Dit experimentele protocol biedt een stabiele, kosteneffectieve en efficiënte methode die lncRNA-knockdown combineert met kolonievormende assays om het effect van lncRNA op de proliferatie van osteosarcoomcellen te kwantificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kolonievormingstest Detecteer de proliferatieve capaciteit van LncRNA-knockdown osteosarcoomcellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Abnormale expressie van lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) beïnvloedt de cellulaire proliferatie van osteosarcoomcellen diepgaand, wat suggereert dat ze mogelijk als therapeutische doelwitten dienen. Functionele studies van lncRNA's blijven echter grotendeels theoretisch en beperkt tot enkele validaties. Kolonievormingsassays, die specifiek het uiteindelijke proliferatieve lot van enkelcellige cellen weerspiegelen, worden beschouwd als de gouden standaard voor het evalueren van het langetermijnproliferatieve potentieel. Hier stelde dit protocol een betrouwbaar experimenteel protocol op met behulp van kolonievormingsassays in lncRNA-knockdowncellen om het effect van lncRNA op de proliferatieve capaciteit van osteosarcoomcellen te evalueren. Dit experimentele protocol biedt een stabiele, kosteneffectieve en efficiënte assay om de regulerende effecten van lncRNA op de proliferatie van osteosarcoomcellen te beoordelen. Deze benadering is niet alleen geschikt voor onderzoek naar osteosarcoomcellen, maar dient ook als een haalbaar hulpmiddel voor de door lncRNA gereguleerde celproliferatieve capaciteit in andere tumoren. Deze studie omvatte een gedetailleerd detectieprotocol van lncRNA-knockdown en kolonievormingsassays, met een voorbeeld van de small nucleolair RNA host gene 6 (SNHG6) knockdown in osteosarcoomcellen (143B). Experimentele resultaten bevestigden efficiënte onderdrukking van SNHG6-expressie, vergezeld van een duidelijke vermindering van zowel het aantal als de grootte van kolonies. Deze bevindingen suggereren dat SNHG6 essentieel is voor het in stand houden van het langetermijnproliferatieve potentieel van osteosarcoomcellen (143B).
Inleiding
Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's), gedefinieerd als transcripten langer dan 200 nucleotiden zonder eiwitcoderend potentieel, zijn de afgelopen jaren uitgegroeid tot belangrijke regulatoren van diverse biologische processen 1,2. Ze spelen een cruciale rol bij het ontstaan en ontwikkelen van verschillende kankers, waaronder osteosarcoom, prostaatkanker en longkanker 3,4,5. Bij osteosarcoom suggereert opstapelend bewijs dat abnormale long non-coding RNA (lncRNA) expressie een diepgaande invloed heeft op cellulaire proliferatie. Zo onderdrukte het dempen van lncRNA POU3F3 de proliferatie significant en bevorderde het de apoptose van osteosarcoomcellen (MG63 en U2OS)6. Evenzo verminderde het neerslaan van lncRNA HOXA-AS3 de kolonievorming en remde het de groei van U2OS- en SW1353-cellen7. Aangezien ongecontroleerde proliferatie een kenmerk is van de kankerbiologie en een belangrijke bepalende factor voor therapeutische strategieën, blijft het ophelderen van door lncRNA gereguleerde celproliferatie in tumoren, met name bij osteosarcoom, van groot belang en noodzakelijkheid.
Hoewel er verschillende benaderingen bestaan om celproliferatie te evalueren, kent elk inherente beperkingen. Colorimetrische of metabole assays, zoals CCK-8 en MTT, zijn handig, snel en hebben een hoge doorvoersnelheid. Ze leveren echter vooral kortetermijnuitlezingen en worden gemakkelijk verstoord door metabole fluctuaties, en brengen extra risico's met zich mee op optische of fotochemische interferentie doorde gebruikte reagentia. Methoden gebaseerd op DNA-synthese, waaronder BrdU en EdU-integratie, bieden een grotere specificiteit terwijl ze zich beperken tot snapshotanalyses van S-fase entry zonder langetermijnproliferatieve uitkomstente weerspiegelen 9,10. Evenzo geeft immunokleuring voor proliferatiemarkers, zoals Ki-67, alleen directe celcyclusactiviteit aan en voorspelt het clonogene capaciteit10 niet. Realtime monitoringsystemen, zoals RTCA, maken continue groeicurveanalyse met hoge reproduceerbaarheid mogelijk, maar hun hoge kosten en beperking tot korte- of middellange termijn beoordeling verminderen hun praktischheidmet 11. Daarentegen vangt de clonogene test uniek het vermogen van een enkele cel om onbeperkte proliferatie te ondergaan en zichtbare kolonies te vormen, waarmee het uiteindelijke lot direct wordt weerspiegeld. Ondanks dat de clonogene assay arbeidsintensief en tijdrovend is, blijft het de gouden standaard voor het beoordelen van het langetermijnproliferatiepotentieel, en biedt het inzichten die niet bereikbaar zijn voor kortetermijn- of vervangingsassays12.
Hier bevat dit artikel een gedetailleerd detectieprotocol voor lncRNA-knockdown en kolonievormingsassays, met een voorbeeld van SNHG6-knockdown in 143B osteosarcoomcellen. Deze benadering is niet alleen toepasbaar op osteosarcoomonderzoek, maar dient ook als een haalbaar hulpmiddel om lncRNA-gemedieerde proliferatie in andere tumoren te onderzoeken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Plasmidetransfectie
- Zaad 5 × 105 143B-cellen per 10 cm kweekschotel (totaal twee schalen), kweek de cellen in een volledig medium (DMEM + 10% FBS) bij 37 °C in een 5% CO2-incubator.
- Bereid transfectie-reagentia 24 uur later voor, inclusief plasmiden (shNC en shSNHG6), PEI en Opti-MEM.
OPMERKING: Vortex en zorg dat alles voor gebruik in evenwicht is op kamertemperatuur. - Haal vier microcentrifugebuizen van 1,5 mL eruit, label de plasmiden (shNC en shSNHG6) en PEI (twee buizen) met een markerpen.
- Voeg 500 μL Opti-MEM toe aan elke buis.
- Voeg 10 μg plasmiden toe aan de plasmidebuis (shNC of shSNHG6) en 30 μL PEI (1μg/μL) aan elke PEI-buis.
- Meng voorzichtig omhoog en omlaag, en laat het 5 minuten op kamertemperatuur incuberen.
- Combineer de plasmidebuis en de PEI-buis, meng voorzichtig en incubeer het mengsel op kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Haal 143B-cellen uit de incubator en aspireer voorzichtig het kweekmedium. Voeg 7 ml serumvrij medium toe aan elk gerecht. Label de schalen om aan te geven welke plasmiden toegevoegd moeten worden (143B shNC of 143B shSNHG6).
- Voeg het voorbereide transfectiemengsel druppelwijs toe aan het bijbehorende kweekgerecht.
OPMERKING: Voeg het mengsel langzaam toe, met een pipet in een cirkelvormige beweging, en doseer het gelijkmatig vanaf de buitenrand richting het midden van het gerecht. Incubeer bij 37 °C in een broedmachine met 5%CO2. - Gooi het supernatant 8-12 uur later weg en voeg 10 mL complete DMEM-medium toe aan elke 10 cm kweekschaal. Incubeer de cellen bij 37 °C in een co-2-incubator van 5%.
- Observeer onder een fluorescentiemicroscoop op 72 uur nadat de supernatant is afgestoten en vervangen door een volledig DMEM-medium.
2. Kolonievormingstest
- Verwijder het medium uit de 10 cm kweekschaal (shNC en shSNHG6), voeg 1,5 mL trypsins-EDTA toe om de cellen te verteren, pipetteer voorzichtig om ze los te maken, en voeg vervolgens 5 mL volledig medium toe om de vertering te beëindigen.
- Breng de celsuspensie over in een 15 mL microcentrifugebuis.
- Haal 20 μL celsuspensie weg en tel de celnummers.
OPMERKING: De celtelling moet meerdere keren worden uitgevoerd om te garanderen dat de celnummers in de shNC-groep en de shSNHG6-groep consistent zijn. Hier verzamelen we 3 × 105 cellen voor RT-PCR-verificatie van de SNHG6 knockdown-efficiëntie. - Zaad 2 × 103 cellen per put in een 6-put plaat. Voeg het volledige DMEM-medium toe aan een eindvolume van 2 mL en kweek de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator.
OPMERKING: Vervang het medium om de dag door een nieuw volledig DMEM-medium. - Monitor dagelijks de vorming van kolonies.
OPMERKING: Beëindig de kweek wanneer de meeste kolonies in de controlegroep (shNC) ≥50 cellen bevatten, of na 10-14 dagen incubatie, afhankelijk van wat het eerst komt. - Haal cellen uit de broedmachine en gooi het supernatant weg.
- Was cellen twee keer met 1 ml PBS per put, en gooi de PBS na elke wasbeurt weg.
- Fixeer cellen met 1 ml 10% formalineoplossing gedurende 15 minuten, en gooi daarna de 10% formalineoplossing weg.
- Was cellen twee keer met 1 ml PBS per put, en gooi de PBS na elke wasbeurt weg.
- Kleur cellen met 1 ml 0,5% kristalviolette kleuringsoplossing gedurende 10-30 minuten, en gooi daarna de kleuroplossing weg.
- Was cellen voorzichtig met langzaam stromend kraanwater.
- Luchtdroog cellen op kamertemperatuur.
- Maak beelden met een camera.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om het effect van lncRNA SNHG6 op de proliferatieve capaciteit van osteosarcoomcellen te evalueren, hebben we met succes een plasmide-gemedieerd knockdownsysteem opgezet en kolonievormingsassays uitgevoerd. De experimentele workflow omvatte plasmidetransfectie van 143B-cellen en kolonievormingsassay (Figuur 1).
De transfectie-efficiëntie van 143B-cellen werd bevestigd door fluorescentiemicroscopie 72 uur na transfectie (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het therapeutisch richten op kanker-geassocieerde lncRNA's, naast het benutten van hun diagnostische buit als biomarkers, vertegenwoordigt een opkomende benadering in kankerbeheer. Het definiëren van de rollen van lncRNA's in de pathogenese van osteosarcoom is cruciaal voor het bevorderen van diagnose, therapie en prognose.
Kritieke stappen moeten worden gevolgd om het succes van deze test te waarborgen. Ten eerste is het vaststellen van een single-cell suspen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Nature Science Foundation (82174408, 82374477, 82474535 en 82205145).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL MICROTUBES | Merck | AXYMCT150C | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VICTREX | 5205000 | |
| 100 - 1000 μL Extended Graduated Blue Tips | Shanghai BioScience Co., Ltd | BS10401ML | |
| 100mm Cell Culture Dishes laboratory | Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd | 704001 | |
| 143B | ATCC | ATCC CRL-8303TM | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Shanghai BioScience Co., Ltd | BL2002150 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Wuxi NEST Biotechnology Co.,Ltd | 703001 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd. | 300583057 | |
| Crystal Violet | TCI Shanghai | C0428 | |
| DMEM medium | WISENT CORPORATION | 319-005-CL | |
| Eppendorf Research plus | Eppendorf | 3123000233 | |
| FBS - Superior quality | WISENT CORPORATION | 086-150 | |
| Mark pen | Zebra Trading (Shenzhen) Co.,Ltd. | YYST5 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | |
| PASTEUR PIPETTE | Labgic | BS-XG-O3L | |
| PBS buffer (dry powder) | Labgic | BL601A | |
| PEI | Polysciences | 24765 | |
| Pipette tips | Merck | AXYT200Y | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
| Trypsin/EDTA | Gibco | R001100 |
Referenties
- Chen, N., et al. IAV inhibits the host antiviral defense mediated by LncRNA-LRIR to enhance viral replication. Int J Biol Macromol. 322 (Pt 1), 146665(2025).
- Zhu, J., Mo, Y. Y., Peng, W. X. RNA binding protein-mediated competing endogenous RNA mechanism in cancer. Gene. 963, 149606(2025).
- Zhang, Y., et al. KIAA1429-mediated ZFPM2-AS1 m(6)A modification promotes the proliferation, migration and invasion of osteosarcoma cells. Oncol Lett. 30 (4), 453(2025).
- Oh, M., Kadam, R. N., Charania, Z. S., Somarowthu, S. LncRNA SChLAP1 promotes cancer cell proliferation and invasion via its distinct structural domains and conserved regions. J Mol Biol. 437 (19), 169350(2025).
- Wang, G., et al. TBX5-AS1 induces ER stress and suppresses lung cancer growth and tumor stemness via the miR-494-3p/ATF6 axis. Cell Stress Chaperones. 30 (6), 100113(2025).
- Xu, S., et al. lncRNA POU3F3 promotes osteosarcoma progression through GPX4-modulated ferroptosis by interaction with IGF2BP2 to facilitate NRF2 mRNA stability. Genes Dis. 12 (5), 101439(2025).
- Li, R., et al. LncRNA HOXA-AS3 promotes cell proliferation and invasion via targeting miR-218-5p/FOXP1 axis in osteosarcoma. Sci Rep. 14 (1), 16581(2024).
- Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, Limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. Int J Mol Sci. 22 (23), (2021).
- Harris, L., Zalucki, O., Piper, M. BrdU/EdU dual labeling to determine the cell-cycle dynamics of defined cellular subpopulations. J Mol Histol. 49 (3), 229-234 (2018).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. J Invest Dermatol. 136 (1), e1-e7 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicol Rep. 7, 335-344 (2020).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat Protoc. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Brix, N., Samaga, D., Belka, C., Zitzelsberger, H., Lauber, K. Analysis of clonogenic growth in vitro. Nat Protoc. 16 (11), 4963-4991 (2021).
- Rajendran, V., Jain, M. V. In vitro tumorigenic assay: Colony forming assay for cancer stem cells. Methods Mol Biol. 1692, 89-95 (2018).
- Guzman, C., Bagga, M., Kaur, A., Westermarck, J., Abankwa, D. ColonyArea: An ImageJ plugin to automatically quantify colony formation in clonogenic assays. PLoS One. 9 (3), e92444(2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
