Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Dit protocol integreert klinische monsters, gekweekte macrofagen en een cecale ligatie en punctie (CLP) muismodel om te onderzoeken hoe de NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-as macrofagenpolarisatie en ontsteking bij sepsis reguleert, en biedt stapsgewijze richtlijnen die kunnen worden aangepast aan andere door lncRNA gemedieerde immuunroutes.
Sepsis wordt gekenmerkt door een ontregelde immuunrespons van de gastheer en blijft wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak. Lang niet-coderend RNA NEAT1 is in verband gebracht met ontstekingsziekten, maar de specifieke rol ervan in macrofagenpolarisatie tijdens sepsis is nog niet volledig gedefinieerd. Hier onderzoeken we systematisch de NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-as in klinische monsters, gekweekte macrofagen en een CLP-muismodel. Kwantitatieve PCR-, western blotting-, dual-luciferase reporter-assays en RNA pull-down experimenten worden gebruikt om de concurrerende endogene RNA (ceRNA) interactie tussen NEAT1, miR-181a-5p en HMGB1 te bevestigen. Functionele assays, waaronder immunofluorescentie, transwellmigratie en terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) kleuring, worden toegepast om macrofagenpolarisatie, migratie en apoptose te beoordelen. In vivo valideert het CLP-model in combinatie met ELISA en histopathologie de impact van NEAT1 knockdown op cytokineprofielen en orgaanbeschadiging. NEAT1 en HMGB1 zijn opgereguleerd, terwijl miR-181a-5p is gedownreguleerd, bij patiënten met sepsis en bij lipopolysaccharide-gestimuleerde macrofagen. Het stilleggen van NEAT1 bevordert de polarisatie van M2-macrofagen, vermindert pro-inflammatoire cytokines, belemmert de migratie van macrofagen en vermindert weefselschade bij septische muizen via de miR-181a-5p/HMGB1-as. Voor zover wij weten is dit het eerste geïntegreerde protocol dat het lncRNA-microRNA-HMGB1 regulatiecircuit bij sepsis karakteriseert met geharmoniseerde klinische, in vitro en in vivo benaderingen. Het biedt een methodologisch kader om NEAT1-gerelateerde ceRNA-netwerken als potentiële therapeutische strategieën te targeten.
Sepsis wordt gedefinieerd als levensbedreigende orgaandisfunctie veroorzaakt door een ontstoorde gastheerreactie op infectie1. Ondanks vooruitgang in klinisch beheer blijft de sterfte hoog en zijn de moleculaire mechanismen achter immuunonbalans niet volledig begrepen 2,3. Onder immuunregulatoren zijn lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) naar voren gekomen als belangrijke modulatoren van inflammatoire signalering en macrofagenfunctie 4,5. NEAT1, een nucleair verrijkt overvloedig transcript, is ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle procedures waarbij menselijke deelnemers betrokken zijn, zijn goedgekeurd door de Ethics Review Board van het Affiliated Hospital van de Universiteit van Hebei (Goedkeuringsnr. HDFY-LL-2021-232). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers of, indien van toepassing, van hun wettelijke vertegenwoordigers. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen en nationale regelgeving, en werden goedgekeurd door dezelfde ethische commissie. Het goedgekeurde protocol specificeerde details van de cecale ligatie en punctie (CLP)-procedure, adenovirale toediening, anesthesieregime en humane....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Detectie van NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-expressie en interacties bij sepsis
In serum van patiënten met sepsis waren de NEAT1- en HMGB1-niveaus significant hoger dan bij gezonde controles, terwijl miR-181a-5p duidelijk was verlaagd. Vergelijkbare expressiepatronen werden waargenomen in PBMC's en in RAW264.7-macrofagen die gestimuleerd werden met lipopolysakkaride, wat aangeeft dat deze as consequent veranderd is bij sepsis- en sepsisachtige ontstekingsaandoeningen (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Sepsis wordt gekenmerkt door diepgaande en vaak langdurige immuunontwrichting, waarbij fasen van hyperontsteking en immunosuppressie naast elkaar bestaan en samen bijdragen aan orgaanfalen en slechte uitkomsten21,22. Steeds meer bewijs wijst erop dat lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) aan deze processen deelnemen door inflammatoire signalering en macrofagenpolarisatie te moduleren23,24
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven geen concurrerende financiële belangen aan.
De auteurs bedanken het klinisch en laboratoriumpersoneel van het Affiliated Hospital van de Universiteit van Hebei voor hun hulp bij het werven van patiënten, het verwerken van monsters en de zorg voor dieren. Dit werk werd ondersteund door de Gezondheidscommissie van de provincie Hebei (Subsidie nr. 20220640).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adenoviral Vector (shNEAT1) | 10692-V5 | Vigene Biosciences | Adenovirus gebruikt voor het verlagen van NEAT1 expressie in vivo en in vitro. |
| BCA Protein Assay Kit | 23227 | Thermo Fisher | Kit gebruikt om de eiwitconcentratie in cel lysaten te kwantificeren. |
| Dual-Luciferase Reporter Assay Kit | E1910 | Promega | Kit gebruikt voor dual-luciferase reporter assays om miR-181a-5p interactie te meten. |
| ELISA Kits (Cytokines) | N/A | R&D Systems | Kits gebruikt voor het meten van cytokine niveaus in serum en weefselmonsters. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 16000-044 | Gibco | Supplement gebruikt in kweekmedia voor celgroei. |
| GAPDH Antibody | 2118S | Cell Signaling Technology | Primaire antilichaam tegen GAPDH gebruikt als ladingscontrole in western blot. |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | N/A | Thermo Fisher | Kit gebruikt voor histologische kleuring van weefselsecties voor pathologische analyse. |
| Immunofluorescence Antibodies (CD206) | 14693-1-AP | Proteintech | Antilichaam gebruikt voor het detecteren van M2 macrofaag marker CD206 in weefselsecties. |
| Lipopolysaccharide (LPS) | L2630 | Sigma-Aldrich | LPS gebruikt om inflammatoire macrofaag polarisatie in RAW264.7 cellen te induceren. |
| miR-181a-5p Mimic | N/A | N/A | Synthetisch miR-181a-5p mimic gebruikt om miR-181a-5p niveaus te moduleren. |
| NEAT1 Expression Plasmid | N/A | N/A | Plasmid gebruikt voor overexpressie van NEAT1 in RAW264.7 macrofagen. |
| RAW264.7 Macrophage Cells | TIB-71 | ATCC | Murine macrofaag cel lijn gebruikt voor in vitro experimenten. |
| RIPA Lysis Buffer | 89901 | Thermo Fisher | Buffer gebruikt voor het lyseren van cellen om totaal eiwit te extraheren. |
| RPMI-1640 Medium | 11875-093 | Gibco | Kweekmedium voor RAW264.7 macrofagen. |
| SYBR Green Master Mix | 4385612 | Thermo Fisher | Reagens gebruikt voor kwantitatieve real-time PCR analyse. |
| Transwell Migration Assay Chambers | 3422 | Corning | Chambers gebruikt voor transwell migratie assays om macrofaag migratie te beoordelen. |
| TUNEL Apoptosis Assay Kit | ab66110 | Abcam | Kit gebruikt voor het detecteren van apoptose in RAW264.7 cellen door TUNEL kleuring. |
| Western Blotting Antibodies (HMGB1) | ab18256 | Abcam | Primair antilichaam tegen HMGB1 gebruikt in western blotting. |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.