Hier presenteren we een protocol om globale m⁶A-niveaus semi-kwantitatief te beoordelen met behulp van dot blot. Totaal RNA wordt geëxtraheerd, gedenatureerd, op een nylonmembraan gespoten, onderzocht met anti-m⁶A-antilichaam en visualiseerd door chemiluminescentie. Signaalintensiteit, gekwantificeerd met ImageJ grijswaardenanalyse, weerspiegelt de relatieve methylatie-abundantie en biedt een reproduceerbare workflow voor onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dot Blot-assay voor het detecteren van globale N 6-methyladenosine RNA-modificatieniveaus
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
N 6-methyladenosine (m⁶A) is de meest voorkomende interne modificatie in eukaryote boodschapper-RNA (mRNA) en fungeert als een belangrijke regulator van post-transcriptionele genexpressie. Methoden voor het onderzoeken van m⁶A kunnen op meerdere resolutieniveaus worden toegepast, waaronder globale kwantificatie, nucleotide-specifieke detectie en analyse van specifieke transcripten van belang. Hiervan biedt de dot blot-assay een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve aanpak voor semi-kwantitatieve evaluatie van globale m⁶A-modificatieniveaus. In deze test worden cellen eerst verwerkt om het totale RNA te extraheren, dat vervolgens verdund en gedenatureerd wordt. De RNA-monsters worden op een nylonmembraan geplaatst, onderzocht met een anti-m⁶A-antilichaam en visualiseerd door chemiluminescentie, waarbij de signaalintensiteit de relatieve hoeveelheid methylering aangeeft. Ten slotte worden kwantificering en vergelijking van signaalintensiteiten uitgevoerd door grijswaardenwaarden te meten met ImageJ. In vergelijking met sequencing of op massaspectrometrie gebaseerde methoden vereist dot blot minimale instrumentatie en technische expertise, waardoor het bijzonder geschikt is voor routinematige screening, voorlopige functionele studies en vergelijkende analyses. Dit protocol biedt een gedetailleerde en reproduceerbare workflow voor het implementeren van de m⁶ dot blot assay in zowel fundamenteel onderzoek als translationele toepassingen.
Inleiding
N 6-methyladenosine (m⁶A) is de meest voorkomende interne modificatie in eukaryote boodschapper-RNA (mRNA) en speelt een essentiële rol in post-transcriptionele regulatie, waaronder RNA-stabiliteit, splicing, degradatie, translatie en export 1,2,3. Dysregulatie van m⁶A-modificatie is betrokken bij diverse fysiologische en pathologische processen, waaronder tumorinitiatie, progressie en metastase 4,5. Bij osteosarcoom zijn verhoogde m⁶A-niveaus waargenomen in zowel cellijnen als weefsels, wat wijst op een rol van abnormale RNA-methylering in ziektebiologie 6,7. Daarom is systematische beoordeling van de globale m⁶A-abundantie, samen met de veranderingen in door osteosarcoom geassocieerde transcripten en regulatieroutes, essentieel om de biologische mechanismen en klinische implicaties van RNA-methylering in osteosarcoom te verduidelijken.
Er zijn verschillende analytische methoden beschikbaar om m⁶A modificaties 8,9 te bestuderen. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie/massaspectrometrie (LC-MS/MS)10 en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-gebaseerde assays11 worden beide gebruikt om globale m⁶A-niveaus te meten. De eerste biedt een hoge gevoeligheid maar vereist gespecialiseerde apparatuur en expertise, terwijl de tweede relatief mmA-niveaus geeft en bijdraagt aan een hogere kosten dan de dot blot-assay. MeRIP-qPCR maakt gerichte beoordeling van specifieke transcripten mogelijk, maar wordt sterk beïnvloed door immunoprecipitatie-efficiëntie12. MeRIP-seq13, m⁶A-seq14 en m⁶A-SAC-seq15 zijn sequencing-gebaseerde benaderingen, die m⁶A methylatieplaatsen nauwkeurig kunnen kaarten; ze zijn echter duur en vereisen uitgebreide bio-informatische analyse.
De m⁶A dot blot assay biedt een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve methode om globale m⁶A-modificatieniveaus in RNA te bepalen. Als semi-kwantitatieve immunoassay ligt het belangrijkste voordeel in het genereren van een algemeen beeld van m⁶A-abundantie zonder de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur of complexe bio-informatische analyse. Dit maakt de m⁶A dot blot-assay een waardevol hulpmiddel voor routinematige screening, voorlopige functionele validatie en klinisch onderzoek, evenals een praktische aanvulling op geavanceerde sequencing- en massaspectrometrie-gebaseerde benaderingen. Het huidige protocol biedt een gedetailleerde stapsgewijze workflow, die zorgt voor reproduceerbare detectie en brede toepasbaarheid.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Het protocol is georganiseerd in drie secties: RNA-voorbereiding, dot blot-assay en kwantificatie. Materiaaltabel vat de benodigde materialen samen, Aanvullende Tabel 1 geeft de formuleringen van reagens en Figuur 1 illustreert de experimentele werkwijze.
1. RNA-voorbereiding
- Celvoorbereiding
- Neem 143B-cellen met stabiele SNHG21-knockdown (shSNHG21), negatieve controlecellen (shCtrl) en cellen behandeld met 3-deazaadenosine (3-DAA) weg; [100 μM, 24 h]) en meclofenaminezuur (MA; [100 μM, 24 h]) uit de 37 °C incubator.
- Controleer dat de celconfluentie ongeveer 80-90% is en dat de cellen in goede staat zijn onder een microscoop.
- Verwijder het kweekmedium en spoel de cellen vervolgens twee keer af met 1 ml PBS.
- Verwijder PBS en voeg dan 1 ml trypsine toe per schaal van 6 cm.
- Schud voorzichtig om de trypsine gelijkmatig te verdelen en laat het 1 minuut incuberen.
- Verwijder de trypsine en voeg vervolgens 1 ml medium toe met 10% FBS om de spijsvertering te beëindigen.
- Pipetteer de celsuspensie meerdere keren om de cellen te verspreiden.
- Breng de celsuspensatie over naar een 1,5 mL RNase-vrije microcentrifugebuis.
OPMERKING: Label de tube voor gebruik. Stappen 1.1.3 tot en met 1.1.8 moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd. - Centrifugeer op 1000 × g gedurende 3 minuten en verwijder daarna het supernatant volledig.
- RNA-extractie
OPMERKING: RNA-extractie wordt uitgevoerd met behulp van een EZ-press RNA-zuiveringskit.- Voeg 600 μL lysisbuffer (aanwezig in de RNA-zuiveringskit) toe aan de pellet en vortex grondig om de cellen volledig te lyseren, en laat het 5 minuten staan.
OPMERKING: Ongeveer 2 × 10à 6 cellen worden gebruikt voor RNA-isolatie. - Voeg een gelijke hoeveelheid 100% ethanol en vortex grondig toe.
- Voeg 600 μL van het mengsel toe aan een spinkolom die is samengesteld met een verzamelbuis.
OPMERKING: Assembleer de spinkolom en de verzamelbuis voor gebruik, en label de buis voor gebruik. - Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 1 minuut en gooi de vloeistof weg in de verzamelbuis.
OPMERKING: Vermijd contact tussen de bodem van de kolom en de vloeistof of de operator. - Herhaal bovenstaande stappen 1.2.3-1.2.4 voor het resterende mengsel.
- Voeg 500 μL wash buffer (aanwezig in de RNA-zuiveringskit) toe aan elke spinkolom en laat deze 1 minuut op kamertemperatuur staan.
- Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 1 minuut en gooi de vloeistof weg in de verzamelbuis.
- Centrifugeer de lege kolom opnieuw op 12.000 × g gedurende 1 minuut om de resterende vloeistof te verwijderen.
- Breng de spinkolom over naar een nieuwe 1,5 mL RNase-vrije buis, open het deksel en laat het 2 minuten aan de lucht drogen.
OPMERKING: Label de tube voor gebruik. - Voeg 25-50 μL elusiebuffer (enzymvrij water) toe aan het midden van de spinkolom.
- Incubeer op kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
- Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 1 minuut om RNA te elueren.
- Gooi de spinkolom weg en plaats het RNA op ijs.
OPMERKING: Bewaar RNA bij -80 °C tot gebruik.
- Voeg 600 μL lysisbuffer (aanwezig in de RNA-zuiveringskit) toe aan de pellet en vortex grondig om de cellen volledig te lyseren, en laat het 5 minuten staan.
- RNA-verdunning
- Het meten van de RNA-concentratie van 143B shSNHG21-cellen, 143B shCtrl-cellen en cellen behandeld met 3-DAA en MA met behulp van een DS-11 spectrofotometer.
- Bereid 1 μg totaal RNA voor van elke cellijn.
- Herhaal RNA met met diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water seriematig tot 400 ng, 200 ng en 100 ng.
OPMERKING: Pas de concentratiegradiënt aan indien nodig.
- RNA-denaturatie
- Verhitte verdunde RNA-monsters bij 95 °C gedurende 3 minuten.
- Zet de monsters onmiddellijk over in ijs om af te koelen.
OPMERKING: Gedenatureerd RNA kan tot 1 week worden opgeslagen bij 4 °C.
2. Dotblot
- RNA-spotting
- Snijd het positief geladen nylonmembraan op de gewenste grootte.
- Teken referentielijnen en label het membraan met de naam van het monster.
- Meng het RNA grondig door zacht vortexen of pipetten.
- Plaats 1-2 μL van elk RNA-monster op de aangewezen posities op het membraan.
OPMERKING: Gebruik altijd pipetpunten zonder RNase. Vermijd direct contact tussen de pipettip en het membraan. Laat RNA natuurlijk op het membraan diffunderen. Gebruik voor elk monster een nieuwe pipetpunt. Niet meer dan 2 μL per plek om onregelmatige diffusie te voorkomen.
- RNA-kruisverbondenheid
- Laat het membraan 3 minuten aan de lucht drogen.
- Voer RNA-crosslinking uit door het membraan te bestralen in een UV-crosslinker op 254 nm, 120 mJ/cm².
OPMERKING: Incubeer het membraan op 37 °C gedurende 30 minuten als alternatieve optie. - Was het membraan 5 minuten met 10 mL 1x TBST op een wiegplatform om ongebonden RNA te verwijderen.
- Membraanblokkering
- Bereid een 5% BSA-oplossing voor.
OPMERKING: Bereid deze oplossing vers voor gebruik. - Incubeer het membraan in de blokkeringsoplossing op kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Bereid een 5% BSA-oplossing voor.
- Incubatie van antilichamen
- Incubeer het membraan met anti-m⁶A-antilichaam 's nachts bij 4 °C.
OPMERKING: Verdun het antilichaam 1:1000 in 5% BSA-oplossing vóór gebruik. Breng het membraan op een wiegplatform met zachte schudden (50 rpm). - Was het membraan drie keer met 10 ml 1x TBST op een wiegplatform gedurende 10 minuten.
- Incubeer het membraan met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Verdun het antilichaam 1:1000 in 5% BSA-oplossing vóór gebruik. - Was het membraan drie keer met 10 ml 1x TBST op een wiegplatform gedurende 10 minuten.
- Incubeer het membraan met anti-m⁶A-antilichaam 's nachts bij 4 °C.
- Detectie van chemiluminescentie
- Breng het chemiluminescente HRP-substraat druppelwijs gelijkmatig aan op het membraan.
OPMERKING: Incubeer het membraan met substraat gedurende 1 minuut op kamertemperatuur met zacht wiegen. - Detecteer het signaal met behulp van een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem.
- Gebruik een auto-exposurefunctie in het chemiluminescentiebeeldvormingssysteem als eerste pre-scan.
OPMERKING: Accepteer auto-time alleen als het helderste signaal minder dan 65% verzadigd is; anders halveer je de belichting en herwin je het signaal tot het pieksignaal binnen 30-60% valt.
- Breng het chemiluminescente HRP-substraat druppelwijs gelijkmatig aan op het membraan.
- Methyleenblauw (MB) kleuring
- Incubeer het membraan 1 minuut in de MB-kleuringsoplossing.
- Was het membraan drie keer met 10 mL 1x TBST op een wiegplatform gedurende 5 minuten, en beeld als laadregeling.
OPMERKING: Kleur hetzelfde membraan dat wordt gebruikt voor chemiluminescentie. Vermijd het verstoren van sediment in de kleuroplossing. Draag beschermende kleding en een mondkapje, want MB is moeilijk af te doen. - Destaine het MB-geblokte membraan na beeldvorming met een oplossing met 1% SDS op een wiegplatform gedurende 15 minuten om documentatie of eventueel opnieuw proberen te vergemakkelijken.
3. Kwantificatie
- Meting van grijswaardenwaarden
- Importeer de afbeelding in de ImageJ-software.
- Converteer de afbeelding naar 8-bits formaat met Image > Type > 8-bit.
- Trek achtergrond af met Proces > Achtergrond aftrekken.
OPMERKING: Straal: 50,0 pixels, kijk op lichtachtergrond. - Gebruik de Rechthoek-tool om het analysegebied te selecteren.
- Definieer rijstroken sequentieel met Analyze > Gels > Select First Lane.
- Genereer intensiteitsprofielen met behulp van Analyze > Gels > Plot Lanes en meet pieken.
- Meet respectievelijk de grijswaardenwaarden van m⁶A en MB.
- Kopieer de gegevens naar een tabel voor analyse.
- Vergelijk signaalintensiteiten om globale m⁶A-modificatieniveaus te beoordelen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de prestaties van de dot blot-assay rigoureus te valideren en de rol van SNHG21 bij het reguleren van globale m6 A-niveaus te onderzoeken, werden 143B-cellen onderworpen aan farmacologische verstoringen die de methylering van m6 A onderdrukken of versterken en de hoeveelheid m6 A in beide richtingen monitoren.
Dotblot-kwantificatie van globale m6 A-abundantie
We evalueerden eerst het vermogen van deze assay om ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie resulteerde de knockdown van SNHG21 in osteosarcoom 143B-cellen in een verminderde m⁶A-signaalintensiteit, wat de waarde van deze test aantoont voor het evalueren of genetische modificaties de methylering van RNA beïnvloeden. Daarnaast dient deze assay als hulpmiddel voor meerdere toepassingen, waaronder: 1) Functionele studies en mechanistische validatie: Deze assay kan worden gebruikt voor snelle voorlopige screening om te bepalen of globale m⁶A-niveaus geassocieerd zijn...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs melden geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Nature Science Foundation (82174408, 82374477 en 82474535). Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3-deazaadenosine (3-DAA) | MCE | HY-W013332A | 1 mg |
| Anti-m6A Monoclonal antibody | Proteintech | 68055-1-Ig | 50 µL |
| Bovine serum albumin (BSA, Fraction V) | BioFroxx | 4240GR100 | 100 g |
| ChemiDoc MP Imaging System | BIO RAD | 12003154 | |
| DMEM High Glucose | WISENT | 319-005-CL | 500 mL |
| DS-11 spectrophotometer | DeNOVIX | DS-11 | |
| EZ-press RNA Purification Kit | EZB | B0004DP | 100 Preps |
| FBS- Superior quality | WISENT | 086-150 | 500 mL |
| HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Beyotime | A0216 | 1 mL |
| Immobilon Western chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | 2 × 250 mL |
| Meclofenamic acid (MA) | MCE | HY-117275 | 1 mg |
| Methylene blue staining solution | Solarbio | G1300 | 0.1%, 100 mL |
| Nylon transfer membrane | LABSELECT | TM-NY-XS-45 | 7.4 × 8.5 cm, 0.45 µm, 10 PCS/BAG |
| PBS buffer (ready-to-use dry powder) | biosharp | BL601A | pH: 7.2-7.4, 2 L/zak |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | L5750-500G | 500 g |
| TBS buffer Premix powder | Sangon | A510025-0001 | 1EA (243.9 g powder) |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604-021 | 1×, 500 mL |
| Tween-20 | Sangon | A600560-0500 | 500 mL |
| UV crosslinker | UVP | CL-1000 |
Referenties
- Wang, X., et al. N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability. Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).
- Zhang, Z., Wei, W., Wang, H., Dong, J. N6-methyladenosine-sculpted regulatory landscape of noncoding RNA. Front Oncol. 11 (1), 743990(2021).
- Hsu, P. J., et al. The RNA-binding protein FMRP facilitates the nuclear export of N6-methyladenosine-containing mRNAs. J Biol Chem. 294 (52), 19889-19895 (2019).
- Chen, X. -Y., Zhang, J., Zhu, J. -S. The role of m6A RNA methylation in human cancer. Mol Cancer. 18 (1), 103(2019).
- Li, Y., et al. Molecular characterization and clinical relevance of m6A regulators across 33 cancer types. Mol Cancer. 18 (1), 137(2019).
- Hu, Y., Zhao, X. Role of m6A in osteoporosis, arthritis and osteosarcoma (review). Exp Ther Med. 22 (3), 926(2021).
- Zhang, Y., et al. N6-methyladenosine (m6A) modification in osteosarcoma: expression, function and interaction with noncoding RNAs-an updated review. Epigenetics. 18 (1), 2260213(2023).
- Zhu, W., et al. Detection of N6methyladenosine modification residues (review). Int J Mol Med. 43 (6), 2267-2278 (2019).
- Wang, Y., Jia, G. Detection methods of epitranscriptomic mark N6-methyladenosine. Essays Biochem. 64 (6), 967-979 (2020).
- Stejskal, S., et al. Global analysis by LC-MS/MS of N6-methyladenosine and inosine in mRNA reveal complex incidence. RNA. 31 (4), 514-528 (2025).
- Ensinck, I., et al. m6A-ELISA, a simple method for quantifying N6-methyladenosine from mRNA populations. RNA. 29 (5), 705-712 (2023).
- Liu, J., et al. m6A mRNA methylation regulates AKT activity to promote the proliferation and tumorigenicity of endometrial cancer. Nat Cell Biol. 20 (9), 1074-1083 (2018).
- Zhang, M., Li, Q., Xie, Y. A Bayesian hierarchical model for analyzing methylated RNA immunoprecipitation sequencing data. Quant Biol (Beijing). 6 (3), 275-286 (2018).
- Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
- Mishra, T., Phillips, S., Zhao, Y., Wilms, B., He, C., Wu, L. Epitranscriptomic m6A modifications during reactivation of HIV-1 latency in CD4+ T cells. mBio. 15 (11), e0221424(2024).
- Li, J., et al. METTL16 promotes lipid metabolic reprogramming and colorectal cancer progression. Int J Biol Sci. 21 (11), 4782-4797 (2025).
- Ren, F., Cai, Y., Song, Y. OTUD7B stabilization by METTL14-mediated m6A methylation drives HIF-1α expression in esophageal squamous cell carcinoma. Oncol Res. 33 (8), 2055-2074 (2025).
- Chen, Y., et al. WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1. Mol Cancer. 18 (1), 127(2019).
- Gu, Y., et al. Upregulation of circGDI2 inhibits tumorigenesis by stabilizing the expression of RNA m6A demethylase FTO in oral squamous cell carcinoma. Noncoding RNA Res. 10 (1), 140-152 (2025).
- Ura, Y., et al. Quantitative dot blot analyses of blood-group-related antigens in paired normal and malignant human breast tissues. Int J Cancer. 50 (1), 57-63 (1992).
- Reed, K. C., Mann, D. A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7207-7221 (1985).
- Herrin, D. L., Schmidt, G. W. Rapid, reversible staining of northern blots prior to hybridization. Biotechniques. 6 (3), 196-200 (1988).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. RNA: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2010).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2001).
- Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: Predict and validate. Nat Rev Genet. 18 (5), 275-291 (2017).
- Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
