Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Dit protocol integreert klinische monsters, gekweekte macrofagen en een cecale ligatie en punctie (CLP) muismodel om te onderzoeken hoe de NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-as macrofagenpolarisatie en ontsteking bij sepsis reguleert, en biedt stapsgewijze richtlijnen die kunnen worden aangepast aan andere door lncRNA gemedieerde immuunroutes.
Sepsis wordt gekenmerkt door een ontregelde immuunrespons van de gastheer en blijft wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak. Lang niet-coderend RNA NEAT1 is in verband gebracht met ontstekingsziekten, maar de specifieke rol ervan in macrofagenpolarisatie tijdens sepsis is nog niet volledig gedefinieerd. Hier onderzoeken we systematisch de NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-as in klinische monsters, gekweekte macrofagen en een CLP-muismodel. Kwantitatieve PCR-, western blotting-, dual-luciferase reporter-assays en RNA pull-down experimenten worden gebruikt om de concurrerende endogene RNA (ceRNA) interactie tussen NEAT1, miR-181a-5p en HMGB1 te bevestigen. Functionele assays, waaronder immunofluorescentie, transwellmigratie en terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) kleuring, worden toegepast om macrofagenpolarisatie, migratie en apoptose te beoordelen. In vivo valideert het CLP-model in combinatie met ELISA en histopathologie de impact van NEAT1 knockdown op cytokineprofielen en orgaanbeschadiging. NEAT1 en HMGB1 zijn opgereguleerd, terwijl miR-181a-5p is gedownreguleerd, bij patiënten met sepsis en bij lipopolysaccharide-gestimuleerde macrofagen. Het stilleggen van NEAT1 bevordert de polarisatie van M2-macrofagen, vermindert pro-inflammatoire cytokines, belemmert de migratie van macrofagen en vermindert weefselschade bij septische muizen via de miR-181a-5p/HMGB1-as. Voor zover wij weten is dit het eerste geïntegreerde protocol dat het lncRNA-microRNA-HMGB1 regulatiecircuit bij sepsis karakteriseert met geharmoniseerde klinische, in vitro en in vivo benaderingen. Het biedt een methodologisch kader om NEAT1-gerelateerde ceRNA-netwerken als potentiële therapeutische strategieën te targeten.
Sepsis wordt gedefinieerd als levensbedreigende orgaandisfunctie veroorzaakt door een ontstoorde gastheerreactie op infectie1. Ondanks vooruitgang in klinisch beheer blijft de sterfte hoog en zijn de moleculaire mechanismen achter immuunonbalans niet volledig begrepen 2,3. Onder immuunregulatoren zijn lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) naar voren gekomen als belangrijke modulatoren van inflammatoire signalering en macrofagenfunctie 4,5. NEAT1, een nucleair verrijkt overvloedig transcript, is een structureel onderdeel van paraspeckles en is geassocieerd met immuun- en weefselbeschadigingsresponsen 6,7. Eerdere studies hebben NEAT1 in verband gebracht met darmontsteking, ischemie/reperfusieschade en acuut respiratoire distress syndroom 8,9,10.
In de context van sepsis wijst het opeenstapelende bewijs erop dat lncRNA's de polarisatie van macrofagen en inflammatoire signalering reguleren, waardoor ziekteprogressie en uitkomst11,12 worden beïnvloed. Zo is gerapporteerd dat lncRNA's KCNQ1OT1 en SNHG1 sepsis-geïnduceerd myocardletsel moduleren via microRNA-gemedieerde routes 13,14. Of NEAT1 de macrofagenpolarisatie reguleert via de miR-181a-5p/HMGB1-as bij sepsis is echter niet systematisch gedefinieerd. Om deze kloof te dichten, hebben we een protocol opgesteld dat bloedmonsters van patiënten, lipopolysaccharide-gestimuleerde RAW264.7-macrofagen en een cecale ligatie- en puncturmuismodel combineert om de NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-as15,16 te onderzoeken. Met behulp van kwantitatieve PCR, western blotting, dual-luciferase reporter assays, RNA pull-down en functionele metingen van macrofagen M1/M2 polarisatie, migratie en apoptose, biedt dit protocol een reproduceerbaar experimenteel kader om NEAT1 te definiëren als regulator van macrofagenfunctie bij sepsis en om de ontwikkeling van lncRNA-gerichte strategieënte ondersteunen 17,18.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle procedures waarbij menselijke deelnemers betrokken zijn, zijn goedgekeurd door de Ethics Review Board van het Affiliated Hospital van de Universiteit van Hebei (Goedkeuringsnr. HDFY-LL-2021-232). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers of, indien van toepassing, van hun wettelijke vertegenwoordigers. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen en nationale regelgeving, en werden goedgekeurd door dezelfde ethische commissie. Het goedgekeurde protocol specificeerde details van de cecale ligatie en punctie (CLP)-procedure, adenovirale toediening, anesthesieregime en humane eindpunten.
Monsterverzameling van patiënten
Patiënten met sepsis werden tussen februari 2022 en juli 2024 prospectief gerekruteerd in het Affiliated Hospital van de Universiteit van Hebei. In totaal voldeden 50 patiënten aan de inclusiecriteria, waaronder 26 mannen en 24 vrouwen in de leeftijd van 24-69 jaar (gemiddelde 52,4 ± 10,2 jaar). Sepsis werd vastgesteld volgens de Sepsis-3 criteria, waarbij vermoedelijke of bevestigde infectie vereist is plus een verhoging van de Sequential Organ Failure Assessment (SOFA) score met ≥ 2 punten. Voor elke patiënt werden de primaire infectiebron (zoals een longinfectie, intra-abdominale, urineweginfectie of bloedbaaninfectie) en de ernst van de ziekte (sepsis of septische shock) geregistreerd, en werd de verdeling van SOFA-scores samengevat om de ziektelast te karakteriseren. Als controlegroep werden 39 gezonde personen zonder klinisch bewijs van infectie of systemische ontstekingsziekte ingeschreven (20 mannen en 19 vrouwen, 26-70 jaar oud, gemiddelde 50,7 ± 11,0 jaar), en er waren geen significante verschillen in leeftijd of geslacht tussen groepen.
Perifere veneuze bloed werd verzameld bij patiënten met sepsis voordat de sepsisspecifieke behandeling werd gestart, waar mogelijk. Bloed (meestal 5-10 mL) werd afgezogen in met ethylenediamine gecoate buisjes (EDTA) en meerdere keren voorzichtig omgekeerd om het anticoagulant te mengen. De monsters werden binnen ongeveer 1 uur na de afname verwerkt. Plasma werd verkregen door centrifugatie bij 1.500 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gealiquoteerd in gelabelde microbuisjes en opgeslagen bij -80 °C voor latere cytokinemetingen. Voor RNA- en eiwitextractie werden perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) geïsoleerd uit een deel van dezelfde monsters met behulp van een dichtheidsgradiënt-scheidingsmedium volgens de instructies van de fabrikant. De cellen werden vervolgens twee keer gewassen in PBS, geteld en opgeslagen als celpellets bij -80 °C.
Celkweek en transfectie
RAW264.7 muismacrofagen werden onderhouden in RPMI-1640 medium, aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal rundvleesserum, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5%CO-2. Cellen werden met een celschraper doorgevoerd voordat ze overconfluence bereikten om een stabiel fenotype te behouden.
Voor transfectie werden RAW264,7-cellen gezaaid bij 5 × 10 à5 cellen per put in 6-wellplaten in 2 mL volledig medium, ongeveer 24 uur vóór blootstelling aan reagens. Wanneer de culturen 70-90% confluentie bereikten, werden nucleïnezuren (zoals NEAT1- of HMGB1-expressieplasmiden, korte haarspeldconstructies, miR-181a-5p-mimics of remmers, en hun bijbehorende controlegroepen) gecomplex met een op lipide gebaseerde transfectiereagens in serumvrij medium volgens de instructies van de fabrikant. Typisch werden 2-3 μg plasmide-DNA of 50-100 pmol klein RNA gemengd met het aanbevolen volume reagens, waarbij complexen bij kamertemperatuur 10-15 minuten konden vormen, en vervolgens druppelwijs aan cellen in een antibioticavrij medium werden toegevoegd. Na 4-6 uur werd het medium vervangen door een nieuw volledig medium, en werden cellen nog eens 24-48 uur geïncubeerd voordat ze stroomafwaarts werden geanalyseerd.
Inductie van macrofagenpolarisatie
Om inflammatoire macrofagenpolarisatie te induceren, mochten RAW264.7-cellen minstens 4 uur in volledig medium in 6-wellplaten hechten. Het medium werd vervolgens vervangen door DMEM met 100 ng/mL lipopolysaccharide (LPS), en cellen werden 6 uur geïncubeerd bij 37 °C met 5%CO2. Na stimulatie werden cellen onmiddellijk verwerkt voor RNA- en eiwitextractie, immunofluorescentiekleuring, migratietests of apoptose-analyse, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
Kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR)
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit gekweekte cellen, PBMC's of muizenweefsels met behulp van een fenol-guanidinium-gebaseerd monofasisch reagens volgens standaardprocedures. Kort gezegd werden monsters gelyseerd in 1 mL reagens per 10à 6 cellen of 50-100 mg weefsel, 5 minuten geïncubeerd bij kamertemperatuur, en vervolgens krachtig gemengd met chloroform (0,2 mL per 1 mL reagens). Na 2-3 minuten incuberen werden lysaten gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om de fasen te scheiden. De waterige fase werd overgebracht naar een nieuwe buis, en RNA werd neergeslagen met een gelijke hoeveelheid isopropanol. Het mengsel werd vervolgens ongeveer 10 minuten geïncubeerd en opnieuw gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. De resulterende pellet werd gewassen met 75% ethanol, gecentrifugeerd op 7.500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, kort aan de lucht gedroogd en opgelost in RNase-vrij water. RNA-concentratie en zuiverheid werden geëvalueerd met behulp van UV-spectrofotometrie, en monsters met een A260/A 280-verhouding van ongeveer 1,8-2,0 werden gebruikt voor downstream-analyses. Indien nodig werd de integriteit gecontroleerd door agarosegel-elektroforese.
Complementair DNA (cDNA) werd gesynthetiseerd uit totaal RNA met behulp van een commercieel verkrijgbare reverse transcriptiekit, volgens de instructies van de fabrikant. Voor miR-181a-5p werden genspecifieke of stam-lusprimers gebruikt zoals aanbevolen. Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met een real-time PCR-systeem en een geschikte mastermix (zoals SYBR Green- of probe-gebaseerde chemie) in een totaal reactievolume van 20 μL met cDNA-template en 0,2-0,4 μM van elke primer. Typische cyclische condities omvatten een initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten, gevolgd door 40 cycli van 95 °C gedurende 10 seconden en 60 °C gedurende 30 seconden, met smeltcurveanalyse indien nodig om de ampliconspecificiteit te bevestigen. De expressieniveaus van NEAT1 en HMGB1 werden genormaliseerd tot GAPDH, en de expressie van miR-181a-5p werd genormaliseerd tot U6 klein nucleair RNA. De relatieve expressie werd berekend met de 2-ΔΔCt-methode en uitgedrukt als vouwverandering vergeleken met controlegroepen. Primersequenties en amplicongroottes werden samengesteld in een apart spreadsheet voor indiening als aanvullende tabel 1.
Westelijke verplettering
Voor western blotting werden cellen twee keer gewassen met ijskoude PBS en gelyseerd in een geschikte radioimmunoprecipitatietest (RIPA) buffer, aangevuld met proteaseremmers. Lysaten werden 15-30 minuten op ijs geïncubeerd met af en toe zacht mengen en gecentrifugeerd op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om cellulair afval te verwijderen. De supernatanten werden verzameld en de eiwitconcentraties werden bepaald met behulp van een bicinchonininezuur (BCA) assay.
Gelijke hoeveelheden eiwit (typisch 40 μg per baan) werden gemengd met laadbuffer, gekookt op 95 °C gedurende 5-10 minuten om eiwitten te denatureren, en gescheiden op natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamide gels met de juiste acrylamideconcentratie (bijvoorbeeld 10-12% voor HMGB1). Eiwitten werden overgebracht op polyvinylidienfluoride (PVDF) membranen met behulp van een nat of halfdroog transfersysteem onder omstandigheden die werden aanbevolen voor het interessiële molecuulgewichtbereik. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk of runderserumalbumine (BSA) in Tris-gepufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antistoffen tegen HMGB1 (bijvoorbeeld 1:500 verdunning) en GAPDH (bijvoorbeeld 1:1.000 verdunning) verdund in blokkerende buffer. Na drie wasbeurten in TBST werden membranen geïncubeerd met geschikte mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na aanvullende washes werden eiwitbanden gevisualiseerd met een versterkt chemiluminescentiesubstraat en vastgelegd met een digitaal beeldvormingssysteem. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met behulp van beeldanalysesoftware, HMGB1-signalen werden genormaliseerd tot GAPDH, en relatieve expressie werd tussen groepen vergeleken.
Dual-Luciferase verslaggever-assay
Wildtype- en mutantfragmenten van NEAT1 en het HMGB1 3′-niet-vertaalde gebied (3′-UTR) met de voorspelde miR-181a-5p-bindingsplaatsen werden gekloond in een luciferase-reportervector19. Alle constructen werden geverifieerd door Sanger-sequencing om de insertie- en mutatieplaatsen20 te bevestigen. RAW264.7-cellen werden gezaaid in 24-wellplaten en mochten de hele nacht hechten. Cellen werden vervolgens co-transfecteerd met reporterplasmiden en ofwel miR-181a-5p-remmers, mimics of overeenkomstige negatieve controles met behulp van een lipide-gebaseerd transfectie-reagens, zoals beschreven voor de algemene transfectieprocedure.
Na ongeveer 24-48 uur incubatie werden cellen gewassen met PBS, gelyseerd in een geschikte passieve lysisbuffer (bijvoorbeeld 20 μL per put) en voorzichtig geroerd om volledige lysie te garanderen. De activiteit van luciferase werd gemeten met een dual-luciferase assaykit en een luminometer, volgens de instructies van de fabrikant. De luciferaseactiviteit van Firefly werd genormaliseerd tot Renilla-luciferaseactiviteit om transfectie-efficiëntie te controleren, en de relatieve luciferaseactiviteit van elke groep werd vergeleken met de overeenkomstige controle.
Transwell-migratie-assay
Macrofagenmigratie werd geëvalueerd met transwellkamers die vooraf waren bedekt met een extracellulaire matrixgel die geschikt is voor celinvasietests. De gel werd verdund 1:6 in serumvrij medium op ijs, en 50 μL van de verdunde oplossing werd aan het bovenoppervlak van elke insert toegevoegd. De plaat werd ongeveer 4 uur geïncubeerd bij 37 °C om de gel te laten stollen. Getransfecteerde of behandelde RAW264,7-cellen werden geoogst, opnieuw opgehangen in serumvrij medium bij 1 × 106 cellen/mL, en 100 μL van de celsuspensie (1 × 105 cellen) werd aan de bovenste kamer toegevoegd. De onderste kamer werd gevuld met 600 μL volledig medium dat 10% foetaal runderenserum bevatte als chemoattractie.
Cellen werden geïncubeerd bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 24 uur. Aan het einde van de incubatie werden niet-gemigrerende cellen die aan het bovenoppervlak van het membraan achterbleven voorzichtig verwijderd met een wattenstaafje. Gemigreerde cellen die aan het onderste membraanoppervlak vastzaten, werden ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur met 95% ethanol vastgezet en vervolgens 10-15 minuten gekleurd met 0,5% kristalviolette oplossing. Overtollige kleurstof werd verwijderd door te wassen met PBS, en membranen werden aan de lucht gedroogd. Gemigreerde cellen werden onderzocht onder een lichtmicroscoop, en cellen in verschillende willekeurig geselecteerde velden per insert werden op een geblindeerde manier geteld om de migratiecapaciteit te kwantificeren.
TUNEL apoptose-assay
Voor apoptosedetectie werden RAW264.7-cellen gekweekt op glazen dekfolies en onderworpen aan de aangegeven behandelingen of transfecties. De cellen werden 30-60 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gespoeld met PBS. De endogene peroxidaseactiviteit werd geblokkeerd door incubatie in 0,3% waterstofperoxide gedurende 20 minuten, gevolgd door PBS-wasbeurten. Er werd een TUNEL-assaykit gebruikt en het labelmengsel werd aangebracht om de cellen te bedekken. Monsters werden ongeveer 60 minuten geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde kamer, waarna de reactie volgens de instructies van de kit werd gestopt. Na 30 minuten incubatie met streptavidine-HRP of een equivalent detectiereagens bij 37 °C, werden de kernen gevisualiseerd met een chromogeen substraat zoals 3,3′-diaminobenzidine (DAB) totdat bruin gekleurde apoptotische kernen zichtbaar werden. De glaasjes werden gekleurd met hematoxyline, gedehydrateerd met gegradeerde ethanol, gezuiverd met xyleen en gemonteerd met een permanent medium. Apoptotische cellen en totale kernen werden waargenomen onder een lichtmicroscoop, en de apoptotische index werd berekend als het percentage TUNEL-positieve cellen.
Immunofluorescentie
Voor immunofluorescentie werden paraffine-ingebedde weefselsecties in xyleen ontwaxd en via een gegradueerde ethanolserie gerehydrateerd naar water. Antigeenwinning werd uitgevoerd met een geschikte buffer (zoals citraatbuffer, pH 6,0) en warmte-geïnduceerde epitoopwinning via een magnetron of snelkookpan, volgens de antistofaanbevelingen. Na afkoelen en spoelen werden secties 1 uur geblokkeerd met 5% normaal serum in PBS bij 37 °C om de niet-specifieke binding te verminderen. Weefsels werden vervolgens 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen markers van macrofagenpolarisatie en inflammatoire cytokines, waaronder CD206, TNF-α, IL-1β, IL-6, induceerbare stikstofoxidesynthase (iNOS), IL-4, IL-10 en Arg-1 (meestal bij verdunning van 1:500), verdund in een blokkerende buffer.
De volgende dag werden secties gewassen in PBS en geïncubeerd met geschikte fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij 37 °C in het donker. De kernen werden 5 minuten geïntroduceerd met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). Na de laatste wasbeurten werden secties gemonteerd met een antifade montagemedium en onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop met geschikte filtersets. Beelden werden gemaakt met consistente belichtingsinstellingen over groepen, en schaalbalken (bijvoorbeeld 20 μm) en vergrotingen werden aangegeven in alle figuurpanelen en opschriften.
CLP-geïnduceerd sepsis muismodel
Mannelijke C57BL/6 muizen (24-32 g) werden minstens 1 week voor de operatie geacclimatiseerd en vervolgens willekeurig toegewezen aan Sham, CLP, CLP plus negatieve controle korte haarspeldgroepen, of CLP plus NEAT1 korte haarspeldgroepen (n = 6 per groep). Muizen werden ongeveer 1-3 minuten verdoofd door het inhaleren van ether in een gesloten kamer, totdat de rectingreflex-ether of een ander door de instelling goedgekeurd anestheticum verloren ging, met een dosis en blootstellingsduur die het verlies van de rectingreflex veroorzaakte, terwijl de ademhalingsfunctie voldoende bleef. Het buikhaar werd afgeschoren en de huid werd gedesinfecteerd met een geschikte antiseptische oplossing. Er werd een midline laparotomie van ongeveer 1-2 cm uitgevoerd om het ceum met de aangrenzende darm bloot te leggen.
Bij CLP werd het ceum voorzichtig naar buiten gebraten en geligeerd met een steriele hechting op ongeveer tweederde van de lengte, waarbij werd gelet dat de ileocecale klep niet werd verstopt of de mesenterische bloedstroom niet werd belemmerd. Het geligeerde cecum werd tweemaal doorboord met een steriele naald van de gauge die in het goedgekeurde protocol is gespecificeerd (bijvoorbeeld 21 G), en een kleine hoeveelheid fecaal materiaal werd voorzichtig geëxtrudeerd om de openheid van de punctieplaatsen te waarborgen. Het cekumum werd vervolgens teruggebracht naar de buikholte en de buikwand en huid werden in lagen met hechtingen gesloten. Schijn-opererende muizen ondergingen dezelfde laparotomie en cekumblootstelling zonder ligaties of prik.
Om in vivo knockdown van NEAT1 te bereiken, werden een adenovirale vector die shNEAT1 codeert en een overeenkomstige negatieve controlevector voorbereid bij een gedefinieerde titer (bijvoorbeeld 1 × 10 �9 plaque-vormende eenheden/mL). Een vaste hoeveelheid virale suspensie (zoals 100 μL per muis) werd via de staartader toegediend op een gespecificeerd tijdstip ten opzichte van CLP (bijvoorbeeld 1 uur na de operatie), zoals beschreven in het experimentele ontwerp en goedgekeurd door de ethische commissie. Na de operatie kregen muizen standaard postoperatieve zorg, waaronder subcutane reanimatie indien geïndiceerd, en werden ze gemonitord op klinische tekenen van sepsis en stress. Op het vooraf bepaalde tijdstip werden dieren humanief geëuthanaseerd door een overdosis ether in een gesloten kamer, waarbij ongeveer 5-10 ml ether werd gebruikt om een snelle ademhalingsstop te garanderen, gevolgd door bevestiging van overlijden, bloed werd verzameld voor cytokineanalyse en organen werden geoogst voor histopathologie, immunofluorescentie en moleculaire tests.
Statistische analyse
Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS versie 23.0 of een gelijkwaardige statistische softwarepakket. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), tenzij anders vermeld. Voor vergelijkingen tussen twee groepen werd een ongepaarde Student's t-test gebruikt wanneer de gegevens normaal verdeeld waren met homogene varianties. Voor vergelijkingen tussen drie of meer groepen werd eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) toegepast, gevolgd door passende post hoc-tests voor meervoudige vergelijkingen wanneer een significant totaaleffect werd gedetecteerd. Een tweezijdige p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. De betekenis van statistische symbolen (bijvoorbeeld p < 0,05, *p < 0,01) werd gedefinieerd in de figuurlegendes, en het aantal biologische replica's wordt aangegeven in de bijbehorende tekst of legendes.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Detectie van NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1-expressie en interacties bij sepsis
In serum van patiënten met sepsis waren de NEAT1- en HMGB1-niveaus significant hoger dan bij gezonde controles, terwijl miR-181a-5p duidelijk was verlaagd. Vergelijkbare expressiepatronen werden waargenomen in PBMC's en in RAW264.7-macrofagen die gestimuleerd werden met lipopolysakkaride, wat aangeeft dat deze as consequent veranderd is bij sepsis- en sepsisachtige ontstekingsaandoeningen (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Sepsis wordt gekenmerkt door diepgaande en vaak langdurige immuunontwrichting, waarbij fasen van hyperontsteking en immunosuppressie naast elkaar bestaan en samen bijdragen aan orgaanfalen en slechte uitkomsten21,22. Steeds meer bewijs wijst erop dat lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) aan deze processen deelnemen door inflammatoire signalering en macrofagenpolarisatie te moduleren23,24
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven geen concurrerende financiële belangen aan.
De auteurs bedanken het klinisch en laboratoriumpersoneel van het Affiliated Hospital van de Universiteit van Hebei voor hun hulp bij het werven van patiënten, het verwerken van monsters en de zorg voor dieren. Dit werk werd ondersteund door de Gezondheidscommissie van de provincie Hebei (Subsidie nr. 20220640).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adenoviral Vector (shNEAT1) | 10692-V5 | Vigene Biosciences | Adenovirus gebruikt voor het verlagen van NEAT1 expressie in vivo en in vitro. |
| BCA Protein Assay Kit | 23227 | Thermo Fisher | Kit gebruikt om de eiwitconcentratie in cel lysaten te kwantificeren. |
| Dual-Luciferase Reporter Assay Kit | E1910 | Promega | Kit gebruikt voor dual-luciferase reporter assays om miR-181a-5p interactie te meten. |
| ELISA Kits (Cytokines) | N/A | R&D Systems | Kits gebruikt voor het meten van cytokine niveaus in serum en weefselmonsters. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | 16000-044 | Gibco | Supplement gebruikt in kweekmedia voor celgroei. |
| GAPDH Antibody | 2118S | Cell Signaling Technology | Primaire antilichaam tegen GAPDH gebruikt als ladingscontrole in western blot. |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | N/A | Thermo Fisher | Kit gebruikt voor histologische kleuring van weefselsecties voor pathologische analyse. |
| Immunofluorescence Antibodies (CD206) | 14693-1-AP | Proteintech | Antilichaam gebruikt voor het detecteren van M2 macrofaag marker CD206 in weefselsecties. |
| Lipopolysaccharide (LPS) | L2630 | Sigma-Aldrich | LPS gebruikt om inflammatoire macrofaag polarisatie in RAW264.7 cellen te induceren. |
| miR-181a-5p Mimic | N/A | N/A | Synthetisch miR-181a-5p mimic gebruikt om miR-181a-5p niveaus te moduleren. |
| NEAT1 Expression Plasmid | N/A | N/A | Plasmid gebruikt voor overexpressie van NEAT1 in RAW264.7 macrofagen. |
| RAW264.7 Macrophage Cells | TIB-71 | ATCC | Murine macrofaag cel lijn gebruikt voor in vitro experimenten. |
| RIPA Lysis Buffer | 89901 | Thermo Fisher | Buffer gebruikt voor het lyseren van cellen om totaal eiwit te extraheren. |
| RPMI-1640 Medium | 11875-093 | Gibco | Kweekmedium voor RAW264.7 macrofagen. |
| SYBR Green Master Mix | 4385612 | Thermo Fisher | Reagens gebruikt voor kwantitatieve real-time PCR analyse. |
| Transwell Migration Assay Chambers | 3422 | Corning | Chambers gebruikt voor transwell migratie assays om macrofaag migratie te beoordelen. |
| TUNEL Apoptosis Assay Kit | ab66110 | Abcam | Kit gebruikt voor het detecteren van apoptose in RAW264.7 cellen door TUNEL kleuring. |
| Western Blotting Antibodies (HMGB1) | ab18256 | Abcam | Primair antilichaam tegen HMGB1 gebruikt in western blotting. |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.