Methodenartikel

Gestandaardiseerde methode om tunnelende nanobuisjes in menselijke huidcellen te detecteren voor toepassingen in weefseltechnologie

790 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69883

⸱

13 januari 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College, 2Engineering Laboratory for Biomaterials and Tissue Regeneration, Ningbo Stomatology Hospital, 3Ningbo Savaid Stomatology and Otolaryngology Medical Institute, Ningbo ENT Hospital, 4Department of Urology, the Affiliated People's Hospital of Ningbo University

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een gestandaardiseerd protocol getoond om tunneling-nanotubes tussen menselijke epidermale keratinocyten en dermale fibroblasten te visualiseren met behulp van membraan- en F-actinelabeling met z-stack confocale beeldvorming, met optionele α-tubuline co-kleuring, waardoor reproduceerbare detectie en cytoskeletkarakterisering mogelijk is voor weefselengineeringtoepassingen.

Samenvatting

Tunneling nanotubes (TNT's) zijn dunne, op actine gebaseerde intercellulaire leidingen die het mogelijk maken om organellen en signaallading over lange afstand te vervoeren. Hoewel ze breed worden gerapporteerd over meerdere celtypen, is hun aanwezigheid in menselijke huidcellen niet goed beschreven. Dit artikel beschrijft een gestandaardiseerd protocol om TNT's in vitro te detecteren en karakteriseren tussen menselijke epidermale keratinocyten en dermale fibroblasten. De methode omvat het voorbereiden van een co-kweek van primaire cellen, een zachte fixatie om fragiele TNT's te behouden, membraanlabeling met tarwekiem-agglutinine, F-actinekleuring met falloïdine, en systematische z-stack beeldvorming met omgekeerde confocale microscopie om TNT's boven het substraat te onderscheiden van hechtende filopodia. Optionele immunokleuring voor α-tubuline maakt de beoordeling van microtubuli-incorporatie mogelijk. TNT's worden gedefinieerd door drie kenmerken: dunne, rechte uitsteeksels die twee of meer cellen verbinden, de aanwezigheid van F-actine en continuïteit over celparen in seriële optische secties. Representatieve resultaten tonen TNT's die dermal-dermal, epidermal-epidermal en dermal-epidermal paren verbinden, met variabele cytoskeletsamenstelling (F-actine alleen of F-actine plus α-tubuline). Kritieke stappen zijn onder meer zachte fixatie, het gebruik van verse reagentia en het aanschaffen van voldoende z-vlakken om verkeerde classificatie te voorkomen, terwijl veelvoorkomende artefacten TNT-breuk en onvolledige vlekken zijn. Samen maken deze geoptimaliseerde stappen reproduceerbare TNT-detectie in huidcelsystemen mogelijk en vormen ze een methodologische basis voor toekomstig onderzoek naar TNT-gemedieerde communicatie in de huidbiologie en regeneratie.

Inleiding

Tunneling-nanobuisjes (TNT's) zijn nanoschaal, op actine gebaseerde kanalen die directe intercellulaire overdracht van organellen en signaalmoleculen mogelijk maken. Ze zijn doorgaans 6-100 μm lang en 50-500 nm in diameter, waarvan sommige tot 700 nm dik kunnenworden. In tegenstelling tot lege membraanuitsteeksels bevatten TNT's cytoskeletfilamenten, meestal F-actine, die structurele stijfheid bieden en mitochondriale transportondersteunen 2,3,4. In tweedimensionale cultuur worden TNT's gedefinieerd door drie kenmerken: dun (20-700 nm), rechte uitsteeksels die boven het substratum hangen en twee of meer cellen verbinden; de aanwezigheid van F-actinefilamenten; en de mogelijkheid om vracht over te dragen.

Sinds hun eerste identificatie in PC-12-cellen door Rustom et al.5, zijn TNT's bestudeerd in meerdere systemen, waaronder het cardiovasculaire6, immuun7 en respiratoire8 systeem, corneale epiteel9, tumoren10 en het zenuwstelsel11,12. Ze dragen bij aan fysiologische en pathologische processen zoals immuunsignaaloverdracht, apoptose, materiaaltransport en angiogenese 13,14,15. TNT's kunnen de langeafstandsoverdracht van diverse ladingen bemiddelen, waaronder mitochondriën, endoplasmatisch reticulum, nucleïnezuren, ionen en zelfs virussen 5,16,17.

De huid is een structureel complex orgaan, waarbij de epidermis en dermis afhankelijk zijn van constante communicatie voor homeostase, wondgenezing en regeneratie van het aanhangsel 18,19,20. Hoewel TNT's in veel weefsels zijn beschreven, waaronder het immuunsysteem, het neuronale systeem en het hoornvliesepitheel 7,9,12, is hun aanwezigheid in menselijke huidcellen niet gerapporteerd in de gepubliceerde literatuur. Voortbouwend op het methodologische kader beschreven door Sáenz-de-Santa-María et al.21, presenteren we een gestandaardiseerd en geoptimaliseerd protocol voor het detecteren van TNT's tussen epidermale keratinocyten en dermale fibroblasten22 met behulp van immunofluorescentiekleuring gecombineerd met omgekeerde confocale microscopie.

In vergelijking met alternatieve TNT-detectiebenaderingen biedt dit protocol een praktische balans tussen gevoeligheid en toegankelijkheid. Levendige celbeeldvorming kan TNT-dynamiek vastleggen, maar wordt beperkt door fototoxiciteit en het kortstondige karakter van TNT's 1,23. Elektronenmicroscopie levert ultrastructurele details, maar slaagt er vaak niet in om lange TNT-spans te behouden en is niet praktisch voor routinematige analyse van primaire huidcellen24,25. Op reporters gebaseerde nanobuissystemen maken realtime tracking mogelijk, maar vereisen genetische manipulatie, wat doorgaans inefficiënt is bij primaire keratinocyten en fibroblasten24,26. Daarentegen gebruikt het huidige protocol standaard immunofluorescentie en confocale microscopie, waardoor reproduceerbare TNT-detectie mogelijk is in onafhankelijk voorbereide huidcelculturen, terwijl compatibiliteit met fragiele primaire cellen behouden blijft.

Deze methode is bijzonder geschikt voor analyse van vaste monsters waarbij cytoskeletsamenstelling en TNT-prevalentie van belang zijn. Omdat TNT's zeer fragiel zijn, blijven fixatie- en hanteringsstappen belangrijke beperkingen, en kan de aanpak geen realtime TNT-dynamiek vastleggen. Desalniettemin biedt deze gestandaardiseerde workflow voor laboratoria die werken met primaire menselijke huidcellen een toegankelijke en consistente manier om TNT's te visualiseren en ondersteunt het downstreamstudies van hun potentiële functies in weefselengineering en regeneratie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle huidcellen die in deze studie werden gebruikt, waren eerder ingevroren primaire cellen die geïsoleerd waren uit menselijk huidweefsel, verkregen als weggegooide voorhuidmonsters bij besnijdenisprocedures, en werden volledig gedeïdentificeerd22. De verwerving van menselijke huidmonsters vond plaats op de afdeling Urologie van het Ningbo University Affiliated People's Hospital, en het studieprotocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de instelling (Protocol nr. 2024104; goedkeuringsdatum: 30 oktober 2024).

1. Identificatie van TNT's in menselijke primaire huidepidermale keratinocyten en dermale fibroblasten

  1. Oplossingsvoorbereiding
    1. Bereid fixatieve oplossing 1 (200 μL) voor door 4% PFA (100 μL), 2,5% glutaraldehyde (4 μL), 1 M HEPES (40 μL) en 1x PBS (56 μL) toe te voegen. Bereid het vers voor en verwarm het voor gebruik tot 37 °C.
    2. Bereid fixatieve oplossing 2 (200 μL) voor door 8% PFA (100 μL), 1 M HEPES (0,4 μL), 1x PBS (99,6 μL) toe te voegen. Bereid het vers voor en verwarm het voor gebruik tot 37 °C.
    3. Bereid fixatieve oplossing 3 (200 μL) voor door 8% PFA (100 μL), 2,5% glutaraldehyde (4 μL), 1x PBS (96 μL) toe te voegen. Bereid het vers voor en verwarm het voor gebruik tot 37 °C.
  2. Celkweek
    1. Ontdooi en kweek menselijke epidermale keratinocyten en dermale fibroblasten in schaaltjes van 60 mm met het juiste groeimedium. Supplement keratinocytkweken met Y-27632 bij een uiteindelijke concentratie van 5 μM tijdens reanimatie. Houd de kweek op 37 °C in een bevochtigde broedmachine totdat de cellen ~80% confluentie bereiken.
    2. Verwijder het medium en was de cellen kort met 1 ml 1x PBS (gebruikt om de fysiologische pH en osmolariteit tijdens het wassen te behouden). Aspiraat de PBS.
    3. Voeg 1 ml 0,05% trypsins-EDTA toe, verdeel gelijkmatig en incubeer bij 37 °C gedurende 1,5-2,5 minuten.
    4. Suspensie de cellen voorzichtig opnieuw door te pipetten. Voeg 2 ml groeimedium toe, doe het over in een 15 mL buis en centrifugeer op 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Gooi het supernatant weg en suspendeer het pelletje opnieuw in 1-2 mL medium. Tel cellen met behulp van een geautomatiseerde teller.
    6. Zaad 12.000 dermale fibroblasten of 20.000 keratinocytoten in elke put van een acht-put kamerdia, in een eindvolume van 400 μL. Na het zaaien schud je de kamer goed om de cellen gelijkmatig te verdelen. Incubeer ~24 uur bij 37 °C.
    7. Na ongeveer 24 uur incubatie observeer je de celconfluentie onder een microscoop. Als het ~80% bereikt, ga dan door met de volgende fixatiestappen.
  3. Fixatie
    1. Wanneer culturen ~80% confluentie bereiken, voeg dan voorzichtig enkele druppels Fixatieve Oplossing 1 direct toe aan de kamer om de cellen vooraf te fixeren. Breng 4 minuten uit op kamertemperatuur. Zorg ervoor dat het fixatiemiddel zich gelijkmatig verspreidt zonder de cellen te verstoren.
      VOORZICHTIG: Behandel voorzichtig om verstoring van TNT's te voorkomen. Omdat de fixatieve oplossingen giftige stoffen zoals PFA en glutaraldehyde bevatten, moet je altijd beschermende handschoenen, beschermende kleding en een mondkapje dragen en deze behandelen met een dampkap. Zorg ervoor dat je daarna grondig je handen wast. Verzamel PFA en glutaraldehyde fixatieafval apart in gelabelde containers voor verwijdering van gevaarlijke chemicaliën.
    2. Aspireer het prefixatief en vervang het door 140 μL verse fixatieve oplossing 1, zodat de hele put bedekt is. Broeden 15 minuten uit bij 37 °C.
    3. Verwijder fixatieve oplossing 1 en voeg 140 μL fixatieve oplossing 2 toe. Broeden 15 minuten uit bij 37 °C. Zorg ervoor dat de oplossing de cellen volledig bedekt om een uniforme fixatie te behouden.
    4. Verwijder het fixatiemiddel en voeg vervolgens 140 μL van 100 mM NH₄Cl toe om restaldehyden te verzachten. Incubeer 10-30 minuten op kamertemperatuur.
    5. Spoel de monsters 3 keer af met 1x PBS gedurende 30 seconden op kamertemperatuur, en pipetteer zachtjes langs de kamerwand om te voorkomen dat cellen wegspoelen of TNT's breken.
  4. Membraan- en cytoskeletkleuring
    1. Incubeer cellen met 140 μL van 1:300 (v/v) WGA (tarwekiem agglutinine)-Alexa fluor conjugaat, dat plasmamembraanglycoproteïnen labelt voor visualisatie van membraanafgeleide TNT's, in 1x PBS gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: De volgende stappen moeten in een donkere omgeving worden uitgevoerd.
    2. Was 3x met 1x PBS (30 pagina's elk). Incubeer met 140 μL falloïdineconjugaat verdund 1:250 (v/v) in 1% BSA gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
    3. Was 3x met 1x PBS (30 pagina's elk). Incubeer 5 minuten met 140 μL DAPI-oplossing op kamertemperatuur in het donker.
    4. Was 3 keer met 1× PBS. Voeg 2-3 druppels montagemedium toe, incubeer 20 minuten op kamertemperatuur en bewaar minstens 20 minuten bij 4 °C in het donker tot de beeldvorming.
  5. Beeldvorming
    1. Maak beelden met een omgekeerde confocale microscoop met een 40x objectief. Selecteer willekeurige velden en verzamel Z-stacks (10-20 lagen) van de onderkant naar de bovenkant van de cellen. De specifieke microscoopparameters die worden gebruikt voor beeldverwerving worden hieronder vermeld:
      Confocale laserscanningmicroscoop: ZEISS LSM 900
      Laserlijnen: Spoor 1 (561 nm, 4,0%), Spoor 2 (488 nm, 16,0%), Spoor 3 (405 nm, 60,0%)
      Detectorversterking: 525 V
      Z-stapgrootte: 20 optische secties (totale diepte: 5,32 μm)

2. Co-cultuur van epidermale en dermale cellen

  1. Bereid keratinocysten en fibroblasten voor zoals in stappen 1.2.1-1.2.5.
  2. Zaad 10.000 keratinozyten en 6.000 fibroblasten per kamer in 400 μL medium. Na het zaaien schud je de kamer goed om de cellen gelijkmatig te verdelen. Incubeer 24 uur bij 37 °C.
  3. Na ongeveer 24 uur incubatie observeer je de celconfluentie onder een microscoop. Als het ~80% bereikt, ga dan door met de volgende fixatiestappen.
  4. Herstel en kleur membranen zoals beschreven in stappen 1.3-1.4.
  5. Permeabiliseer cellen met 0,1% Triton X-100, zodat antilichamen toegang krijgen tot intracellulaire doelen, gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur, daarna 3 keer wassen met 1x PBS.
    OPMERKING: 0,1% Triton X-100 moet vers worden voorbereid voor gebruik.
    VOORZICHTIG: Triton X-100, schadelijk voor aquatisch leven, moet ook als chemisch afval worden afgevoerd en nooit in de gootsteen worden gegooid.
  6. Blokk met 140 μL van 2% BSA in PBS om de binding van niet-specifieke antistoffen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te verminderen.
    OPMERKING: 2% BSA moet vers worden voorbereid voor gebruik.
  7. Incubeer 's nachts bij 4 °C met anti-cytokeratine 5-antilichaam verdund 1:200 (v/v) in 2% BSA.
  8. Was 3x met 1x PBS, en incubeer dan 1-2 uur bij kamertemperatuur in het donker met Alexa Fluor 594-geconjugeerd secundair antilichaam.
  9. Was 3 keer met 1× PBS. Kleurkernen met DAPI en afbeelding zoals in stappen 1.4.5-1.5.2.

3. Identificatie van cytoskeletcomponenten van TNT's

  1. Celkweek
    1. Kweek en fix cellen zoals in stappen 1.2-1.3. Permeabiliseer met 0,1% Triton X-100 gedurende 3 minuten op kamertemperatuur, daarna spoel met 1x PBS.
    2. Blok met 2% BSA gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Incubeer 's nachts bij 4 °C met anti-α-tubuline-antistoffen.
    3. Was 3x met 1x PBS en incubeer met Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antistof gedurende 1-2 uur op kamertemperatuur in het donker.
      OPMERKING: De volgende stappen moeten in een donkere omgeving worden uitgevoerd.
    4. Was 3x met 1x PBS. Label F-actine met falloïde en afbeelding zoals in stappen 1.4.3-1.5
  2. Co-culturering van cellen
    1. Bereid co-culturen voor zoals in stappen 2.1-2.2. Fix met fixatieve oplossing 3 gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
    2. Vervang door 140 μL van 100 mM NH4Cl en incubeer 10-30 minuten bij kamertemperatuur. Was 3x met 1x PBS.
    3. Identificer eerst epidermiscellen door permeabilisatie, blokkering en CK5-immunokleuring precies uit te voeren zoals beschreven in stappen 2.4-2.8.
    4. Vervolgens voer je α-tubuline immunokleuring uit volgens stappen 3.1.2-3.1.4.
    5. Kleur tenslotte F-actine met falloïde en ga verder met beeldvorming zoals beschreven in stappen 1.4.2-1.5.2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met dit gestandaardiseerde protocol werden tunneling-nanobuisjes (TNT's) succesvol geïdentificeerd in menselijke huidcellen onder zowel enkelkweek- als co-kweekomstandigheden. Om de specificiteit van antilichamen te valideren, werden zowel positieve als negatieve controlekleuring uitgevoerd voor alle antilichamen voorafgaand aan de experimentele analyses, zoals weergegeven in Aanvullende Figuur 1, Aanvullende Figuur 2, Aanvullende Figuur 3 en Aanvullende Figuur 4...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een cruciale stap in dit protocol is het behoud van TNT's tijdens fixatie en kleuring, omdat deze structuren extreem kwetsbaar zijn en gemakkelijk te verstoren. Voorzichtige behandeling tijdens de fixatie, de juiste timing en het gebruik van verse fixatiemiddelen zijn essentieel om de integriteit van TNT te behouden. Het gebruik van Z-stack confocale beeldvorming is even belangrijk om TNT's die boven het substraat hangen te onderscheiden van filopodia of andere hechtende uitstulpingen, d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen om aan te geven.

Dankbetuigingen

Dit project werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 82273554). De auteurs erkennen het Biomaterials and Tissue Regeneration Engineering Laboratory van het Ningbo Stomatology Hospital voor hun voortdurende ondersteuning en bedanken zowel huidige als voormalige teamleden voor hun waardevolle discussies. De auteurs bedanken ook docent Feng Li van het Research and Experiment Center van het Hangzhou Medical College voor de genereuze hulp en sterke ondersteuning bij het vergemakkelijken van toegang tot de confocale microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15-mL tubeKIRGENKG2611Steriele, RNase/Dnase en pyrogeen vrij
37 °C incubatorThermo Scientific51032877De 37-graden CO2-incubator biedt een ideale omgeving in vitro.
Actin-Tracker Red-RhodamineBeyotimeC2207sActin-Tracker Red-Rhodamine-sonde is een phalloidin gelabeld met de fluorescente kleurstof Rhodamine, met een maximale excitatiegolflengte van 540nm en een maximale emissiegolflengte van 565nm.
Alexa Fluor conjugate of wheat germ agglutinin (WGA)Molecular ProbesW11261 Alexa Fluor 488 Conjugaat
Anti-alpha Tubulin antibodyAbcamab7291Anti-alpha Tubulin antilichaam - Loading Control (ab7291) is een muis monoklonaal antilichaam dat alpha Tubulin detecteert. Geschikt voor mens, muis, rat.
Anti-cytokeratin 5 antibody Abcamab52635Anti-Cytokeratin 5 antilichaam - Cytoskelet Marker (ab52635) is een konijn monoklonaal antilichaam dat Cytokeratin 5 detecteert. Geschikt voor mens, muis, rat.
Aqua-Poly/MountPolysciences18606Wateroplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium geformuleerd voor het monteren van secties uit waterige oplossingen. Handig voor immunofluorescentietechnieken omdat het fluorescerende kleurstoffen verbetert en behoudt.
Automated cell counterCountstarIC1000Automatische celteller voor snelle, nauwkeurige celtelling
Benchtop centrifugeBIORIDGETD5Benchtop centrifuge voor snelle en efficiënte monsterseparatie in laboratoriumomgevingen
Biological safety cabinetThermo Scientific1379Biologische veiligheidskast is een steriele beveiligingsvoorziening die operators, monsters en omgevingen beschermt tegen biogevaren door luchtpadogenes te filteren en kruisbesmetting tijdens microbiologische werkzaamheden te voorkomen.
Bovine serum albumin(BSA)YOBIBIOU5010-10gBSA is een globuline in runder serum met 583 aminozuurresiduen met een molecuulgewicht van 66.430 kDa en een iso-elektrisch punt van 4,7
Cell Culture Dish (60X15 mm)eppendorf30701119Voor behandeling van weefselcultuur. Steriele, vrij van detecteerbare pyrogenen, RNase & DNase, DNA.
Cellvis Chamber Slide-8 ChamberCellvisC8-1.5H-NOntworpen voor hoge resolutie beeldvorming zoals confocale microscopie.
DAPI staining solutionBeyotimeC1006-10 mLDAPI Staining Solution is geschikt voor nucleaire kleuring van alle gangbare cellen en weefsels.
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 405) Abcamab175660Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 405) is een secundair antilichaam met een maximale absorptiegolflengte van 401nm en een maximale emissiegolflengte van 421nm.
Goat Anti-Rabbit IgG H&L conjugated to Alexa Fluor 405Abcamab175652Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 405) is een secundair antilichaam met een maximale absorptiegolflengte van 401nm en een maximale emissiegolflengte van 421nm.
Goat Anti-Rabbit IgG H&L conjugated to Alexa Fluor 594Abcamab150080Goat anti-konijn IgG H&L (Alexa Fluor 594) is een secundair antilichaam met een maximale absorptiegolflengte van 590nm en een maximale emissiegolflengte van 617nm.
Inverted confocal fluorescence microscopeLeicaTCS SP8 XLeica SP8 X laserscanning confocale microscoop levert ongeëvenaarde hoge resolutie beeldvorming met geavanceerde fluorescentie detectie en live-cel analyse mogelijkheden.
Inverted confocal fluorescence microscopeAndorBC43De Andor BC43 is een compacte, hogesnelheids confocale microscoop die 10 keer sneller beeldvorming biedt dan traditionele systemen met één klik 2D/3D beeldvormingsmogelijkheid
NH4Cl MedChemExpressHY-Y1269 Ammoniumchloride als een polair verbinding voor het reguleren van pH.
Phalloidin Conjugates Oregon GreenTM488Life TechnologiesO7466Kleur: Groen. Excitatiegolflengte bereik: 496/520.
Phosphate Buffered Saline (PBS)Viva Cell BiosciencesC3582-0500Het functioneert om de pH van het medium binnen het fysiologische bereik te houden en de osmotische drukbalans binnen en buiten de cel te handhaven.
Triton-X 100SolarbioT8200-100mlHet is een veelzijdige niet-ionogene oppervlakteactieve stof die wordt gebruikt om membraancomponenten te herstellen onder milde denaturatieomstandigheden.
Trypsin-EDTA SolutionGIBCO25300054Vanwege zijn spijsverteringskracht wordt trypsine veel gebruikt voor celdissociatie, routinematige celcultuurpassagering en primaire weefseldissociatie.
Y-27632MedChemExpressHY-10071Y-27632 is een oraal actief, ATP-competitieve remmer van ROCK-I en ROCK-II

Referenties

  1. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Commun Integr Biol. 7 (1), e27934(2014).
  2. Liu, Z., Sun, Y., Qi, Z., Cao, L., Ding, S. Mitochondrial transfer/transplantation: an emerging therapeutic approach for multiple diseases. Cell Biosci. 12 (1), 66(2022).
  3. Yang, F., et al. Tunneling Nanotube-Mediated Mitochondrial Transfer Rescues Nucleus Pulposus Cells from Mitochondrial Dysfunction and Apoptosis. Oxid Med Cell Longev. 2022, 3613319(2022).
  4. Yang, C., et al. Mitochondria transfer from early stages of erythroblasts to their macrophage niche via tunnelling nanotubes. Br J Haematol. 193 (6), 1260-1274 (2021).
  5. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  6. Alarcon-Martinez, L., et al. Pericyte dysfunction and loss of interpericyte tunneling nanotubes promote neurovascular deficits in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (7), 2110329119(2022).
  7. Zhu, C., Shi, Y., You, J. Immune Cell Connection by Tunneling Nanotubes: The Impact of Intercellular Cross-Talk on the Immune Response and Its Therapeutic Applications. Mol Pharm. 18 (3), 772-786 (2021).
  8. Zhang, F., et al. TFAM-Mediated mitochondrial transfer of MSCs improved the permeability barrier in sepsis-associated acute lung injury. Apoptosis. 28 (7-8), 1048-1059 (2023).
  9. Jiang, D., et al. Mitochondrial transfer of mesenchymal stem cells effectively protects corneal epithelial cells from mitochondrial damage. Cell Death Dis. 7 (11), e2467(2016).
  10. Zheng, Y., et al. Tunneling nanotubes mediate KRas transport: Inducing tumor heterogeneity and altering cellular membrane mechanical properties. Acta Biomater. 185, 312-322 (2024).
  11. Dilsizoglu Senol, A., et al. α-Synuclein fibrils subvert lysosome structure and function for the propagation of protein misfolding between cells through tunneling nanotubes. PLoS Biol. 19 (7), e3001287(2021).
  12. Scheiblich, H., et al. Microglia rescue neurons from aggregate-induced neuronal dysfunction and death through tunneling nanotubes. Neuron. 112 (18), 3106-3125.e8 (2024).
  13. Solimando, A. G., et al. Tunneling nanotubes between bone marrow stromal cells support transmitophagy and resistance to apoptosis in myeloma. Blood Cancer J. 15 (1), 3(2025).
  14. Korenkova, O., et al. Tunneling nanotubes enable intercellular transfer in zebrafish embryos. Dev Cell. 60 (4), 524-534 (2025).
  15. Ma, L., et al. Dynamic three-dimensional culture enhances tunneling nanotubes-mediated mitochondrial transfer in mesenchymal stromal cells to accelerate wound healing. J Nanobiotechnol. 23 (1), 559(2025).
  16. Sahinbegovic, H., et al. Intercellular Mitochondrial Transfer in the Tumor Microenvironment. Cancers (Basel). 12 (7), 12071787(2020).
  17. Gurke, S., Barroso, J. F., Gerdes, H. H. The art of cellular communication: tunneling nanotubes bridge the divide. Histochem Cell Biol. 129 (5), 539-550 (2008).
  18. Kobielak, K., Pasolli, H. A., Alonso, L., Polak, L., Fuchs, E. Defining BMP functions in the hair follicle by conditional ablation of BMP receptor IA. J Cell Biol. 163 (3), 609-623 (2003).
  19. Nowak, J. A., Polak, L., Pasolli, H. A., Fuchs, E. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis. Cell Stem Cell. 3 (1), 33-43 (2008).
  20. Woo, W. M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26 (11), 1235-1246 (2012).
  21. Sáenz-de-Santa-María, I., Henderson, J. M., Pepe, A., Zurzolo, C. Identification and Characterization of Tunneling Nanotubes for Intercellular Trafficking. Curr Protoc. 3 (11), e939(2023).
  22. Liu, Z., et al. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  23. Dupont, M., Souriant, S., Lugo-Villarino, G., Maridonneau-Parini, I., Vérollet, C. Tunneling Nanotubes: Intimate Communication between Myeloid Cells. Front Immunol. 9, 43(2018).
  24. Gerdes, H. H., Rustom, A., Wang, X. Tunneling nanotubes, an emerging intercellular communication route in development. Mech Dev. 130 (6-8), 381-387 (2013).
  25. Sartori-Rupp, A., et al. Correlative cryo-electron microscopy reveals the structure of TNTs in neuronal cells. Nat Commun. 10 (1), 342(2019).
  26. Dagar, S., Pathak, D., Oza, H. V., Mylavarapu, S. V. S. Tunneling nanotubes and related structures: molecular mechanisms of formation and function. Biochem J. 478 (22), 3977-3998 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cocultuur van keratinocyten en fibroblastenf actinekleuringtarwekiemagglutinineconfocale microscopiemilde fixatieimmunokleuring van alfa tubulinecommunicatie tussen huidcellen

Gerelateerde artikelen