Therapeutische effecten van Gualou Guizhi Antispasmodische Granules op spasticiteit en PANoptose in een ratmodel van ruggenmergletsel

Samenvatting

Deze studie evalueert de effecten van Gualou Guizhi Antispasmodic Granules (GLGZ) op spasticiteit veroorzaakt door ruggenmergletsel (SCI) met behulp van gedrags-, biomechanische, beeldvormings- en histologische methoden en onderzoekt PANoptose-gerelateerde mechanismen.

Samenvatting

Spierspasticiteit na een ruggenmergletsel (SCI) heeft een ernstige invloed op de kwaliteit van leven, met beperkte effectieve behandelingen. Gualou Guizhi Antispasmodic Granules (GLGZ), een in het ziekenhuis ontwikkelde traditionele Chinese medicijnformulering (TCM), kan spasmen verlichten. Deze studie had als doel de effectiviteit van GLGZ bij SCI-geïnduceerde spasticiteit en de associatie met PANoptose (een nieuw geprogrammeerde celdood met apoptose, necroptose en pyroptose) te beoordelen.

Mannelijke Sprague-Dawley-ratten van 180-200 g werden gebruikt. SCI werd opgewekt via de Allen weight-drop methode. De succesvolle modelratten werden willekeurig toegewezen aan een modelgroep of een van de GLGZ-dosisgroepen: hoog, gemiddeld of laag. Schijnratten ondergingen een laminectomie zonder ruggenmergletsel. De interventies duurden 4 weken. Na de interventie werd de motorische functie van ledematen geëvalueerd met behulp van de Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) schaal. De stijfheid van de femorale spier werd beoordeeld met behulp van ultrageluids-shear wave elastografie (SWE), terwijl de integriteit van het ruggenmerg werd vastgesteld met magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). Hematoxyline-eosine (HE), Nissl en Luxol snelle blauwe kleuring werden uitgevoerd om histopathologische veranderingen te observeren. Multiplexe immunofluorescentiekleuring werd gebruikt om apoptose-geassocieerd speck-achtig eiwit te labelen met een CARD (ASC, groen), Caspase-8 (oranje) en receptor-interagerende serine/threonine-eiwitkinase 3 (RIPK3, geel) om PANoptosis te beoordelen.

GLGZ verbeterde de BBB-scores dosisafhankelijk per dosis: nep (21,00 ± 0,00), model (5,8 ± 1,1), hoge dosis (10,6 ± 1,3), middelmatige dosis (8,5 ± 1,2), lage dosis (7,1 ± 1,0). SWE toonde verminderde spierstijfheid: model (6,68 ± 0,74 m/s), hoge dosis (2,19 ± 0,36 m/s, P < 0,001), middelmatige dosis (3,04 ± 0,45 m/s, P = 0,002), lage dosis (4,08 ± 0,65 m/s, P = 0,031) versus model. In vergelijking met de modelgroep (3,65 ± 1,03 mm²) verminderde GLGZ dosisafhankelijk de grootte van de ruggenmergleesie in alle doseringsgroepen (alle P < 0,05), (1,33 ± 0,79 mm² in hoge doses, 1,94 ± 0,67 mm² in middeldosering, 2,50 ± 0,79 mm² in lage dosisgroep. Histologie toonde aan dat GLGZ geconserveerde neuronen en myelineherstel bevorderde. GLGZ-dosisafhankelijke verminderde ASC-, Caspase-8- en RIPK3-expressie.

Inleiding

Spierspasme is een veelvoorkomende complicatie van ruggenmergletsel (SCI) en heeft een ernstige invloed op de kwaliteit van leven van patiënten. Het pathologische proces omvat onder andere initiële mechanische beschadiging, secundaire ontsteking, oxidatieve stress, apoptose en verstoorde zenuwregeneratie. Huidige behandelingen (chirurgische decompressie, farmacotherapie, revalidatie) hebben beperkte effectiviteit, waarbij langdurige medicatie bijwerkingen veroorzaakt zoals medicijnresistentie³. Daarom is het onderzoeken van nieuwe mechanismen en behandelingen cruciaal.

Recente studies hebben PANoptosis, een geprogrammeerde celdood die apoptose (caspase-afhankelijk), necroptose (RIPK3/MLKL-afhankelijk) en pyroptose (caspase-8/GSDMD-afhankelijk)⁴ integreert als een belangrijk pathologisch mechanisme van secundaire schade bij SCI. Abnormale activatie van (ASC, caspase-8 en RIPK3) veroorzaakt neuronverlies en glialittekenvorming, wat spasticiteit^verergert. Het richten op PANoptosis is daarom een veelbelovende strategie geworden om de secundaire letselcascade⁴ van SCI te onderbreken.

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) heeft aandacht gekregen voor neurologische aandoeningen vanwege multi-target effecten (bijv. ontstekingsremmende, antioxidante ^stress). Gualou Guizhi antispasmodische granules (GLGZ) is afgeleid van Zhang Zhongjings Synopsis of the Golden Chamber en geoptimaliseerd als ziekenhuisvoorbereiding⁷. De componenten omvatten Trichosanthes kirilowii (Tianhuafen), Cinnamomum cassia (Guizhi), Paeonia lactiflora (Baishao), Glycyrrhiza uralensis (Gancao), jujube en gember⁸. Voorlopige studies hebben aangetoond dat GLGZ spasmen na letsel aan het centrale zenuwstelsel verlicht door neurotransmitters te reguleren en ontsteking⁹ te remmen. De effecten op SCI-geïnduceerde spasticiteit en mogelijke associatie met PANoptose blijven echter onduidelijk.

In tegenstelling tot conventionele single-target geneesmiddelen sluit de multicomponentennatuur van GLGZ aan bij het complexe pathologische netwerk van SCI – waarbij ze tegelijkertijd ontsteking, neuronale verlies, myelineschade en mogelijk PANoptose aanpakken. Deze studie stelt de hypothese dat GLGZ spierspasticiteit bij SCI-ratten verbetert door het bevorderen van het pathologische herstel van het ruggenmerg (ontsteking verminderen, neuronen behouden, myeline herstellen) en PANoptose remmen. Door deze hypothese te verifiëren, willen we experimenteel bewijs leveren voor GLGZ als veelbelovende therapie die symptoomverlichting en kernpathologische reparatie voor SCI integreert.

Protocol

Diermodellering
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Tweede Geaffilieerde Ziekenhuis van de Fujian Universiteit voor Traditionele Chinese Geneeskunde (Goedkeuringsnummer FJPSPH-IAEC2024114) en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenwelzijn. Mannelijke Sprague-Dawley-ratten van 180-200 g werden onder gecontroleerde omstandigheden gehuisvest bij 22-26°C en 40-70% luchtvochtigheid. SCI werd opgeroepen door de Allen weight-drop methode¹⁰: 3-4% isoflurane inhalatie-anesthesie, middenlijnincisie bij T10, blootstelling van T9-T11 segmenten, laminectomie (dura mater intact) en impact (2 mm tip, 0,5 m/s snelheid, 1,3 mm diepte, 1 s duur). Nepratten ondergingen een laminectomie zonder impact. Inclusiecriteria: BBB-score < 8 na 24 uur na de operatie; Exclusiecriteria: infectie, doorsnijding van het ruggenmerg. Postoperatieve zorg: analgesie (buprenorfine, 0,1 mg/kg s.c., elke 12 uur gedurende 3 dagen), blaasexpressie (elke 6 uur gedurende 1 week) en steriele wondverzorging. De succesvolle modelratten werden willekeurig toegewezen aan een modelgroep, en hoge- (2,32 g/kg, n = 10), medium- (1,16 g/kg, n = 10), lage dosis (0,58 g/kg, n = 10) GLGZ-groepen.

Motorische functieanalyse
De score van Basso, Beattie en Bresnahan (BBB) werd blind uitgevoerd. De ratten werden 5 minuten in een open veld geobserveerd, waarbij ze de beweging van de achterpootgewrichten, het dragen van gewicht, het lopen en de coördinatie opleverden.

Schuifgolfelastografie voor het meten van stijfheid rectus femoris
Er werd een Doppler-echosysteem met een lineaire array-probe (18L6) gebruikt. Ratten werden in laterale ligpositie geplaatst (spierontspanning). SWE werd uitgevoerd met de sonde onder een hoek van 90° ten opzichte van de spier, op een diepte van 1-2 cm. Het interessegebied (ROI) werd ingesteld op 0,5 × 0,5 cm, en er werden tien frames per meting verkregen. De uiteindelijke stijfheidswaarde vertegenwoordigde het gemiddelde van drie geldige metingen. Schuifgolfsnelheid (SWV) werd geregistreerd; Groene kwaliteitscontrole gaf geldige beelden^{aan 11}.

MRI-onderzoek
MRI werd uitgevoerd met een 7,0T-scanner met een T2-gewogen vetgedempte sequentie en een dierspecifieke spiraal. Acquisitieparameters waren als volgt: herhalingstijd (TR) 3.800 ms, echotijd (TE) 72 ms, sneeddikte 1 mm, voxelgrootte 0,1 × 0,1 × 1 mm, matrix 256 × 256, gezichtsveld (FOV) 25,6 × 25,6 mm, vier signaalgemiddelden en ademhalingsgating. Het laesiegebied werd gemeten met beeldverwerkingssoftware.

Histologische kleuring
HE-kleuring werd uitgevoerd door sequentiële deparaffinisatie, rehydratatie, hematoxyline-kleuring van 5 minuten, spoelen in stromend water, differentiatie in 1% zoutzuur-ethanol gedurende 30 seconden, eosinekleuring van 2 minuten, dehydratatie, clearing en mounting. Als visueel controlepunt toonden gekleurde secties blauwe kernen en rood cytoplasma.

Nissl-kleuring werd uitgevoerd door deparaffinisatie, rehydratatie, incubatie in 0,1% toluidineblauw bij 50-60 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door spoelen met gedestilleerd water, ethanoldifferentiatie, dehydratatie, clearing en mounting. Als visueel controlepunt werden donkerblauwe Nissl-carrosserieën duidelijk waargenomen in de schijngroep.

Luxol snelle blauw-cresyl violet kleuring werd uitgevoerd door deparaffinisatie, rehydratatie, incubatie in Luxol fast blue bij 60 °C gedurende 2 uur, spoelen met 95% ethanol, differentiatie in lithiumcarbonaat gedurende 30 seconden, gevolgd door 70% ethanoldifferentiatie, cresyl violet tegenkleuring gedurende 10 minuten, dehydratatie, clearen en mounten. De werkconcentratie van cresylviooltjes was 0,1%. Als visueel controlepunt werd donkerblauwe myeline waargenomen in de schijngroep.

Multiplexe immunofluorescentiekleuring werd uitgevoerd, beginnend met deparaffinisatie, rehydratatie en antigeenterugwinning met behulp van een citraatbuffer (pH 6,0) bij 95 °C gedurende 20 minuten. Secties werden 10 minuten behandeld met 3% waterstofperoxide, gevolgd door blokkering met 5% BSA bij 37 °C gedurende 1 uur. Primaire antilichamen werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C (ASC: 1:500; Caspase-8: 1:400; RIPK3: 1:500). Na het wassen met PBS-T (0,1% Tween-20, 3 x 5 min) werden secties geïncubeerd met HRP-gelabelde secundaire antilichamen (1:1000) bij 37 °C gedurende 1 uur. Fluorochroom-labeling werd vervolgens toegepast: YTR520 Plus voor ASC, TYR570 Plus voor Caspase8, en TYR690 Plus voor RIPK3 (30 min), gevolgd door DAPI nucleaire kleuring voor 5 minuten. Er werden dia's gemonteerd en beeldvorming werd uitgevoerd met een fluorescentiemicroscoop ingesteld op 500 ms belichting, versterking 1,0, vergroting ×200, waarbij filtersets overeenkwamen met de respectievelijke fluorochromen.

Voor xyleen en ethanol werden alle bewerkingen uitgevoerd in een dampkap, en werden handschoenen en bril gedragen tijdens gebruik. Voor kleurstoffenreagentia werd direct huidcontact strikt vermeden. Alle afvalreagentia werden gestort in aangewezen containers voor gevaarlijk afval. Voor biohazardmaterialen werd een grondige sterilisatie van de autoclaaf uitgevoerd voorafgaand aan de uiteindelijke verwijdering om mogelijke biologische besmetting te voorkomen.

Statistische analyse
Eenrichtings-ANOVA met LSD post-hoc test werd gebruikt voor groepsvergelijkingen. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

BBB-score
De BBB-score van de schijngroep was 21,00 ± 0,00, significant hoger dan die van het model (5,8 ± 1,1, P < 0,001). GLGZ-dosisafhankelijke verhoogde BBB-scores: hoge dosis (10,6 ± 1,3, P < 0,001), middelmatige dosis (8,5 ± 1,2, P = 0,003), lage dosis (7,1 ± 1,0, P = 0,028) versus model (Figuur 1).

Schuifgolf-elastografie-analyse van rectus femoris stijfheid
Schuifgolfelastografie (SW...

Discussie

Deze studie evalueerde systematisch de verbeterende effecten van GLGZ op spierspasticiteit bij ratten met SCI en onderzocht de relatie met neuroprotectie en PANoptose. De resultaten gaven aan dat GLGZ de BBB-scores kon verbeteren en spierstijfheid bij SCI-ratten op dosisafhankelijke wijze kon verminderen. De studie vond ook dat het werkingsmechanisme van GLGZ mogelijk verband houdt met neuroprotectie, myelineherstel en remming van PANoptosis. Momenteel verlichten klinische farmacologisch...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anhydrous ethanol	240403A1		Dehydratie
Anhydrous ethanol	241101A1		Kleuren
Antifluorescente verzwakte filmcoatingagent (met DAPI)	MA0221		Immunofluorescencekleuring
ASC Antilichaam	Bs-6741R		PANoptoseanalyse (1:300)
Caspase-8 Antilichaam	13423-1-AP		PANoptoseanalyse (1:400)
Fluorescentiemicroscoop	NIKON		ECLIPSECi-L
Volautomatische digitale glazen diascanner	GCell-60		Diascanner
Hematoxyline-Eosinekit	R23718		Hematoxyline-Eosine (HE) Kleuring
Beeldanalysesoftware	NIH		ImageJ 1.53k
Luxol Fast Blue	R23193		Luxol Fast Blue-Cresyl Violet Kleuring
MRI-scanner	Bruker		7.0T
Meervoudige fluorescentiekleuringskit	240522		Immunofluorescencekleuring
Myeloïde kleuringskit	G3245		Myeloïde kleuring
Neutrale  balsem	MB9899		Montage na kleuring
Nissl kleuringskit	R23093		Nisslkleuring
RIPK3 Antilichaam	Bs-3551R		PANoptoseanalyse (1:400)
SPSS 22.0			statistisch analysesoftware
Sprague-Dawley-ratten	Hangyi Biotechnology bedrijf in Fuzhou
Wijnsteenzuur, natriumtripolyfosfaat	10019418		Kleuren
Ultrasoundsysteem	SIEMENS Acuson		Lineaire array sonde (18L6)
XYleen	240904A2		Kleuren