Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Dit protocol maakt de integratie van next-generation sequencing en multicolor immunofluorescentie mogelijk om longadenocarcinoom te profileren. Het heeft als doel de relatie te analyseren tussen genomische heterogeniteit en tumor-infiltrerende immuunceldichtheid. Deze multidimensionale aanpak faciliteert een uitgebreide evaluatie van de tumormicro-omgeving voor postoperatieve prognostische beoordeling.
De prognose van longadenocarcinoom (LUAD) wordt traditioneel beoordeeld via tumor-node-metastasis (TNM) stadiering, die geen rekening houdt met de immuunstatus van de patiënt. Dit protocol integreert genomische profilering en immuno-microomgevingsanalyse om een meer uitgebreide postoperatieve prognostische evaluatie mogelijk te maken. De methode omvat een retrospectieve analyse van paraffine-ingebedde tumorweefsels met behulp van twee primaire technieken. Ten eerste wordt next-generation sequencing (NGS) uitgevoerd met een aangepast paneel van 37 genen om mutaties in drivergenen en varianten van onzekere betekenis te identificeren. Ten tweede wordt multiplex immunofluorescentie (mIF) gebruikt om markers zoals HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 en PanCK te targeten. Dit maakt het mogelijk om de ruimtelijke verspreiding en dichtheid van specifieke immuuncelsubpopulaties over verschillende tumorregio's te kwantificeren. Deze geïntegreerde aanpak maakt gelijktijdige beoordeling van genomische heterogeniteit en tumor-infiltrerende immuuncelkenmerken mogelijk. De resulterende gegevens identificeren specifieke combinaties van mutatieprofielen—zoals EGFR-status —en dichtheden van immuuncellen. Deze geïntegreerde combinaties maken het mogelijk hun gezamenlijke impact op de overleving van patiënten te bestuderen en bieden een veelbelovende benadering voor de ontwikkeling van toekomstige prognostische modellen voor longkanker. Dit protocol demonstreert een robuuste methode om de complexe biologische kenmerken van de LUAD-tumormicro-omgeving te karakteriseren.
LUAD is het meest voorkomende subtype longkanker, maar de gemiddelde overlevingskans van 5 jaar blijft laag van ongeveer 15%. De huidige prognostische evaluatie is voornamelijk gebaseerd op het TNM-stadieringssysteem; deze methode negeert echter vaak de algehele immuunstatus van de patiënt, wat de voorspellende nauwkeurigheid kan beperken. Bewijs suggereert dat zowel genomische heterogeniteit als de tumormicro-omgeving (TME) een cruciale rol spelen in de tumorvorming en ziekteprogressievan LUAD 2,3.
In de afgelopen jaren heeft de overgang van traditionele Sanger-sequencing naar gerichte NGS de hooggevoelige, gelijktijdige analyse van meerdere drivergenen, zoals EGFR, TP53 en KRAS 4,5, mogelijk gemaakt. Hoewel NGS een hoogresolutiekaart van genetische veranderingen biedt, kunnen genomische gegevens alleen de complexe cellulaire interacties en ruimtelijke organisatie binnen de TME niet vastleggen.
Om deze complexiteiten aan te pakken, biedt mIF aanzienlijke voordelen ten opzichte van traditionele immuunprofileringsmethoden. Hoewel single-plex immunohistochemie (IHC) beperkt is tot één marker per sectie, maakt mIF het mogelijk om meerdere eiwitmarkers gelijktijdig te detecteren, terwijl de ruimtelijke architectuur van het weefsel behouden blijft. In tegenstelling tot sequentiële IHC, die weefseldegradatie kan veroorzaken, of flowcytometrie en bulk RNA-sequencing, wat leidt tot verlies van ruimtelijke lokalisatie en single-cel resolutie 6,7,8, maakt mIF gecombineerd met ruimtelijke regio-annotatie in situ, multi-parameter karakterisering van het immuunlandschap9 mogelijk.
Dit protocol stelt een gecombineerde workflow vast die gerichte NGS, mIF- en ruimtelijke regio-beoordeling integreert (inclusief het hele weefsel, tumorgrens en tumorkern). Zo'n multidimensionale benadering is noodzakelijk om de wisselwerking tussen genomische veranderingen en de dichtheid van immuuncellen te onderzoeken—een relatie die enkelmodaliteitsbenaderingen vaak niet weten te vangen. Door deze geïntegreerde kenmerken te evalueren, biedt dit protocol een aanvullende strategie voor het karakteriseren van de biologische kenmerken van LUAD en biedt het een robuuster kader voor postoperatieve prognostische stratificatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze retrospectieve studie is goedgekeurd door de Medische Ethische Commissie van het Kunming Yan'an Ziekenhuis (Goedkeuringsnummer 2021-140-01). Van alle deelnemers werd geïnformeerde toestemming verkregen.
Studieontwerp en monsterverzameling
Een cohort van 63 patiënten met pathologisch of histologisch bevestigde LUAD die tussen 2015 en 2021 een chirurgische resectie ondergingen, werd opgenomen. Uitsluitingscriteria omvatten het ontvangen van neoadjuvante chemotherapie, radiotherapie of immunotherapie voorafgaand aan de operatie. Daarnaast werden patiënten met gelijktijdige maligniteiten, ernstige comorbiditeiten, slechte weefselkwaliteit of onvolledige klinische dossiers uitgesloten van de analyse. Formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) tumorblokken werden verwerkt tot 1 mm secties voor deparaffinisatie. Zoals geïllustreerd in de workflow (Figuur 1), ondergingen deze monsters een geïntegreerde analyse met behulp van mIF en gerichte NGS. Deze gecombineerde aanpak maakt gelijktijdige evaluatie van genomische veranderingen en immuunmicro-omgevingskenmerken mogelijk, waardoor een multidimensionaal kader wordt geboden voor het karakteriseren van tumorbiologie.
Vervolg
De gerichte medicijnen, immunotherapie en ziekteprogressie of overlijden van de patiënt werden telefonisch gevolgd, en er werd gedetailleerde informatie verkregen over de overlevingsstatus, ziekteprogressie of recidief, adjuvante behandelingen na de operatie en eventuele nieuw gediagnosticeerde comorbiditeiten. De follow-uptijd eindigde in juli 2023 en het uiteindelijke observatie-eindpunt was ziekteprogressie of overlijden. De algehele overleving werd gedefinieerd als de tijd van het begin van de operatie tot aan het overlijden van de patiënt. Er kwamen geen patiënten verloren bij de follow-up. De minimale follow-uptijd was 21 maanden.
NGS-bibliotheekvoorbereiding en -sequencing
DNA-extractie uit FFPE-weefselsecties
Verkrijg FFPE-weefseldoorsneden (3–10 μm dikte) van pathologische monsters. Plaats secties in steriele microcentrifugebuizen. Voeg xyleen toe aan elke buis en laat het 5–10 minuten op kamertemperatuur incuberen om paraffine te verwijderen. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant voorzichtig weg. Herhaal de xyleenbehandeling één keer om volledige deparaffinisatie te garanderen. Was de pellet twee keer achter elkaar met 100% ethanol om het resterende xyleen te verwijderen. Laat de pellet aan de lucht drogen op kamertemperatuur totdat de resterende ethanol volledig is verdampt. Voeg geschikte lysisbuffer en proteïnase K toe (geleverd in de DNA-extractiekit) en incubeer bij 56 °C gedurende 1–3 uur (of indien nodig een nacht) totdat het weefsel volledig gelyseerd is. Voer een extra incubatie uit bij 90 °C gedurende 1 uur om formaline-kruisverbinding te keren. Extraheer genomisch DNA met een commerciële FFPE DNA-extractiekit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. De DNA-kwaliteit van FFPE-monsters is vaak gefragmenteerd; daarom moet DNA-kwaliteit minimale integriteitsdrempels halen (bijv. DIN ≥ 5) om een succesvolle bibliotheekvoorbereiding voor gerichte NGS te waarborgen.
DNA-kwantificatie en normalisatie
Kwantificeer DNA met een fluorometrische methode om nauwkeurige concentratiemeting te garanderen. Normaliseer DNA-monsters tot een eindconcentratie van ongeveer 5–10 ng/μL met behulp van een Tris-HCl-buffer (pH 8,5). Voer verdunningsstappen geleidelijk uit indien nodig om de nauwkeurigheid en stabiliteit van de DNA-concentratie te waarborgen.
Bibliotheekvoorbereiding en doelverrijking
Bereid sequencingbibliotheken voor met behulp van hybride, op vangst gebaseerde gerichte NGS op DNA geëxtraheerd uit FFPE-weefsel10. Voer doelverrijking uit met een aangepaste probe-panel die exonische gebieden van geselecteerde genen omvat die geassocieerd zijn met tumorontwikkeling. Beoordeel bibliotheekkwaliteit en fragmentgrootteverdeling met standaardmethoden (bijvoorbeeld elektroforese-gebaseerde systemen), indien nodig.
Bibliotheekpooling en -sequencing
Kwantificeer elke bibliotheek met behulp van een fluorometrische assay. Verzamel bibliotheken bij equimolaire concentraties volgens de vereisten van de sequencing-kit. Laad gepoolde bibliotheken op het Illumina-sequencingplatform en voer sequencing uit met een 150 bp pair-end sequencingpatroon.
Gegevensverwerking en variantdetectie
Ruwe sequencing-reads werden verwerkt met behulp van standaard bio-informatica-pijplijnen, waaronder adaptertrimning, kwaliteitsfiltering en uitlijning met het menselijke referentiegenoom (GRCh37/hg19). De kwaliteitscontrole-metrics waren als volgt: Q20 > 85%, gemiddelde sequencingdiepte > 2500x, on-target rate > 65%, en Fold 80 base penalty ≤ 2. Kwaliteitscontrole en uitlijning: Ruwe FASTQ-gegevens ondergingen kwaliteitscontrole met behulp van FastQC en Trim Galore (of Trimmomatic) om adaptervervuiling en lage kwaliteit sequenties te verwijderen. Opgeschonen reads werden uitgelijnd met het GRCh37 (hg19) menselijke referentiegenoom met behulp van de Burrows-Wheeler Aligner (BWA). Post-alignering verwerking: Sorteren, duplicaat markeren en base quality score recalibratie (BQSR) werden uitgevoerd met behulp van Picard en de Genome Analysis Toolkit (GATK) om vals-positieve oproepen te minimaliseren. Variant calling: Germline single-nucleotide polymorfismen (SNP's) en InDels werden gedetecteerd met BWA MEM (0.7.16a - r1181). Somatische SNV's en InDels werden geïdentificeerd via een consensusbenadering met Mutect2 en VarScan2. Laagfrequente mutaties werden verder geëvalueerd met behulp van het Freebayes (v 1.3.2) statistisch model. Annotatie en filtering: Varianten werden geannoteerd met ANNOVAR, waarbij data van gnomAD, ClinVar en COSMIC werd geïntegreerd. Kimlijnvarianten werden onderscheiden van somatische mutaties door hoogfrequente populatie-SNP's eruit te filteren en variant allelfrequenties (VAF) te evalueren. VAF-drempels: Een VAF-grens van ≥5% werd gebruikt voor klonale gebeurtenissen (bijv. ROS1 en ALK), terwijl een drempel van 1% werd toegepast op genmutaties (bijv. EGFR) om de detectie van laagfrequente veranderingen te waarborgen, wat mogelijk werd gemaakt door de hoge gemiddelde sequencingdiepte van >500x. Kimlijnmutaties werden onderscheiden van somatische mutaties met behulp van de 1000 Genomes Project (1000G) data en een lokale basislijn database van gezonde Han-Chinese individuen die in ons laboratorium was opgezet. De pathogeniciteitsbeoordeling van gedetecteerde somatische varianten werd uitgevoerd volgens het AMP/ASCO/CAP-kader11, dat de bewijsbeoordeling voor somatische varianten verfijnt via een gelaagde, op bewijs gebaseerde aanpak. Pathogene/waarschijnlijk pathogene (P/LP) varianten blijven behouden, waarbij hun classificatie is gebaseerd op Tier I/II-criteria die A/B (FDA-goedkeuring, klinische studies) of C/D (preklinische/casestudies) bewijs vereisen voor beoordeling. Tier III (VUS) mist sluitend bewijs, terwijl Tier IV goedaardige varianten aangeeft via populatiefrequentie (bijv. gnomAD) of functionele studies; Deze mutaties worden uitgesloten van latere analyses. De pathogeniciteitsbeoordeling van gedetecteerde kiemlijnvarianten werd uitgevoerd volgens de ACMG/AMP-richtlijnen12. In deze studie werden varianten van pathogene (P), waarschijnlijk pathogene (LP) en onzekere significantie (VUS) geregistreerd. Alleen hoog-betrouwbaarheidsvarianten die voldoen aan kwaliteitscontrolecriteria werden opgenomen in downstream analyses (QUAL ≥1; dekkingsdiepte >10 voor kiemlijnmutatie en dekkingsdiepte >500x voor somatische mutatie)
Monstervoorbereiding uit FFPE-weefsel
Bereiding van paraffinesecties
Snijd FFPE-weefselblokken in secties van 3 μm dik met behulp van een microtoom. Drijf secties op een waterbad van 40–45 °C om het weefsel plat te maken. Bevestig secties op zelfklevende microscoopglaasjes en droog ze op kamertemperatuur. Plaats de glaasjes 1 uur in een droogoven van 65 °C om een stevige hechting van weefselsecties aan de glaasjes te garanderen en overtollige paraffine te smelten.
Deparaffinisatie en rehydratatie
Leg de slides in een beitsrek en dompel ze 5 minuten onder in clearing solution I. Schuif de slides achtereenvolgens over naar clearingoplossing II en clearingoplossing III, elk 5 minuten, om paraffine volledig op te lossen. Breng de glaasjes over naar 100% ethanol gedurende 3 minuten om de resterende zuiveringsreagens te verwijderen. Rehydrateer weefselsecties via een gegradueerde ethanolserie: 95% ethanol voor 3 minuten en 80% ethanol voor 3 minuten. Spoel de glijders 2 keer af in gedestilleerd water, met 3 minuten tussen de wasbeurten. Xyleen en ethanol die tijdens deparaffinisatie werden gebruikt, werden verwerkt in een chemische dampkap vanwege hun vluchtigheid en toxiciteit. Alle afvaloplossingen met organische oplosmiddelen werden afzonderlijk verzameld en afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor de verwijdering van gevaarlijk afval.
HE-beitsingsscheidingswand
Hematoxyline- en eozinkleuring
Dompel dia's na deparaffinisatie en rehydratatie in hematoxylineoplossing gedurende 5–10 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de schuifjes 5 minuten onder stromend kraanwater. Differentieer de glaasjes in 1% zoutzuuralcohol gedurende enkele seconden (3–10 seconden). Spoel direct af met stromend kraanwater. Blauwe kernen door de glaasjes 5 minuten in kraanwater of blu-oplossing te dompelen. Dompel glaasjes 1–3 minuten onder in eosine oplossing bij kamertemperatuur. Spoel indien nodig kort af in gedestilleerd water.
Uitdroging en opruimen
Droog water glijdt door gegradueerd ethanol: 80% ethanol gedurende 1 minuut; 95% ethanol voor 1 minuut, en 100% ethanol 2 keer voor 1 minuut. Doorschijnende dia's in xyleen I–II, elk 2–5 minuten.
Montage
Breng een druppel Neutral balsam aan. Plaats voorzichtig een dekmantel om luchtbellen te voorkomen. Laat de glaasjes op kamertemperatuur drogen voordat je beeldvorming neemt.
Multiplex-immunofluorescentiekleuring van FFPE-weefseldoorsneden
Sequentiële multiplex immunofluorescentiekleuring werd uitgevoerd om meerdere immuun- en tumormarkers op dezelfde weefselsectie te detecteren. Deze benadering maakt in situ visualisatie van diverse celpopulaties mogelijk, terwijl de ruimtelijke context behouden blijft13. Antigeenopvang: Vul een kleurpotje met een antigeenopvangbuffer. Zet de pot in een magnetron en verwarm op hoog vermogen gedurende 3-5 minuten totdat de oplossing begint te koken. Breng de glaasjes na deparaffinisatie en rehydratatie voorzichtig over in de verwarmde extractiebuffer, zodat de weefselsecties volledig ondergedompeld zijn. De warmte glijdt op laag magnetronvermogen gedurende 15 minuten om efficiënt antigeenontmaskering mogelijk te maken. Laat de glaasjes na het opwarmen 30 minuten natuurlijk afkoelen op kamertemperatuur. Breng de glaasjes 5 minuten over in ijswater om het antigeenophalen te stoppen.
Wassen en het bereiden van hydrofobe barrières
Spoel de slides één keer af met gedestilleerd water om de resterende terughaalbuffer te verwijderen. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een cirkel rond elke weefselsectie te tekenen. Spoel de glijders opnieuw kort af met gedestilleerd water. Wash slides 2x met TBST-buffer. Plaats na elke wasbeurt de schuifstukken horizontaal gedurende 3 minuten om de buffer grondig te verwijderen.
Blokkeren
Breng een blokkeringsbuffer aan om het weefselgedeelte volledig te bedekken (~100 μL per preparat). Incubeer de glaasjes in een bevochtigde kamer op kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
Primaire antistofincubatie
Verwijder de blokkeerbuffer door voorzichtig op de schuifrand op absorberend papier te tikken. Primaire antilichamen tegen HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 en PanCK werden toegepast bij geoptimaliseerde werkverdunningen variërend van 1:100 tot 1:400. Breng ~100 μL verdund primaire antistofoplossing aan op elke weefselsectie. Incubeer glaasjes in een bevochtigde kamer: 37 °C gedurende 1 uur, of 4 °C 's nachts voor verhoogde gevoeligheid.
Wassen
Wash slides 3x met TBST-buffer, 3 minuten per was. Plaats na elke wasbeurt de glijbanen horizontaal om bufferdrainage mogelijk te maken.
Secundaire antilichaamincubatie
Bereid de secundaire antistofoplossing voor door de buffer met 1:3 in TBST te verdunnen. Breng ongeveer 100 μL secundaire antistofoplossing aan op elke glaas. Incubeer slides op 37 °C gedurende 10 minuten in een bevochtigde kamer. Wash slides 3x met TBST, 3 minuten per was.
Fluorescentiesignaalversterking
Verdun het fluorescerende versterkingsreagens met 1:100 in de versterkingsbuffer. Breng 100 μL verdund reagens aan op elke glaasje. Incubeer preparaten 10 minuten op kamertemperatuur in het donker om fotobleaching te voorkomen. Wash slides 3x met TBST, 3 minuten per was.
Antigeenterugwinning tussen markers
Voer de microgolfantigeenopwinning uit zoals beschreven. Na het verwarmen glijdt het afkoelend achter elkaar: 5 minuten in warm water en 5 minuten in ijswater.
Sequentiële kleuring van extra markers
Herhaal primaire en secundaire antistofincubatiestappen voor elke extra antistofmarker. Zorg ervoor dat antigeenwinning wordt uitgevoerd na het kleuren van elke marker voordat je doorgaat naar het volgende antilichaam.
Nucleaire tegenkleuring
Wash slides 1x met TBST-buffer. Breng DAPI nucleaire kleuring aan. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur in het donker. Was slides 3x met gedestilleerd water. Eindpuntbepaling: Kernen moeten duidelijk gekleurd zijn onder fluorescentiemicroscopie.
Alleen de laatste markering
Breng een verdunde biotineoplossing aan in een verdunde 1:200 in de versterkingsbuffer, incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Wash slides 3x met TBST-buffer. Voer antigeenoptrekking uit zoals beschreven. Wash slides 3x met TBST-buffer. Breng endogeen biotineblokkerend reagens aan, incubeer 37 °C gedurende 30 minuten. Breng kleurstof aan met 1:100 TBST en incubeer 30 minuten op kamertemperatuur in het donker. Was slides één keer met TBST en laat 3 minuten afvoeren.
Montage
Voeg een druppel Antifade Mounting Medium toe aan het weefselgedeelte. Leg voorzichtig een dekmantel over de glijbaan. Laat de preparaten drogen voordat je beelden maakt.
Beeldverwerving van H&E- en mIF-secties
Volledige dia-afbeeldingen (WSI) van H&E-gekleurde en mIF FFPE-weefselsecties werden gemaakt met behulp van een dia-scanner. Brightfield-scanning werd uitgevoerd voor H&E-secties, terwijl fluorescentiescanning werd gebruikt voor mIF-secties. Doelstelling: 20x vergroting voor overzichtsscan; 40x vergroting voor regionale beeldvorming met hoge resolutie. Excitatie- en emissie-instellingen: Geoptimaliseerd voor elke fluorofoor volgens de specificaties van de fabrikant. Belichtingstijd en versterking: Automatisch aangepast door beeldvormingssoftware om voldoende signaalintensiteit te garanderen zonder verzadiging.
mIF kwaliteitscontrole en beeldbeoordeling
Om de betrouwbaarheid van de mIF-resultaten te waarborgen, werd een rigoureus QC-protocol geïmplementeerd voorafgaand aan weefselclassificatie en celkwantificatie met behulp van het HALO digitale pathologiesysteem. Artefactverwijdering en waardevol gebiedsdefinitie: Whole-slide beelden (WSI's) werden zorgvuldig beoordeeld om handmatig gebieden met weefselplooien, kleuringsartefacten en niet-specifieke achtergrondsignalen uit te sluiten. Deze stap was essentieel om vals-positieve signalen te voorkomen en de nauwkeurigheid van de ruimtelijke analyse te waarborgen. Na deze screening werd gemiddeld 80% (bereik: 50%–95%) van het weefseloppervlak over alle monsters aangewezen als de evalueerbare mIF-regio. Pathologische verificatie en partitionering: Om tumor- en stromale compartimenten nauwkeurig af te bakenen, werden mIF-secties gekruist met aangrenzende seriële secties die met H&E waren gekleurd. Annotaties werden onafhankelijk beoordeeld door twee ervaren pathologen, waarbij eventuele discrepanties door consensus werden opgelost. Monsters met een tumorweefselgebied van minder dan 30% werden uitgesloten van de studie om de analytische strengheid te behouden. Post-kwantificatie-validatie: Na geautomatiseerde celfenotypering en kwantificatie werden de ruimtelijke distributie en expressiepatronen van immuuncelsubpopulaties opnieuw geëvalueerd door pathologen. Deze review zorgde ervoor dat de digitale kwantitatieve gegevens consistent waren met de onderliggende histomorfologische kenmerken, waardoor de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de bevindingen werden gegarandeerd.
Analyse van digitale pathologie en regio-annotatie
De panoramische gescande beelden werden geïmporteerd in het digitale pathologie-beeldanalyseplatform voor verwerking. De HALO AI Nuclei Seg-Plugin werd gebruikt om cellen te segmenteren en te identificeren. Met de H&E-kleuring als referentie werden de volgende interessegebieden (ROI's) handmatig geannoteerd: Whole tumor region (WSIT); Tumorgrens (TB); Tumorkern (TC). Positieve signaaldetectie werd bepaald op basis van fluorescentie-intensiteitsdrempels en de verwachte subcellulaire lokalisatie van elke marker. Deze compartimentspecifieke benadering werd toegepast om achtergrondinterferentie te minimaliseren en de nauwkeurigheid van immuuncelidentificatie te verbeteren. De dichtheid van immuuncellen werd gekwantificeerd als het aantal marker-positieve cellen per geselecteerde tumorregio. Lijn mIF-afbeeldingen uit met bijbehorende H&E-afgeleide annotaties op basis van weefselmorfologie. Patiënten werden gestratificeerd in groepen met hoge en lage dichtheid op basis van de mediane waarde van de dichtheid van immuuncellen per marker.
Statistische analyse
SPSS 17.0-software werd gebruikt voor analyse. Normaal verdeelde gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie, en niet-normaal verdeelde kwantitatieve gegevens werden uitgedrukt als mediaan (25%-75% kwantielbereik). De correlatie tussen elk genmutatietype, de dichtheid van immuuncellen en klinische kenmerken werd geanalyseerd door het Cox proportional hazards regressiemodel met behulp van het python-lifelines-model. Afhankelijk van de steekproefgrootte en of de gegevens voldeden aan de normale verdeling, werd de Student's test of de Mann-Whitney U-test gebruikt voor de vergelijking tussen continue variabelen. De Wilcoxon signed rank test werd gebruikt voor de vergelijking van rankvariabelen. Chi-kwadraattest of Fisher's exacte test werd geselecteerd voor de analyse van ongeordende categorische variabelen op basis van de steekproefgrootte en theoretische frequentie. De Spearman-test of de Pearson-test werd gebruikt voor correlatieanalyse. De algehele overlevingskans van patiënten werd vastgesteld met de Kaplan-Meier-methode, en de log-rank test werd gebruikt voor de tests. Overlevingscurves werden getekend met de R-taal gebaseerd op RStudio-software. P-waarde <0,10 werd als statistisch significant beschouwd.
Praktische toepasbaarheid en beperkingen
Voor de betrouwbare implementatie van deze geïntegreerde workflow moeten FFPE-weefselblokken voldoen aan strenge kwaliteitsnormen, waaronder een ideale tumorcellulariteit van ≥30% en het ontbreken van uitgebreide necrose of significante weefselartefacten. Het technische succes van mIF is sterk afhankelijk van weefselbehoud; Factoren zoals overfixatie, overmatige schade of hoge achtergrond autofluorescentie kunnen leiden tot onvoldoende antilichaampenetratie en suboptimale signaalintensiteit. Bovendien moeten verschillende inherente beperkingen van deze studie worden meegenomen. Ten eerste is de analyse gebaseerd op een retrospectief cohort van 63 patiënten met één centrum, wat de statistische kracht en de brede generaliseerbaarheid van de bevindingen naar andere populaties kan beperken. Ten tweede is de reikwijdte van de beoordeling beperkt tot een vast 37-gens NGS-panel en een specifieke set immuunmarkers (HLA-DR, CD68, CD163, CD206, PD-L1 en PanCK; Aanvullende Tabel 1). Zoals opgemerkt in de bronnen, biedt deze gecombineerde aanpak een robuuster kader voor prognostische stratificatie, maar zijn grotere prospectieve, multi-center studies noodzakelijk om deze associaties verder te valideren en het voorspellende nut van de geïdentificeerde biomarkers te verfijnen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Klinische kenmerken van patiënten met longadenocarcinoom
In totaal werden 63 patiënten verzameld die de diagnose LUAD kregen en tussen 2015 en 2021een chirurgische behandeling ondergingen in ons ziekenhuis en voldeden aan de inclusiecriteria. De klinische kenmerken van de opgenomen patiënten worden weergegeven in Tabel 1. Onder de ingeschreven patiënten was de mediane leeftijd 60 jaar (47-73 jaar), inclusief 30/63 mannelijke patiënten (46,2%)...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Geïntegreerde genomische en ruimtelijk opgeloste immunologische profilering van LUAD
Deze studie demonstreert een geïntegreerde workflow die gerichte NGS en mIF combineert om het multidimensionale landschap van LUAD te karakteriseren. Onze genomische bevindingen komen overeen met eerdere literatuur, met name wat betreft etnische variaties in mutatiefrequenties. Het waargenomen EGFR-mutatiepercentage (ongeveer 40%-60%) is consistent met gerapporteerde frequent...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven geen commerciële of financiële relaties aan die als een potentieel belangenconflict kunnen worden opgevat.
Dit werk werd ondersteund door het Zhejiang Province Medical and Health Science and Technology Plan Project (2022KY1237); Het Wetenschappelijk Onderzoeksfonds Project van het Onderwijsdepartement van Yunnan (2025Y0387); Het Belangrijkste Onderzoeks- en Ontwikkelingsprogramma van Yunnan (202403AC100002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AlphaTSA Multiplex IHC Kit | alphaxbio Technology Co., Ltd. | AXT36025011 | Multiplex immunofluorescence staining |
| Antifade Mounting Medium | Leagene Technology Co., Ltd. | IH0252, Lot0525A17 | Multiplex immunofluorescence staining |
| CD163 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0428 | RRID:AB_3714707;Multiplex immunofluorescence staining |
| CD206 | Abcam, Inc | Cat# 5307-1 | RRID:AB_10896526;Multiplex immunofluorescence staining |
| CD68 | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0060 | RRID:AB_2904190;Multiplex immunofluorescence staining |
| customlised cancer gene panel | TWIST Co., Ltd. | NGS Library Preparation | |
| Deparaffinization Buffe | QIAGEN Co., Ltd. | 19093 | DNA Extraction HE staining; Multiplex immunofluorescence staining from FFPE Tissue Sections |
| Dynabead M-270 streptavidin | Thermo Co., Ltd. | 65602 | NGS Library Preparation |
| Fluorometer | ThermoFisher Scientific Co., Ltd. | QUBIT 4.0 | NGS Library Preparation |
| HALO digital pathology image analysis platform | Indica Labs, Inc., Albuquerque | version 3.6.4134 | HE staining and Multiplex immunofluorescence staining analysis |
| Hematoxylin-Eosin Staining Kit | Wuhan elabscience Technology Co., Ltd. | E-IR-R117 | HE staining |
| HiPure FFPE DNA Kit | Guangzhou Magen Biotechnology Co., Ltd. | D6323 | DNA Extraction from FFPE Tissue Sections |
| HLA-DR | HUABIO Co., Ltd. | ET1610-66 | RRID:AB_3069950; Multiplex immunofluorescence staining |
| Illumina DNA sequencer | Illumina, Inc | 550DX | Sequencing |
| Neutral balsam | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | G8590 | HE staining |
| Panck | Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd | ZM0069 | RRID:AB_2941997;Multiplex immunofluorescence staining |
| PD-L1 | R and D Systems | Catalog # AF1019 | RRID:AB_354540;Multiplex immunofluorescence staining |
| TBST buffer | abclonla Technology Co., Ltd. | RM00013 | HE staining and Multiplex immunofluorescence staining |
| UN-Blocker | homgen Co., Ltd. | NGS Library Preparation | |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme Co., Ltd. | N411 | NGS Library Preparation |
| VAHTS uniersal DNA library Prep kit for illumina | Vazyme Co., Ltd. | ND610 | NGS Library Preparation |
| whole-slide imaging system | ZEISS Co., Ltd. | ZEISS AXIOSCAN 7 version3.3 | HE staining and Multiplex immunofluorescence staining analysis |
| xGen Hybridization and Wash Kit | IDT Co., Ltd. | 1080577 | NGS Library Preparation |
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen