Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

MeRIP-qPCR-test voor het detecteren vanm6A-modificatieniveaus van specifiek RNA in osteosarcoomcellen

862 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69880

⸱

30 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een gedetailleerde benadering voor het beoordelen vanm6A-modificatieniveaus van specifiek RNA met behulp van MeRIP-qPCR.

Samenvatting

RNA-epitranscriptomische modificatie speelt een cruciale rol bij het ontstaan en ontwikkelen van verschillende kankers, waarvan N 6-methyladenosine (m6A) de meest voorkomende en functioneel diverse modificatie is. Hier presenteren we een gestroomlijnd en reproduceerbaar protocol met MeRIP-qPCRom m6A-modificatieniveaus van specifieke transcripten in osteosarcoomcellen te beoordelen. In deze assay werd totaal RNA geëxtraheerd, gevolgd door incubatie met een specifiek anti-m6A-antilichaam tegen immunocapture-RNA van m6A-modificatie. Vervolgens werd RNA gefragmenteerd en werd verrijking van m6A-gemodificeerde RNA-fragmenten bereikt met behulp van eiwit G magnetische kralen. Het verrijkte RNA werd vrijgegeven door de vertering van proteïnase K en gezuiverd door RNA-bindende kralen. Ten slotte werd RNA onderworpen aan reverse transcriptie en kwantitatieve polymerasekettingreactie (PCR) om m6A-niveaus in kandidaatgenen te beoordelen. De resultaten hebben aangetoond dat deze methode effectief methylatieverschillen onderscheidt en een betrouwbaar hulpmiddel biedt om de functionele mechanismen vanm6A-modificatie in osteosarcoomcellen te onderzoeken. Samenvattend biedt MeRIP-qPCR een eenvoudige en zeer specifieke benadering voor het bestuderen vanm6A-modificatie in osteosarcoomcellen. Dit protocol biedt groot potentieel om m6A regulerende netwerken te verduidelijken en nieuwe therapeutische doelen te identificeren.

Inleiding

Het nieuwste epitranscriptoomonderzoek toont aan dat RNA N 6-methyladenosine (m6A) modificatie, de methylering van de positie van N6 op adenosine, de meest voorkomende bekende intrinsieke chemische modificatie van mRNA in eukaryote cellen1 is. m6A is betrokken bij een breed scala aan biologische processen, waaronder mRNA-stabiliteit, splicing, nucleaire export en translatie-efficiëntie2. Belangrijk is dat steeds meer bewijs suggereert dat de ontregeling vanm6A-modificatie bijdraagt aan het ontstaan en ontwikkelen van verschillende kankers, waaronder osteosarcoom, een zeer agressieve kwaadaardige bottumor die voornamelijk adolescenten en jongvolwassenen treft3.

De studie vanm6A-modificatie vereist robuuste en betrouwbare methodologieën. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld om m6A-modificatieniveaus te detecteren, waaronder m6A dot blot, m6A ELISA en MeRIP-seq. De m6A dot blot-assay is eenvoudig en kosteneffectief, maar lijdt aan beperkte gevoeligheid en slechte kwantificatie. Het levert het m6A-modificatieniveau van het totale RNA, in plaats van het m6A-modificatieniveau van een specifiek RNA4. m6A ELISA biedt relatief gemakkelijke en doorvoervermogendetectie; echter, kruisreactiviteit en lage nauwkeurigheid blijven grote zorgen, en het systeem mist eveneens de capaciteit om transcript- of site-specifieke aanpassingen te onthullen5. MeRIP-seq maakt transcriptome-brede mapping van m6A mogelijk; echter, de eisen voor grote RNA-input, relatief lage resolutie en antilichaamafhankelijkheid beperken de precisie en reproduceerbaarheidvan MeRIP-seq 6. Daarentegen combineert MeRIP-qPCR immunoprecipitatie met kwantitatieve PCR, wat zorgt voor een hogere gevoeligheid en specificiteit voor gerichte detectie van m6A op specifiek RNA7. Deze methode maakt gevoelige en gerichte detectie van differentiële m6A-verrijking in kandidaatgenen mogelijk, waardoor het bijzonder geschikt is voor validatiestudies in m6A-gerelateerd kankeronderzoek. Deze methode biedt een kosteneffectief en toegankelijk alternatief voor laboratoria die m6A-gemedieerde reguleringsmechanismen willen onderzoeken.

Hier hebben we een gedetailleerd protocol gegeven (Figuur 1)om m6A-modificatieniveaus van c-Myc in osteosarcoomcellen te beoordelen met MeRIP-qPCR als voorbeeld. MeRIP-qPCR, dat gebaseerd is op antilichaam-gebaseerde verrijking van gemethyleerde RNA-fragmenten, eveneens in combinatie met reverse transcriptie en kwantitatieve PCR, evalueert de aanwezigheid en relatieve abundantie van m6A op specifiek RNA. We toonden aan dat deze benadering effectief onderscheid maakte tussen methyleringsverschillen van c-Myc en een betrouwbaar platform bood voor het onderzoeken van de functionele rol van m6A in osteosarcoomcellen. Deze studie benadrukt het potentieel van MeRIP-qPCR als een praktisch en specifiek hulpmiddel voor m6A-modificatieonderzoek bij osteosarcoom en legt de basis voor het identificeren van nieuwe therapeutische doelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Het voorbereiden van het RNA

OPMERKING: RNA-extractie wordt uitgevoerd met een RNA-extractiekit. Werk in een schone bioveiligheidskast bij het hanteren van cellen en RNA-reagentia. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, handschoenen, beschermende brillen). Koel de centrifuge voor tot 4 °C voordat je start.

  1. Maak de cellen klaar.
    1. Haal het kweekmedium uit de 3,5 cm schaal en was de cellen voorzichtig één keer met voorgekoelde PBS. Voeg een passend volume RNA-lysebuffer direct aan de schaal toe om de cellen volledig te laten lyseren en pipetteer voorzichtig om te homogeniseren.
    2. Breng de celsuspensie over in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
    3. Centrifugeer op 1000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de rotor in balans is en dat het deksel stevig gesloten is.
    4. Haal de microcentrifugebuis na centrifugatie voorzichtig eruit.
    5. Aspireer het supernatant volledig met een 1 mL pipet zonder de pellet onderaan te verstoren.
      OPMERKING: Raak de celpellet niet aan met de pipetpunt.
  2. Lysecellen.
    1. Voeg 300 μL Lysis Buffer toe aan de celpellet.
    2. Meng grondig door de tube 30 keer om te draaien totdat de oplossing helder en stroperig is zonder zichtbare klonten.
    3. Incubeer de buis 2 minuten op kamertemperatuur.
  3. Precipiteer RNA.
    1. Voeg 300 μL 100% ethanol toe aan het lysaat (gelijk volume Lysis Buffer).
    2. Pipette voorzichtig direct op en neer (ongeveer 8-10 keer) om volledig te mengen.
  4. Voer RNA-kolombinding uit.
    1. Plaats een RNA-zuiveringskolom in een meegeleverde 2 mL verzamelbuis.
    2. Breng het hele mengsel over in de zuiveringskolom.
      OPMERKING: Raak het witte membraan in het midden niet aan.
    3. Sluit de dop en centrifugeer op 12.000 × g gedurende 1 minuut.
    4. Gooi de onderste vloeistof weg en tik voorzichtig ondersteboven op het absorberend papier om de resterende vloeistof te verwijderen.
    5. Plaats de zuiveringskolom terug in de verzamelbuis.
  5. Was onzuiverheden.
    1. Voeg 500 μL Wash Buffer (nucleasevrij water) toe aan de zuiveringskolom.
      OPMERKING: Raak het witte membraan in het midden niet aan.
    2. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 1 minuut en gooi de onderste vloeistof weg.
    3. Centrifugeer opnieuw op 12.000 × g gedurende 1 minuut om de resterende vloeistof te verwijderen.
    4. Breng de zuiveringskolom over in een schone 1,5 mL microcentrifugebuis.
    5. Open de dop en laat de kolom 2 minuten op kamertemperatuur staan.
  6. Elute RNA.
    1. Plaats de zuiveringskolom in een nieuwe 1,5 mL microcentrifugebuis.
    2. Voeg 25 μL Elution Buffer direct toe aan het midden van het membraan.
    3. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur.
    4. Centrifugeer op 12.000 × g gedurende 1 minuut om RNA in de onderste buis te verzamelen.
    5. Breng het eluaat opnieuw aan op het membraan en centrifugeer opnieuw op 12.000 × g gedurende 1 minuut om het opbrengst te maximaliseren.
      OPMERKING: Voeg altijd elutionbuffer direct toe op het midden van het kolommembraan. Vermijd het toevoegen aan de zijwand, omdat dit kan voorkomen dat RNA wordt opgelost en de opbrengst sterk vermindert. Doorboor ook het membraan niet met de pipettop.
  7. Meet de RNA-concentratie.
    1. Spoel de spectrofotometer-monsterpoort met 1,5 μL Elutiebuffer.
    2. Gebruik 1,5 μL Elution Buffer als blank. Bevestig dat de waarde dicht bij nul ligt.
    3. Laad 1,5 μL RNA-monster en meet de concentratie.
    4. Beoordeel de kwaliteit van RNA-monsters met behulp van een spectrofotometer (A260/A280 = 1,8-2,2, A260/A230 = 2,0-2,5) en agarosegelelektroforese.

2. Immunoprecipitatie van gemethyleerd RNA (MeRIP)

  1. Bereiding van immunocapture-mengsel
    1. Koop een nieuwe 0,2 mL PCR-buis.
    2. Voeg componenten toe zoals vermeld in Tabel 1 (voorbeeld voor één reactie).
  2. Immunocapture
    1. Sluit de buisdop stevig. Plaats de PCR-buis op een rotator of rollende shaker.
    2. Broeden 90 minuten op kamertemperatuur.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de oplossing continu en voorzichtig wordt gemengd.
  3. RNA-splijting
    1. Voeg na de incubatie 10 μL Nuclear Digestion Enhancer (NDE) en 2 μL Cleavage Enzyme Mix (CEM) toe aan elke buis.
    2. Meng voorzichtig door 5 tot 6 keer omhoog en omlaag te pipetten.
    3. Broed 4 minuten op kamertemperatuur.
    4. Bereiding van de invoer-RNA-controle
      1. Om consistentie te waarborgen tussen immunoprecipitatie (IP) en invoermonsters, verwerk je een deel RNA parallel als invoercontrole.
      2. Breng 1 μg totaal RNA (10% input) van elk monster over in een aparte PCR-buis. Voeg 20 μL immuno capture buffer (ICB), 1,5 μL NDE, 1 μL CEM toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
  4. Magnetische verrijking en wasbeurt
    1. Plaats de PCR-buis op een magnetische standaard.
    2. Laat de buis 2 minuten staan totdat de oplossing helder is en de kralen op de buiswand worden vastgelegd.
    3. Aspireer voorzichtig en gooi het supernatant weg zonder de kralen te verstoren.
    4. Zet de buis op een magnetische standaard en voeg 150 μL Wash Buffer (WB) toe.
    5. Haal de buis van de magnetische standaard en kantel hem voorzichtig ondersteboven om de kralen volledig te laten ophangen.
    6. Zet de buis terug in de magnetische standaard. Wacht 1-2 minuten tot de oplossing is verdwenen, en gooi dan het supernatant weg.
    7. Herhaal de wasstap drie keer.
    8. Was de kralen nogmaals met 150 μL Protein Digestion Buffer (PDB) met dezelfde methode.
  5. Vrijgave en terugwinning van verrijkt RNA
    1. Bereid de Eiwitverteringsoplossing voor door Protenase K en PDB te mengen in een verhouding van 1:9. (Voor elke reactie bereid je 20 μL: 2 μL Proteïnase K + 18 μL PDB).
    2. Verwijder de buis na de laatste wasbeurt van de magnetische standaard.
    3. Voeg 20 μL vers bereide Protein Digestion Working Solution toe aan de kraalpellet en meng voorzichtig.
    4. Plaats de PCR-buis in een thermische cycler en incubeer op 55 °C gedurende 15 minuten.
    5. Plaats de PCR-buis terug op de magnetische standaard. Wacht tot de oplossing verdwijnt (ongeveer 2 minuten).
    6. Breng voorzichtig het gehele supernatant (ongeveer 20 μL) over naar een nieuwe 0,2 mL PCR-buis.
      OPMERKING: RNA zit nu in het supernatant. Gooi de kralen weg.
  6. RNA-zuivering
    1. Voeg 20 μL RNA Purification Solution (RPS) toe aan elke monsterbuis, negatieve controlebuis en invoerbuis.
    2. Voeg 160 μL 100% ethanol toe.
    3. Vortex RNA-bindende kralen om ze opnieuw te laten ophangen.
    4. Voeg 2 μL geresuspendeerde RNA-bindingskralen toe aan elke buis.
    5. Meng minstens 10 keer grondig op en neer.
    6. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur om RNA-binding mogelijk te maken.
    7. Plaats de buis op de magnetische standaard. Wacht tot de oplossing verdwijnt (ongeveer 2 minuten).
    8. Gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de kralen te verstoren.
    9. Zet de buis op een magnetische standaard en voeg 150 μL vers bereide 90% ethanol toe. Incubeer 30 seconden.
    10. Gooi de 90% ethanol weg. Herhaal de 90% ethanol was nog één keer (in totaal twee wasbeurten).
    11. Haal de buis van de magnetische standaard.
    12. Voeg 13 μL Elution Buffer toe aan de gedroogde kralen.
    13. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur om RNA te elueren.
    14. Zet de buis terug op de magnetische standaard. Wacht tot de oplossing verdwijnt (ongeveer 2 minuten).
    15. Breng voorzichtig het gehele supernatant (ongeveer 13 μL) over in een nieuwe RNase-vrije PCR-buis.
    16. Gebruik het RNA direct of bewaar het bij -20 °C.

3. RT-qPCR

  1. Transcrib het m6A-verrijkte RNA omgekeerd naar cDNA
    1. Gebruik gezuiverd RNA van m6A-IP, Input of IgG-groep voor reverse transcriptie.
    2. Stel de omgekeerde transcriptie (RT) reactie in.
      OPMERKING: Zorg voor gelijke RNA-invoer over alle groepen om betrouwbare vergelijking in downstream qPCR-analyse mogelijk te maken.
  2. qPCR-versterking
    1. Bereid qPCR-reacties voor met behulp van SYBR Green-chemie. Voeg 10 μL SYBR Green Master Mix (2×), 0,5 μL vooraanliggende primer (10 μM), 0,5 μL reverse primer (10 μM), 7 μL ddH2O en 2 μL cDNA toe aan elke buis, meng grondig en centrifugeer kort voordat je het qPCR-instrument laadt.
      OPMERKING: Stel drie replicateputten in voor elk cDNA-monster (Input, IgG, m6A-IP). Zie Tabel 2 voor de lijst met primers.
    2. Start het qPCR-programma.
      1. Voer de qPCR-reacties uit op een realtime thermische cycler met het volgende programma: stel de initiële denaturatie in op 95 °C gedurende 30 seconden; 40 cycli met denaturatie bij 95 °C gedurende 15 seconden, annealing bij 58 °C gedurende 10 seconden, en verlenging bij 72 °C gedurende 30 seconden.
      2. Na amplificatie voert u een smeltcurveanalyse uit door denaturatie in te stellen op 95 °C gedurende 15 seconden, 1 minuut af te koelen bij 60 °C, en vervolgens geleidelijk de temperatuur te verhogen tot 95 °C met een opbouwsnelheid van 0,5 °C/s en continue fluorescentieverwerving om de specificiteit van de versterkte producten te bevestigen.
  3. Data-analyse
    1. Analyseer de CT-waarden van de doel- en controlegroepen.
    2. Bereken verrijking met een van de volgende methoden:
      1. Methoden 1: % invoermethode
        %Input = 2[Ct(Input)−Ct(IP)] × DF × 100%
        OPMERKING: Ct (Input) en Ct (IP) vertegenwoordigen respectievelijk de cyclusdrempelwaarden van de Input- en IP-monsters, en de verdunningsfactor (DF) is de reciproke fractie van de inputfractie die voor qPCR wordt gebruikt (bijvoorbeeld, als 10% van het totale RNA als input werd gebruikt, dan is DF = 10).
      2. Methoden 2: Vergelijkende CT-methode (2^-ΔΔCt-methode )
        ΔCtsample=CtIP−CtIgG
        Ct=ΔCtbehandeld−ΔCtcontrole, Fold=2−ΔΔCt.
        OPMERKING: Houd RNA-invoerhoeveelheden, reactie-opstelling en primer-efficiëntie consistent over alle monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier geven we een representatief resultaat van de MeRIP-qPCR-analyse, het m6A-modificatieniveau van c-Myc in hFOB1.19 en 143B-cellen. Zoals weergegeven in Figuur 2, was de verrijking van c-Myc met anti-m6A-antilichamen significant hoger vergeleken met de IgG-controle, die alleen achtergrondniveaus liet zien, wat suggereert dat het anti-m6A-antilichaam zowel effectief als specifiek is. We observeerden ook dat hetm6A...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

MeRIP-qPCR is uitgegroeid tot een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van RNA m6A-modificaties met brede toepassingen. Het is vooral nuttig bij het valideren van high-throughput sequencingresultaten en het nauwkeurig lokaliseren van modificatieplaatsen binnen specifieke regio's van doelgenen tijdens mechanistische studies. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden toegepast in de meeste moleculaire biologielaboratoria vanwege de relatief lage kosten en operationele ee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 en 82205145).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100% ethanolShanghai Titan Scientific Co.,Ltd., America1158566
143BATCC, AmericaATCC CRL-8303TM
2×SYBR Green qPCR MixBeijing Qihengxing Biotechnology Co., Ltd., ChinaFS-Q1002
Denovix DS-11 DenovixDS-11 Spectrofotometer
DMEM mediumWISENT CORPORATION, China319-005-CL
DMEM/F-12 mediumGibco, America11320033
EpiQuik CUT&RUN m6A RNA Enrichment (MeRIP) KitEpigentek, AmericaP-9018-24
Fetal Bovine SerumWISENT CORPORATION, China086-150
hFOB1.19Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences, ChinaGNHu14
m6A RNA Methylation Assay KitAbcam, Englandab185912
microRNA Reverse Transcription KitEZBioscience-EZB, AmericaA0010CGQ
Real-Time SystemBIO-RAD, AmericaCFX96
Total RNA Extraction KitEZBioscience-EZB, AmericaB0004DP
TrypLE Express EnzymeGibco, America12604021

Referenties

  1. Ma, S., et al. The interplay between m6A RNA methylation and noncoding RNA in cancer. J Hematol Oncol. 12 (1), 121(2019).
  2. Zhu, Z. M., Huo, F. C., Zhang, J., Shan, H. J., Pei, D. S. Crosstalk between m6A modification and alternative splicing during cancer progression. Clin Transl Med. 13 (10), e1460(2023).
  3. Hu, T., Wang, G., Wang, D., Deng, Y., Wang, W. m6A methylation modification: Potential pathways to suppress osteosarcoma metastasis. Int Immunopharmacol. 145, 113759(2025).
  4. Nagarajan, A., Janostiak, R., Wajapeyee, N. Dot blot analysis for measuring global N6-methyladenosine modification of RNA. Methods Mol Biol. 1870, 263-271 (2019).
  5. Yang, Y., et al. Current progress in strategies to profile transcriptomic m6A modifications. Front Cell Dev Biol. 12, 1392159(2024).
  6. McIntyre, A. B. R., Gokhale, N. S., Cerchietti, L., Jaffrey, S. R., Horner, S. M., Mason, C. E. Limits in the detection of m6A changes using MeRIP/m6A-seq. Sci Rep. 10 (1), 6590(2020).
  7. Meyer, K. D., Saletore, Y., Zumbo, P., Elemento, O., Mason, C. E., Jaffrey, S. R. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  8. Zheng, H. X., Zhang, X. S., Sui, N. Advances in the profiling of N6-methyladenosine (m6A) modifications. Biotechnol Adv. 45, 107656(2020).
  9. Matsuzawa, S., Wakata, Y., Ebi, F., Isobe, M., Kurosawa, N. Development and validation of monoclonal antibodies against N6-methyladenosine for the detection of RNA modifications. PLoS One. 14 (10), e0223197(2019).
  10. Law, J., Günther, S., Watanabe, S. Epitranscriptome mapping of N6-methyladenosine using m6A immunoprecipitation with high-throughput sequencing in skeletal muscle stem cells. Methods Mol Biol. 2640, 431-443 (2023).
  11. Mathur, L., Jung, S., Jang, C., Lee, G. Quantitative analysis of m6A RNA modification by LC-MS. STAR Protoc. 2 (3), 100724(2021).
  12. Slama, K., et al. Determination of enrichment factors for modified RNA in MeRIP experiments. Methods. 156, 102-109 (2019).
  13. Guo, W., et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms. Mol Cell. 85 (6), 1233-1246.e7 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

RNA immunoprecipitatieN6 methyladenosineRNA extractieProte ne G beadsantilichaamverrijkingreverse transcriptie PCRRNA fragmentatie
MeRIP-qPCR-test voor het detecteren vanm6A-modificatieniveaus van specifiek RNA in osteosarcoomcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.