kan een maand lang op 4 °C worden bewaard zonder significant verlies van stabiliteit.
7. Mechanische dissociatiebuffer: Voeg 1 mL DNase I (10 mg/mL) toe aan 10 mL 2% (vol/vol) FBS in PBS (vanaf stap 1.3). Meng door te pipetteren.
8. BSA-oplossingen: Bereid 1%, 20% en 35% (wt/vol) BSA-oplossingen apart voor als volgt:
   1. 1% (gewicht/vol) BSA: Los 0,15 g BSA op in 15 mL Dulbecco's fosfaatgebroerde zoutoplossing (DPBS).
   2. 20% (wt/vol) BSA: Los 3 g BSA op in 15 mL DPBS.
   3. 35% (wt/vol) BSA: Los 0,7 g BSA op in 2 mL DPBS.
      OPMERKING: Filter alle oplossingen door een 0,22 μm PES-membraan vóór gebruik.
9. Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)/BSA/Glucose Buffer: Voeg 167 μL 30% (wt/vol) glucose (vanaf stap 1.1) en 1,4 mL 35% (wt/vol) BSA (vanaf stap 1.8) toe aan 50 mL HBSS, en meng voorzichtig.
   OPMERKING: Bereid deze oplossing vers voor onder steriele omstandigheden tijdens Stap 2.1.2. Bewaar op 4 °C tot gebruik.
10. Weefselverzamelbuffer: Supplement 12 mL HBSS/BSA/Glucosebuffer (vanaf stap 1.9) met 800 μL DNase I (10 mg/mL). Gebruik voor tijdelijke weefselopslag en pipetspoeling.
    OPMERKING: Bereid deze oplossing vers voor onder steriele omstandigheden tijdens Stap 2.1.2.
11. 1,25% (w/v) Tribromoethanoloplossing: Los 1,25 g 2,2,2-Tribromoethanol op in 2,5 ml 2-Methyl-2-butanol en voeg dit mengsel toe aan 97,5 ml steriele ddH_2Oof fysiologische zoutoplossing om een heldere 1,25% tribromoethanoloplossing te verkrijgen.
    OPMERKING: Bereid de oplossing vers voor elk gebruik. Bewaar het beschermd tegen licht bij kamertemperatuur en gebruik het direct.

2. Experimentele procedure (met drie muizen als voorbeeld)

1. Voorbereiding voorafgaand aan het experiment (Timing: 30 min)
   1. Autoclaaf vereiste verbruiksartikelen en desinfecteerde chirurgische instrumenten met 75% (vol/vol) ethanol.
   2. Bereid werkende oplossingen voor: 1× PBS (vanaf stap 1.3), 2% (vol/vol) FBS in PBS (vanaf stap 1.3), HBSS/BSA/glucoseoplossing (vanaf stap 1.9) en weefselverzamelbuffer (vanaf stap 1.10).
   3. Giet 10 mL van 1× PBS in een celcluture-schotel van 10 cm en laat het op ijs staan.
   4. Maak drie ampullen klaar, voeg 3 ml weefselverzamelingsbuffer toe aan elke en laat ze op ijs.
   5. Maak drie centrifugebuizen van 15 mL klaar, voeg 10 mL 2% (vol/vol) FBS in PBS toe aan elk, en laat ze op ijs staan.
2. Muizenhersenoogst (Timing: 30 min)
   1. Muizen werden diep verdoofd door intraperitoneale injectie van tribromoethanol (uit stap 1.11) in een dosis van 0,2 mL per 10 g lichaamsgewicht. Na het verlies van pedaalreflexen werd euthanasie uitgevoerd door cervicale ontwrichting.
      OPMERKING: Als de muis niet binnen 5-10 minuten na injectie een chirurgisch vlak van anesthesie bereikte (beoordeeld door het ontbreken van een pedaalterugtrekkingsreflex), werd een aanvullende intraperitoneale dosis tribromoethanol toegediend, gelijk aan een derde van de initiële dosis.
   2. Spray het hoofd/nekgebied in met 75% ethanol. Maak een middenlijnincisie op de hoofdhuid van occipitale tot frontale gebieden om de schedel bloot te leggen. Voer een transversale incisie uit vóór de bilaterale oogcellen, gevolgd door laterale incisies langs de onderste randen van het cerebellum om de schedelbasis los te maken. Tot slot inceer je het calvarium longitudinaal langs de sagittale naad van achterste naar voorzijde. Til het hoofdflapje op om de door dura omsloten hersenen bloot te leggen. Leg voorzichtig de hersenen op terwijl je de oogzenuwen en de verbinding tussen de medulla oblongata en het ruggenmerg doorsnijdt met een chirurgische schaar¹⁵. Plaats de intacte hersenen in een schaal van 10 cm met 10 ml ijskoude 1× PBS.
      OPMERKING: Behandel het weefsel voorzichtig om schade te voorkomen.
   3. Zet de hersenen over op aluminiumfolie. Gebruik een tang om de dura mater van de randen te tillen en deze langs de middenlijn sulci te verwijderen. Na volledige verwijdering van de dura kun je de subarachnoïdale ruimte blootleggen. Spoel de subarachnoïdale ruimte af met een HBSS-oplossing, dissectieer vervolgens vaten met een stompe naald en verwijder voorzichtig de pia mater¹⁶. Snijd de hersenen coronataal in plakjes van 2-3 mm dikke delen met een scheermesje. Verwijder de reukbol en de meest caudale secties. Isoleer de hersenschors langs het corpus callosum en breng corticaal weefsel over op ampullen met 3 ml ijskoude weefselverzamelbuffer¹¹.
   4. Pericytenisolatie in dit protocol richt zich specifiek op de hersenschors. Voor andere interessegebieden: Plaats coronale secties in een twee-put slide met één daling van 2% (vol/vol) FBS in PBS. Identificeer doelgebieden onder dissectiemicroscopie, isoleer handmatig en ga verder met identieke vervolgprocessen.
3. Weefseldissociatie (Timing: 3-3,5 uur)
   1. Fijn het weefsel in ampullen met chirurgische scalpels in fragmenten van ongeveer 1 mm × 1 mm.
      OPMERKING: Volledig hakken binnen 5 minuten om de versheid van het weefsel te behouden.
   2. Spoel pipettips vooraf met een tissue collection buffer. Aspirateer langzaam gehakte fragmenten naar de top van de punt terwijl je verticale oriëntatie behoudt (punt naar beneden). Pers fragmenten voorzichtig uit in voorgekoelde 15 mL centrifugebuizen (bereid in stap 2.1.5).
      OPMERKING: Vermijd het aspireren van fragmenten in de bovenste loop om te voorkomen dat ze aan de pipetwand hechten.
   3. Was fragmenthoudende ampullen (uit stap 2.3.1) met 2% (vol/vol) FBS in PBS en breng de wash over naar centrifugebuizen. Centrifugeer op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
   4. Gooi supernatanten weg na centrifugatie. Suspensieer pellets opnieuw in 3 mL CD-enzym werkoplossing (vanaf stap 1.5) per buis. Aliquot elke suspensie gelijkmatig verdeel in drie buizen (totaal 9 buizen, 1 mL/buis), en vul vervolgens aan met 4 mL CD-enzym werkoplossing (eindvolume: 5 mL/buis).
   5. Incubeer buizen in een 37 °C hybridisatieoven gedurende 100 minuten met orbitale schudden van 100 x g¹⁴.
   6. Bereid weefseldissociatieoplossing voor tijdens de incubatie door 1 mL DNase I-oplossing toe te voegen aan 10 mL 2% (vol/vol) FBS in PBS (vanaf stap 1.10).
   7. Beëindig de vertering door centrifugatie bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
      OPMERKING: Beoordeel de verteringsefficiëntie microscopisch met een aliquot van 10-20 μL. Het ideale eindpunt manifesteert zich als kraalachtige vaatfragmenten; Verlengde vasculaire segmenten duiden op ondervertering, terwijl de overheersende enkele cellen oververtering aanduiden.
   8. Sussieve pellets in 1 ml weefseldissociatieoplossing per buis. Dissocieer mechanisch door 100 keer¹¹ te pipetten.
      OPMERKING: Vermijd volledige pipetvolumeaspiratie om de vorming van bellen te minimaliseren en de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
   9. Verzamel alle suspenties (van in totaal 9 digestiebuizen die het hersenweefsel van 3 muizen vertegenwoordigen) in een 50 mL centrifugebuis. Spoel elke spijsverteringsbuis met 2 mL 2% (vol/vol) FBS in PBS en combineer de wasbeurten. Centrifugeer op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
   10. Na centrifugatie zijn er duidelijke lagen zichtbaar. Verwijder zorgvuldig de bovenste laag (met onzuiverheden en kleine cellulaire resten), terwijl de tussenlaag (bestaande uit cellen of celclusters met lagere dichtheid) en de onderste laag (intacte cellen en gedeeltelijk onverteerde weefselfragmenten) behouden blijft. Voeg 12,5 mL 20% BSA-oplossing toe en draai de buis voorzichtig om de pellets opnieuw te suspenderen. Centrifugeer opnieuw op 1000 × g bij 4 °C gedurende 20 minuten.
   11. Verzamel de onderste pellet (verrijkt met intacte cellen met een hogere zuiverheid) en breng het supernatant (voornamelijk met myelineresten, lipiden en een klein aantal cellen) over in een nieuwe 50 mL centrifugebuis. Herstel opnieuw door zachte inversie en herhaal centrifuge op 1.000 x g bij 4 °C gedurende 20 minuten.
   12. Suss elke pellet die is verkregen uit de twee centrifugatiestappen (stap 2.3.10 en stap 2.3.11) in 2 mL van 2% (vol/vol) FBS elk in PBS (eindgecombineerd volume: 4 mL).
       OPMERKING: Vermijd het aanraken van de buiswanden tijdens de resuspension om besmetting door vuil te minimaliseren.
   13. Combineer de twee opnieuw opgehangen suspensies van de vorige stap tot een 15 mL centrifugebuis. Centrifugeer op 300 × g, 4 °C gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant (afvalbuffer met BSA, celresten en mogelijk sporen van resterende myelinelipiden). Sussief de pellet (de uiteindelijke gezuiverde en gewassen, hoogzuivere intacte doelcellen) opnieuw in 2 mL PBS-oplossing met 2% FBS.
       OPMERKING: Deze stap is om de cellen over te brengen in een schone, geschikte ophangingsbuffer voor downstream toepassingen.
   14. Bereid vier centrifugebuizen van 15 mL voor, elk met 4 mL 22% Percoll-oplossing. Laag voorzichtig 0,5 mL aliquots van de resuspension op de Percoll-gradiënt (in totaal vier aliquots) om de celopbrengst te maximaliseren. Centrifugeer op 560 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
       OPMERKING: Stel de centrifuge in op "geen rem" om verstoring van de dichtheidsgradiënt door vortex te voorkomen, zodat myelineresten gestabiliseerd blijven in het supernatant.
   15. Aspireer voorzichtig supernatanten. Suss pellets opnieuw in 1 mL HBSS/BSA/glucosebuffer per buis. Zwembadophangingen in een nieuwe 15 mL buis. Spoel Percoll-tubes af met 2 ml HBSS/BSA/glucosebuffer en combineer washes. Centrifugeer op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten).
4. Flowcytometrie, sortering, voorbereiding en verwerving (Timing: 50 min)
   1. Aspireer voorzichtig het supernatant. Suspendeer de celpellet opnieuw in 1 ml HBSS/BSA/glucosebuffer.
   2. Voeg 5 μL Fc-receptor (FcR) blokkerend reagens toe aan de celsuspensie en incubeer bij 4 °C gedurende 5 minuten.
   3. Voeg de volgende fluorescerend geconjugeerde antilichamen toe aan de celsuspensie op de aangegeven volumes (voldoende voor weefsel afkomstig van 3 muizen): 5 μL CD45-PE; 5 μL CD41-PE; 20 μL CD31-APC; 15 μL CD13-FITC.
   4. Incubeer de cellen 20 minuten in het donker op ijs.
      OPMERKING: Bescherm tegen licht. Vermijd roeren.
   5. Voeg 6 ml HBSS/BSA/glucosebuffer toe om de cellen te wassen. Centrifugeer op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
   6. Aspireer het supernatant. Suspendeer de celpellet opnieuw in 1 ml HBSS/BSA/glucosebuffer. Voeg 200 μL 7-aminoactinomycine D (7-AAD) oplossing toe (om dode cellen uit te sluiten) en incubeer 10 minuten op ijs. Stel vervolgens het volume aan naar 2 mL met HBSS/BSA/glucosebuffer.
      OPMERKING: Bescherm tegen licht.
   7. Voeg 1% BSA-oplossing toe aan de sorteerbuizen (15 mL conische buizen), draai voorzichtig om de binnenkant af te spoelen. Aspireer overtollige oplossing, waarbij je precies 1 mL 1% BSA-oplossing in elke buis laat om gesorteerde cellen te ontvangen. Bewaar tijdelijk op ijs.
   8. Filter gekleurde celsuspensie direct voor sortering door een 40 μm zeef.
   9. Stel een initiële poort op gebaseerd op voorwaartse verstrooiing (FSC-A) en zijverstrooiing (SSC-A) parameters om cellulair puin met lage FSC-A/SSC-A signalen uit te sluiten.
   10. Uitputting van hematopoëtische lijncellen werd bereikt door dual-negatieve gating voor CD45 en CD41, waardoor besmetting door leukocyten, immuuncellen en bloedplaatjes effectief werd geëlimineerd.
   11. Vang vermeende pericyten door CD13-positieve selectie uit vaatwandcellen.
   12. Evalueer de membraanintegriteit via 7-AAD fluorescentieprobing; sluit apoptotische cellen uit via 7-AAD⁻ gating.
       OPMERKING: Verzamel hoogzuivere CD31⁻/CD13⁺ pericyten via CD31-negatieve selectie. Verzamel de gesorteerde pericyten direct in buisjes met 1% BSA (uit stap 2.4.7) en leg ze op ijs. Bereid onmiddellijk single-cell suspenties voor om te tellen. Laad vervolgens de monsters direct voor sequencing zonder tussenliggende kweekstappen.
5. scRNA seq en analyse (Tming: 3-4 dagen)
   1. Single-cel suspenties van gesorteerde pericyten werden bereid volgens het protocol uit de 10x Genomics "GEM-X Universal 3' Gene Expression v4 4-plex Reagent Kits User Guide" (CG000731)^17,18. De celsuspensie die voor lading werd voorbereid, had een levensvatbaarheid van > 90% en werd verdund tot een concentratie binnen het aanbevolen bereik van 300-2000 cellen/μL.
   2. Combineer single-cell suspension met gebarcodede gelkralen en enzymen, en partitioneer vervolgens in Gel Beads-in-Emulsion (GEMs) via microfluidische druppelencapsulatie¹⁹. Voer in situ cellyse uit, reverse transcriptie en barcode-cDNA-koppeling.
   3. Breek GEMs om producten terug te halen. Amplificeer cDNA door PCR met het volgende protocol: initiële denaturatie bij 9 °C gedurende 4 seconden; gevolgd door cycli (13 cycli voor <500 doelcellen, 12 cycli voor 501-6000 doelcellen) bestaande uit denaturatie bij 9 °C gedurende 2 seconden, annealing bij 9 °C voor 3 seconden, en extensie bij 7 °C voor 6 seconden per cyclus; en een laatste verlenging bij 72 °C voor 1 minuut, gevolgd door een houdpauze bij 4 °C. Valideer de versterkte producten op fragmentgrootte (200-300 bp) en opbrengst.
      OPMERKING: De versterkingsproducten kunnen tot 72 uur bij 4 °C worden opgeslagen of één week bij -2 °C, of ze kunnen direct in de volgende stap worden verwerkt.
   4. Voor gekwalificeerde cDNA: fragmenteren, uiteindreparatie uitvoeren, de P7-adapter ligateren en amplificeren met indexprimers. Selecteer fragmenten met grootte-selectie om sequencing-bibliotheken te construeren.
   5. Sequentiebibliotheken op het Illumina NovaSeq-platform na QC-validatie.
   6. Demultiplex-sequencinggegevens om celbarcodes, unieke moleculaire identificatie (UMI's) en RNA-sequenties te extraheren. Align leest naar het referentiegenoom.
   7. Kwantificeer UMI-tellingen, schat geldige celnummers en genereer een gen-barcode expressiematrix²⁰.
   8. Verwijder doublets met het DoubletFinder-pakket (v2.0.6) in R. Voorspel op basis van kunstmatige nabijste-buuridentificatie om datakwaliteit te waarborgen.
   9. Voer hoofdcomponentanalyse (PCA) en Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) dimensionaliteitsreductie uit met behulp van Seurat (v5.0). Identificeer celclusters en visualiseer pericyt-specifieke markergenen om de cellulaire identiteit te valideren.

Resultaten

Om een precieze isolatie van hersenpericyten te bereiken, werden cellen die van hersenweefsel waren gedissocieerd gekleurd met PE Texas Red-conjugated anti-mouse CD41/CD45, FITC-geconjugeerde anti-muis CD13 en APC-conjugated anti-muis CD31, waarmee een meerstaps sorteerstrategie werd vastgesteld die oppervlaktemarkers en levensvatbaarheidsdetectie integreert (Figuur 2). Initiële gating gebaseerd op voorwaartse verstrooiing (FSC-A) en zijverstrooiing (SSC-A) ...

Discussie

Deze studie beschrijft een systematisch geoptimaliseerde en gevalideerde FACS-strategie gebaseerd op CD13⁺/CD31⁻ meerkleurige labeling voor de zeer efficiënte isolatie van muis hersenvaatpericyten²⁴. Flowcytometrische en daaropvolgende scRNA-seq-analyses bevestigden dat de methode pericyten nauwkeurig onderscheidt van endotheelcellen en cellen oplevert die consequent voldoen aan alle kritieke kwaliteitscontrolecriteria voor scRNA-seq, waaronder levensvatbaarheid, ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibicol	A5669701	Alikwoteer en bewaar bij -20°C; kan tot 1 week bij 4°C worden bewaard na het ontdooien
Phosphate Buffered Saline(10×PBS, pH 7.4)	Life Technologies	70011-044	Verdun voor gebruik voor celwassing
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG	Voor het bereiden van cel-energiebuffer
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A1933-25g	Beschermt cellen en voorkomt hechting
Dulbecco's  Phosphate Buffered Saline (DPBS,1×)	Gibco	14190-144
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS,1×)	Life Technologies	14175-095	Voor celwassing en resuspendering
UltraPure DNase/RNase-Free Gedistilleerd Water	Life Technologies	10977-015	Voor het bereiden van nuclease-vrije reactiesystemen
Collagenase/Dispase	Sigma-Aldrich	11097113001-100mg	Voor weefseldigering en celdissociatie; alikwoteer en bewaar bij -20°C
DNaseI(RNase-Free)	TIANGEN	RT411-1500U	Voorkomt DNA-aggregatie; alikwoteer en bewaar bij -20°C
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-100ML	Voor celscheiding; bewaar bij 4°C
FITC Rat Anti-Mouse CD13	BD Biosciences	558744	Fluorescente conjugate; bewaar beschermd tegen licht bij 4°C gedurende maximaal 1 maand
APC Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	551262	Bewaar beschermd tegen licht bij 4°C gedurende meerdere maanden
PE Rat Anti-Mouse CD41	BD Biosciences	558040	Bewaar beschermd tegen licht bij 4°C gedurende meerdere maanden
PE Rat Anti-Mouse CD45	BD Biosciences	553081	Bewaar beschermd tegen licht bij 4°C gedurende meerdere maanden
FITC Rat IgG1, κ Isotype Control	BD Biosciences	552916	Fluorescentiecontrole; bewaar beschermd tegen licht bij 4°C
APC Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Biosciences	553932	Bewaar beschermd tegen licht bij 4°C gedurende meerdere maanden
PE Rat IgG2b, κ Isotype Control	BD Biosciences	553989	Bewaar beschermd tegen licht bij 4°C gedurende meerdere maanden
RNase AWAY Decontaminatie Reagens	Ambion	10328011	Voor het elimineren van RNase-besmetting
Gezuiverd Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Voorkomt niet-specifieke antilichaambinding
7-Aminoactinomycin D (7-AAD)	BD Pharmingen	559925	Voor uitsluiting van dode cellen.
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma-Aldrich	T48402-25g	Voor de bereiding van 1,25% (w/v) Tribromoethanoloplossing
2-Methyl-2-butanol	Psaitong	M20008-500mL	Voor de bereiding van 1,25% (w/v) Tribromoethanoloplossing
C57BL/6 muis	Jiangsu Huachuang Xinnuo Pharmaceutical Technology Co., Ltd.	SYXK (Su) 2020-0041
50 mL centrifugeerbuis	Corning	430291
15 mL centrifugeerbuis	Corning	430791
cell cluture dish 100mm×20mm	Corning	430167
Cell Ranger		3.1.0/4.0.0	Software voor gegevensanalyse van Single-Cell Sequencing
Loupe Cell Browser		4.1	Cell Browser
STAR		2.5.1b	RNA Uitlijning
irlbpy		-	Principal Component Analysis
tsne		0.15	Barnes-Hut t-SNE (t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding) Analyse
k-means		0.17	K-Means Clustering
graph-based clustering		0.17	Graph-Based Clustering
FastQC		v0.11.2	Data Quality Control (QC)