Polyacrylamide ZrOH hydrogels voor ruimtelijk opgeloste bemonstering van carboxylaten die afkomstig zijn van wortels die in de bodem groeien

Summary

In dit protocol beschrijven we het gebruik van polyacrylamide zirkoniumhydroxide hydrogels (ZrOH-hydrogels) als een niet-destructieve, in-situ methode voor het bemonsteren van wortel-exudeerde carboxylaten uit intacte, in de grond gekweekte wortels in verschillende ontwikkelingsstadia van gewassen. Het beschrijft ook de daaropvolgende gelokaliseerde mapping en kwantificering van deze carboxylaten met behulp van Ion Chromatography-Mass Spectrometry (IC-MS).

Abstract

Bemonstering en betrouwbare kwantificering van wortelexsudaten uit ongestoorde, in de grond gekweekte plantenwortels blijven uitdagend. We hebben verder een niet-destructieve methode ontwikkeld voor het bemonsteren, 2D-mapping en kwantificeren van zeven carboxylaten (aconitaat, citrat, fumaraat, lactaat, malaat, oxalaat, succinaat) die afkomstig zijn van in rhizoboxen gekweekte plantenwortels. De hier beschreven methode maakt gebruik van polyacrylamide, zirkoniumhydroxidehydroxide hydrogels (ZrOH-hydrogels) die alle geteste carboxylaten opnemen en geëlueerd kunnen worden met een efficiëntie variërend van 95,3% ± 3,12% tot 111% ± 1,99%. De ZrOH-hydrogels hebben een hoge bindingscapaciteit voor carboxylaten, tot 1,82 μmol ^cm-2, afhankelijk van de pH van de oplossing en carboxylaat-varianten, een concentratie die hoger is dan die normaal gesproken in de rhizosfeer. Bovendien blijven de gebonden carboxylaten op de ZrOH-hydrogels stabiel en kunnen ze enkele weken worden opgeslagen bij 4 °C voordat ze worden geanalyseerd. Voor de toepassing worden planten gekweekt in met aarde gevulde rhizoboxen die gemakkelijke toegang bieden met minimale verstoring van het wortelstelsel. Om wortelvrijgegeven carboxylaten te bemonsteren, worden ZrOH-hydrogels zorgvuldig 24 uur op het interessegebied aangebracht. Na het terugwinnen van de ZrOH-hydrogels worden ze gesneden voor kaartdoeleinden en worden de gelstukken geëlueerd voor latere carboxylaatanalyse (bijvoorbeeld via ionenchromatografie-massaspectrometrie). Onze bevindingen geven aan dat ZrOH-hydrogels effectief zijn voor het vastleggen en bepalen van carboxylaatconcentraties in de rhizosfeer. De nieuwigheid van deze methode ligt in het vermogen om wortelexsudate te bemonsteren van intacte, in de grond gekweekte plantenwortels, evenals de mogelijkheid van tijdsafhandelende bemonstering, vergeleken met traditionele methoden (bodem-hydroponische hybride benadering) die vaak destructief zijn en slechts eenmalige bemonstering toestaan. Het belangrijkste is dat het de generatie van kwantitatieve, hoogresolutie, millimeterschaal 2D-beelden mogelijk maakt, waardoor de visualisatie van carboxylaatexudatie langs de wortelas en de ruimtelijke verspreiding binnen de rhizosfeer mogelijk wordt. Daarnaast vergemakkelijkt deze methode het bemonsteren van wortelexsudaten in verschillende groeistadia tijdens de groeicyclus.

Introduction

Plantenwortels scheiden verschillende verbindingen uit in de rhizosfeer, waardoor hun fysische, chemische en biologische eigenschappen worden gevormd¹. Wanneer planten worden blootgesteld aan abiotische en biotische stressomstandigheden, wordt wortelexsudas bijzonder getriggerd. Wortelexsudaten kunnen in feite de beschikbaarheid en mobilisatie van voedingsstoffen/metaal, microbiële gemeenschappen en activiteit, de stabiliteit van de bodemaggregaat en de verdediging van planten tegen pathogenen direct of indirect^{beïnvloeden 1,2,3}. Tot de belangrijkste wortelexsudaten behoren carboxylaten vanwege hun rol in nutriëntenoplosbaarheid (waaronder fosfor (P), ijzer (Fe), koper (Cu) en zink (Zn)), zware metalen tolerantie en versterking van nuttige micro-organismen in de rhizosfeer 2,3,4,5.

Opmerkelijk zijn dat geëstimitteerde carboxylaten citrat, lactaat, oxalaat, malaat, succinaat en fumaraat ^6,7,8 omvatten. Citraat speelt bijvoorbeeld een essentiële rol bij P-opname door P-gebonden P gebonden aan Fe of aluminium (Al) (hydr)oxiden ^7,9 te mobiliseren. Het nauwkeurig bemonsteren en kwantificeren van wortelexsudat van bodemgekweekte planten blijft echter een experimentele uitdaging, vooral vanwege de moeilijkheid om fysieke toegang te krijgen tot ongestoorde bodemgekweekte wortelsystemen en om wortelexsudaat ^{monsters 10,11} te verkrijgen. Daarnaast ondergaan uitgescheiden verbindingen snel microbiële afbraak (binnen minuten tot uren)¹² en adsorberen ze sterk aan bodemmineraaloppervlakken ^1,10. Een verdere uitdaging bij wortelexsudaties is het monitoren van exsude over tijd, aangezien de meeste verzamelmethoden wortels verstoren of het oogsten van in aarde geteelde planten vereisen, waardoor het moeilijk is om dezelfde wortel opnieuw te beoordelen ^1,11. Daarom vereisen nauwkeurige bemonstering, kwantificering en monitoring van wortelexsudaten een techniek die ruimtelijke variatie vastlegt en herhaalde bemonstering tijdens plantgroei faciliteert¹¹.

In de huidige studie presenteren we een niet-destructieve, in-situ methode die aanvankelijk voor citraat werd ontwikkeld door Tiziani et ^al.12, en die nu verder is verfijnd en toegepast voor bemonstering, precieze ruimtelijke lokalisatie en kwantificatie van zes extra carboxylaten (aconitaat, fumaraat, lactaat, malaat, oxalaat en succinaat) die afkomstig zijn van intacte plantwortels die in de grond in rhizozen zijn gekweekt. De methode maakt gebruik van zirkoniumhydroxide-gebaseerde polyacrylamide hydrogels (ZrOH-hydrogels) voor het bemonsteren van wortelexsudaten¹³. ZrOH-hydrogels vertonen een sterk bindvermogen voor anionen (inclusief carboxylaten) die gemakkelijk kunnen worden geëlueerd^12,13,14. De ZrOH-hydrogels (1) maken het mogelijk om wortelcarboxylaten te bemonsteren uit in de grond gekweekte plantenwortels door simpelweg de hydrogel met minimale verstoring op het wortelstelsel te plaatsen, (2) bieden effectieve bescherming van gebonden carboxylaten tegen microbiële mineralisatie gedurende minstens 6 weken, (3) de ruimtelijke verdeling van carboxylaten in de rhizosfeer wordt behouden bij binding aan de gel, en (4) maken mm-schaal 2D-mapping van carboxylaten¹² mogelijk.

Bestaande methoden voor het bemonsteren van wortelexsudaten worden ingedeeld als bodemgebaseerde technieken van in de grond geteelde planten (d.w.z. wortelwassen of bodem-hydroponisch hybride, bodem-wortel exsudate collector (SOIL-REC) apparaten, microzuignapjes, filterpapier/agarvellen, exudatievallen en de RHIZOtest-techniek) of hydroponische exsudaatmonsters. Wortelwassen of bodem-hydroponische hybride methode houdt in dat de hele plant zorgvuldig uit de grond wordt verwijderd, het wortelstelsel wordt gewassen en vervolgens in de bemonsteringsoplossing wordt ondergedompeld om wortel¹⁵ te verzamelen. Het is de meest gebruikte methode om exsudas van bodemplanten te bemonsteren vanwege de eenvoud. Het verwijderen van de wortels uit de grond brengt echter het risico met zich mee dat wortelharen en fijnere wortels verloren gaan. Bovendien is grondige reiniging van de wortels vereist, wat de wortels kan beschadigen, de kwaliteit en hoeveelheid wortelexsudaten kan aantasten en tijdsopgeloste bemonstering ^{8,11 kan} uitsluiten. De SOIL-REC-methode houdt in dat planten worden gekweekt in een speciaal ontworpen rhizoboxsysteem waarbij wortels groeien tussen twee poreuze nylonmeshes (≤ 30 μm) en wortelexsudaten verzamelen met een wortelexsudatverzameltool^16,17. Deze aanpak behoudt het wortelstelsel, minimaliseert bodemvervuiling en maakt herhaalde verzameling van wortelexsudaten mogelijk. Het heeft echter een ingewikkelde opzet (met slechts weinig replicates), een hogere verdunning van exsudaten uit grotere volumes die voor sampling worden gebruikt, en vereist nog steeds optimalisatie, omdat de replicabiliteit uitdagend is en er grote variaties zijn tussen replicates⁸.

Het aanbrengen van kleine stukjes harsen, agargelvellen of filterpapier dat in balans kan komen met de omliggende oplossing of adsorberend exsudas op de wortelsegmenten van belang van toegankelijke, intacte bodemwortels (d.w.z. met behulp van rhizofboxen of wortelvensters)^18,19. Deze methode maakt tijdsresoluze bemonstering en gedeeltelijke meting van lokale exsudatesamenstelling mogelijk, zij het met lage ruimtelijke resolutie. Aan de andere kant is het vatbaar voor artefacten door microbiële mineralisatie en omslachtig om te hanteren. Evenzo worden exsudatvallen gebruikt om wortelexsudaten uit individuele wortelsegmenten te bemonsteren, waarbij een enkele wortel wordt gevangen in horizontale zijkamers, met afgesloten perspeksringen die de bemonsteringsoplossing bevatten, die^{lokaal 8 zijn} geplaatst. De methode is toepasbaar op zowel hydroponische als bodemgekweekte wortels en maakt lokale bemonstering^{mogelijk 12}. Er worden echter lage volumes verzameld, tijdsafscheid nemen is bijna onmogelijk en is het isoleren van individuele wortels gevoelig voor mechanische stress, wat het wortelmetabolisme en de uitscheiding^kan beïnvloeden 8. Microzuigkoppen worden gebruikt om bodemoplossing in de rhizosfeer te verzamelen, waardoor in-situ bemonstering mogelijk is van in de grond gekweekte wortels²⁰. Er worden echter kleine hoeveelheden verzameld, de bemonstering is gedeeltelijk tijdsgeresoleerd en de exsudaten zijn gevoelig voor adsorptie en microbiële afbraak¹⁶. De RHIZOtest-techniek houdt in dat wortels hydroponisch worden gekweekt in kleine cilinders waarbij de bodem wordt bedekt met een nylon mesh van 30 μm^{, waarna} ze worden overgebracht naar een bodemschijf, waardoor opgeloste stoffen tussen wortel en bodem^{mogelijk zijn}. De exsudaten worden verzameld door de wortelmat onder te dompelen in een monsteroplossing. Deze methode onderhoudt contact met wortels en bodem, maar maakt gebruik van kunstmatige groeiomstandigheden. Het is beperkt tot kortetermijnexperimenten en heeft geen tijdsafsluitende bemonstering. Van deze methoden kunnen alleen harsen, agargelvellen, filterpapier, exudatievallen en microzuigkoppen worden gebruikt om ruimtelijke exsudatiepatronen te bepalen.

Hydroponische exsudate-monstermethoden omvatten hydroponica en semi-hydroponische technieken. Hydroponica is een veelgebruikte en eenvoudige methode om wortelexsudaten te verzamelen, waarbij planten worden gekweekt in een voedingsoplossing, die vervolgens wordt vervangen door een bemonsteringsoplossing (H₂O, CaSO₄, CaCl₂, micropur) om exsudaatmonsters^15,23 te verkrijgen. De methode is eenvoudig en legt minimale mechanische spanning op de wortels. Het is zeer reproduceerbaar en indien nodig steriel, wat de kwaliteit van wortelexsudaten verhoogt en tijdsresolutie^{bemonstering mogelijk maakt 5,16}. Desalniettemin is het een sterk kunstmatig systeem dat de fysiologie van planten, morfologie (bijv. wortelhaarontwikkeling) en wortelexsudatieprocessen^kan veranderen ^6,15. In semi-hydroponics worden planten gekweekt op glasparels, zand of vermiculiet met een continu percolerende voedingsoplossing, en de exsudaten worden verzameld in de percolatieoplossing ^8,18. Deze benadering is iets minder kunstmatig vergeleken met hydrocultuur en maakt tijdsafsluitende bemonstering mogelijk. Het systeem is echter bijna volledig verzadigd met water en vereist daarom planten die bestand zijn tegen gedeeltelijk anaerobe omstandigheden.

In vergelijking met alternatieve benaderingen biedt de ZrOH-hydrogelmethode verschillende voordelen. ZrOH-hydrogels maken het mogelijk om wortelexsudaten in bodemcultuur (dicht bij natuurlijke omstandigheden) te bemonsteren met minimale verstoring van het wortelstelsel, tijdsgebonden bemonstering tijdens de levenscyclus van de plant, en het verzamelen van wortelexsudaten gedurende meer dan 24 uur is mogelijk vanwege verminderde microbiële afbraak en een hoge carboxylaatbindingscapaciteit^{van 12}. Bovendien is er geen biocide (bijv. micropur, NaN₃) nodig om de hydrogels te bemonsteren/conserveren, die op de lange termijn een potentieel effect hebben op het analyseinstrument en de chemische analyse verstoren. Dit komt doordat de carboxylaten chemisch gebonden zijn aan de ZrOH-hydrogel. Bovendien kunnen de monsters enkele weken tot maanden worden opgeslagen vóór de analyse, en kunnen daardoor veel monsters worden verzameld uit één experimentele opstelling¹², wat mogelijk wordt toegeschreven aan de antimicrobiële eigenschappen van de Zr in de hydrogel ^24,25. Daarnaast maken ZrOH-hydrogels 2D-millimeterresolutiemapping mogelijk van geëstudeerde verbindingen en andere anionen in de rhizosfeer, met de mogelijkheid om het gehele wortelstelsel te bemonsteren 12,14,26. ZrOH-hydrogels nemen minder opslagruimte in de koelkast in (4 °C) in vergelijking met de grote volumes die klassieke methoden vereisen, die doorgaans in de vriezer worden opgeslagen (-20 °C). De belangrijkste beperking is het wennen aan het produceren van hoogwaardige ZrOH-hydrogels met minimale of geen luchtbellen, evenals het feit dat rhizoboxen kunstmatige kweekomgevingssystemen blijven. Een andere beperking is dat de methode slechts is ontwikkeld voor zeven carboxylaten (aconitaat, citrat, fumaraat, lactaat, malaat, succinaat en oxalaat)¹², sulfonamiden (sulfadiazine, sulfamethazine, sulfachloropyridazine en clindamycine)²⁷, en anorganische anionen (sulfiden en oxyanionen van P, V-vanadium, as-arseen, se-selenium, mo-molybdeen, Sb-antimoon)14,26,28,29. De ZrOH-hydrogel is ook gebruikt in combinatie met een suspente deeltjesreagens – iminodiacetinzuur – voor in-situ bemonstering en mapping van kationen (Al, Fe, Ca-calcium, Mg-magnesium, Mn-mangaan, Ni-nikkel en Zn-Zinc) in de rhizosfeer 28,29,30.

Hier bieden we een ZrOH-hydrogel-gebaseerde methode om tijd- en ruimtelijk opgeloste, in-situ bemonstering van carboxylaten uit in de grond gekweekte wortelsystemen mogelijk te maken. We geven een gedetailleerde beschrijving van hoe een rhizobox-experiment uitgevoerd kan worden, inclusief bemonstering en 2D-mapping van wortelexsudaten met behulp van de ZrOH-hydrogeltechniek. Het omvat hydrogelvoorbereiding, het vullen van de rhizobox, plantteelt, het aanbrengen van hydrogel, het ophalen en snijden van hydroxylaat, carboxylaateluatie uit de hydrogel en analyse, en wordt gevolgd door 2D-beeldgeneratie. Daarnaast bevat het aantekeningen over kritieke stappen, zoals carboxylaatanalyse met ionenchromatografie-massaspectrometrie (IC-MS).

Protocol

1. ZrOH hydrogel-bereiding

OPMERKING: Een schone omgeving en materialen zijn vereist voor de gelbereiding om besmetting te voorkomen. Gebruik alleen laboratoriumwater van graad I (≤18 MΩ·cm) bij het bereiden van de oplossingen, gelspoeling en hydratatie voor kwaliteitscontrole. Zorg ervoor dat de giftige afvalcontainers (vloeibaar en vast) al in de dampkap zijn geplaatst voordat je met de hydrogelbereiding begint. Verwarm de oven voor tot ongeveer 42─45 °C gedurende 1 uur voordat je begint met het bereiden van de gels. Details over de materialen en chemicaliën staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Glasassemblagevoorbereiding
   1. Bereid een 10% (w/v) HNO₃ zuurbad voor door 153,8 mL 65% HNO₃ toe te voegen aan 846,2 mL laboratoriumwater van laboratoriumkwaliteit I in een dampkap.
   2. Laat de glazen platen (6,1 x 17 cm), pincetten, Teflon U-vormige afstandhouders (0,25 mm of 0,4 mm) en plastic clips minstens 4 uur in het zuurbad weken.
   3. Verwijder de glazen platen, pincet, plastic clips en teflonafstandhouders uit het zuurbad en was daarna minstens drie keer met laboratoriumwater van klasse I. Laat ze daarna grondig aan de lucht drogen in een laminaire flow of een schoon werkbank.
      OPMERKING: De glazen platen moeten dezelfde dag als de gelbereiding worden voorbereid en vermijd het drogen met papier om besmetting te minimaliseren.
   4. Plaats de "U"-vormige afstandhouder op de droge glazen plaat, voeg de tweede toe en bevestig ze met clips. Verschuif de glazen platen met ongeveer ~1 mm om het pipetten te vergemakkelijken (zie Figuur 1A).
   5. Plaats de glasplaat-assemblage op een schone plastic folie onder de filmkap voordat je de geloplossing giet.
2. Polyacrylamide gelvoorbereiding³¹
   1. Geloplossing: Bereid 100 mL geloplossing door 15 mL diffusieve gradiënten in dunne films (DGT) gelkruisverbinder te mengen met 47,5 mL laboratoriumwater van laboratoriumkwaliteit I in een schoon plastic flesje, en voeg vervolgens 37,5 mL acrylamideoplossing toe (40%). Roer het mengsel grondig na het toevoegen van elke oplossing. De geloplossing kan minimaal drie maanden in een koelkast (4 °C) worden bewaard.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat je de juiste hoeveelheden van elke oplossing pipeteert en weeg en gebruik alleen acrylamideoplossing zonder bis-acrylamide, omdat dit zachte gels oplevert wanneer je in een 2-(N-morfolino)-ethanesulfonzuur (MES) buffer wordt geplaatst.
   2. Bereid een 10% (met v) ammoniumpersulfaat (APS) oplossing voor door 0,1 g APS op te lossen in 1 g H2_O.Bereid de oplossing elke dag vers voor en zorg dat deze volledig is opgelost voor gebruik.
   3. Maak een gelcocktail door 4 mL geloplossing te mengen met 28 μL 10% APS, en voeg vervolgens 10 μL 99% N,N'N'N'-Tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe in schone plastic flesjes. Meng na het toevoegen van elke oplossing. De oplossing kan worden bereid voor maximaal 3 gels terwijl het mengsel snel polymeriseert. Het volume van een cocktail kan worden aangepast afhankelijk van de grootte van de te gebruiken platen en afstandhouders.
      OPMERKING: Vermijd bellen en schuimvorming bij het mengen van de verschillende reagentia.
   4. Pipette langzaam het gelmengsel tussen de glasplaatconstructie vanuit het midden, zoals weergegeven in Figuren 1B,C ²⁶. Als er luchtbellen aanwezig zijn, verwijder deze door het glazen geheel voorzichtig te kantelen of met een pen op de glazen platen te kloppen.
      OPMERKING: Om bubbelvrije gels te verkrijgen, vermijd het gebruik van bekraste glazen platen en bewaar ze na gebruik in een zuurbad, waarbij je ze alleen voor het volgende gebruik wast in plaats van ze in polyethyleenzakken te bewaren. Gebruik een pipet van 1 mL of 5 mL met een kleine tip om de gel te gieten en voeg de gelcocktail langzaam toe vanuit het midden zodat deze gelijkmatig verdeeld wordt terwijl je de platen onder een hoek van 45° kantelt.
   5. Plaats de assemblage in de voorverwarmde oven en houd de temperatuur minstens 1 uur op 42─46 °C om ervoor te zorgen dat de gel volledig uithardt (er druppelt geen vloeistof).
   6. Hef de assemblage voorzichtig met behulp van een schoon, roestvrij scheermesje van de hoeken en was de gels van de glazen platen met laboratoriumwater van I-gehalte in een wasfles (Figuur 1D–F). Voor het gemakkelijk verwijderen van de gel, week je deze enkele minuten met water en spoel je hem daarna af in een 1-L beker met laboratoriumwater van graad I.
      OPMERKING: Vermijd het trekken van de gel met een pincet als deze aan de plaat blijft plakken; dit kan leiden tot gelvervorming. Na polymerisatie bevinden eventuele zichtbare belletjes zich meestal tussen de gel en de glazen plaat in plaats van binnen de gel zelf, wat duidelijk wordt zodra de plaat wordt verwijderd.
   7. Verversen het water minstens 3–4 keer binnen 24 uur na hydratatie (bij voorkeur met intervallen van 2 uur na voorbereiding) om de resterende polymerisatiechemicaliën af te wassen. Door het water herhaaldelijk te vervangen tijdens hydratatie, worden onzuiverheden zoals niet-gereageerde reagentia weggediffundeerd en wordt de pH verlaagd, waardoor ladingsophoping in de gel wordt voorkomen.
   8. Bewaar de gels in laboratoriumkwaliteit I water (voor een korte periode van ongeveer 24 uur) of 0,01 mol ^L-1 NaCl of NaNO₃ in de koelkast (4 °C) als de gelvelen niet direct worden gebruikt voor ZrOH-precipitatie. Deze gels kunnen tot 1 maand in NaCl worden bewaard voordat ze neerslaan.
      OPMERKING: We raden aan de gels direct na polymerisatie neer te slaan om besmetting die tijdens het wassen kan worden geïntroduceerd te minimaliseren.
3. Neerslag van ZrOH-gels¹⁴
   1. Los 3,22 g zirkoniumdichlorideoxideoctahydraat (ZrOCl_{2,8H 2}O) op in 40 mL laboratoriumwater van klasse I in een kunststof beker van 250 mL.
   2. Plaats tot 4 gelvellen en vul tot 100 mL. Of los 1,66 g ZrOCl_{2,8H 2}O op in 20 mL laboratoriumwater van klasse I, doe er 2 gels toe en vul tot 50 mL.
   3. Laat de gelvelen minstens 2 uur weken om een gelijkmatige verdeling van Zr in de gels te garanderen.
   4. Breng elke gel over in 100 mL van 0,05 mol ^L-1 2-(N-morfolino)-ethanesulfonzuur (MES) gebuffreerd bij pH 6,7 (pH wordt aangepast met 1 mol ^L-1 NaOH) voor precipitatie. Roer de gel voorzichtig met een pincet gedurende de eerste 30-60 seconden om homogene neerslag te verkrijgen.
   5. Schud voorzichtig op een plaatschudder bij ≤100 toeren gedurende 40 minuten voor volledige neerslag van Zr(OH)₄ in de gel.
      OPMERKING: Langzamere schudsnelheid heeft de voorkeur om te voorkomen dat de gels aan elkaar blijven plakken.
   6. Plaats de gels in laboratoriumwater van graad I in een beker van 1─2 L gedurende 24 uur om Cl^- ionen te verwijderen en verversen het water minstens 3 keer om de 2 uur³² uur. Grondige verwijdering van de Cl^- ionen kan worden gecontroleerd door de geleidbaarheid van de spoeloplossing te meten of een chloridetest uit te voeren.
   7. Bewaar de gel in 0,03 mol ^L-1 NaNO₃ of NaCl, maar NaCl heeft de voorkeur voor bodemexperimenten omdat nitraat snel de microbiële activiteit in de bodem verhoogt en ook een belangrijke plantenvoedingsstof^{is 13,32}.
   8. ZrOH-hydrogels zijn tot 60 weken getest (bewaard in een koelkast bij 4 °C) en bleken hun eigenschappen en goede prestaties (±10% van de streefwaarden)³² te behouden.
4. Gelsnijden
   1. Maak de ongekraste plexiglazen plaat, pincet en een scherp, roestvrij scheermesje schoon. Bij afwezigheid van een plexiglazen plaat kan elke dikke en sterke glasplaat worden gebruikt.
   2. Bevochtig de plexiglazen plaat met laboratoriumkwaliteit I water om de ZrOH hydrogelplaten te helpen verspreiden.
   3. Breng het ZrOH hydrogelvel uit op de plexiglazen plaat met een pincet terwijl je ervoor zorgt dat het plat ligt zonder bellen. Identificeer de gebieden met gaten in de platen; deze plekken moeten worden vermeden bij het snijden.
   4. Snijd de ZrOH hydrogelvellen nauwkeurig met een scherp scheermesje op de gewenste grootte. Het verwijderen van het water na het snijden helpt om de uitgesneden delen duidelijk te zien.
      OPMERKING: Voor het eenvoudiger identificeren van de zijkanten voor 2D-mapping raden we aan om ZrOH hydrogelstukken in een haakse trapezium te snijden, waarbij de langste zijde linksboven zich bevindt.
   5. Bewaar de ZrOH-hydrogels in laboratoriumwater van graad I (voor kortdurende opslag en net voor het aanbrengen van de gel) of 0,03 mol ^L-1 NaNO₃/NaCl voor langdurige opslag (>24 uur).

2. Opzet van het Rhizobox-experiment

OPMERKING: De planten worden gekweekt in met aarde gevulde rhizoboxen, die in ontwerp variëren. We raden aan om rhizoboxen te gebruiken die zijn uitgerust met een gaat(en) aan de onderkant of achterkant om het water te vergemakkelijken en een gelijkmatige waterverdeling te garanderen (zie aanvullende figuur 1). Details over de materialen en chemicaliën zijn vermeld in de Materiaaltabel.

1. Rhizoboxvulling en bepaling van watervasthoudende capaciteit²⁶
   1. Zeef luchtgedroogde grond met een zeef van 2 mm en homogeniseer de bodem. We raden aan om middelmatige grond te gebruiken, maar ook zand- of kleigrond kan worden gebruikt, mits er specifieke hanteringstechnieken worden toegepast (bijvoorbeeld rhizobox-type, vulling, opening en water).
   2. Weeg alle componenten van de rhizobox (leeg) samen met de klemmen en plastic folie en noteer het gewicht (zie aanvullende figuur 2C). Voeg 2–3 extra rhizoboxen toe aan het vereiste aantal voor het bepalen van de watervasthoudende capaciteit (WHC).
   3. Schat de massa droge grond die nodig is om de rhizobox te vullen. Over het algemeen wordt de rhizobox tot 2 cm onder de bovenkant gevuld. De aanbevolen bulkdichtheid is ongeveer 1,0–1,4 g ^cm-3.
   4. Afhankelijk van het type rhizobox en het gemak van het hanteren, vul je de rhizobox zorgvuldig met de droge grond. Tijdens en na het vullen kan de grond worden egaliseerd met een platte plaat zonder deze te verdichten. Licht vochtige grond kan ook worden gebruikt om de rhizobox te vullen, waardoor de bodemstructuur behouden blijft, vooral bij fijn getextureerde of zware kleibodems (zie Wagner et ^al.26 voor een gedetailleerde beschrijving).
   5. Als alternatief, als de rhizobox van bovenaf gevuld is, bevestig dan de plastic folie op de rhizobox, bedek deze met de voorplaat en klem dan vast (zie aanvullende figuur 2A–D).
   6. Voor het gemak installeer je een nucleporemembraan tijdens het vulproces en zorg dat het plat op het oppervlak ligt. Een nucleporemembraan is nodig bij het bemonsteren van wortelexsudaten.
   7. Noteer het gewicht van de met aarde gevulde rhizoboxen samen met de klemmen. Bereken de massa van de droge grond (m_{droge grond}) voor elke rhizobox door het gewicht van de lege rhizoboxen af te trekken van de met aarde gevulde, en registreer het gewicht.
   8. De watervasthoudende capaciteit wordt bepaald door eerst de rhizoboxen te verzadigen met gedeïoniseerd water en ze vervolgens ~8 uur te laten draineren. Weeg de rhizoboxen en bereken de massa water (m_w) door het gewicht van de met aarde gevulde rhizoboxen die in stap 2.1.7 zijn geregistreerd van het huidige gewicht af te trekken. Bepaal vervolgens WHC (g ^g-1) door m_w door m_{droge grond} te delen, het resultaat is een verhouding.
      OPMERKING: Gebruik geen rhizofosjes die worden gebruikt voor WHC-bepaling voor daadwerkelijke mapping, omdat waterverzadiging kan leiden tot anaerobie en dus tot redoxartefacten.
   9. Het optimale watergehalte voor de meeste planten tijdens de groei moet worden gehandhaafd op 50%─60% WHC (d.w.z. WHC-factor, f_WHC = 0,5─0,6), afhankelijk van het bodemtype en de plantensoort. Schat de hoeveelheid water die aan elke rhizobox toegevoegd moet worden (m_{w add}) als volgt: m_{w add} = WHC x f_{WHC x} m_{droge grond}.
   10. Geef de rhizobox water voordat je plant, met een_{mW toevoeging}. Als er water wordt gegeven via de gaten, voeg dan 5-10 ml water toe aan het oppervlak.
   11. Noteer de massa van de waterige rhizozen, die nodig zijn om de planten tijdens de groei water te geven.
2. Plantenteelt en -beheer^12,26
   1. Steriliseer de zaden vóór kieming of planten. Een gangbare praktijk is om ze 3 minuten in 70% ethanol te plaatsen en daarna 15 minuten in 1% NaClO om schimmelgroei te voorkomen. Spoel de zaden daarna af met gedeïoniseerd water (ongeveer 6─7 keer).
   2. Laat de zaden vooraf kiemen tussen filterpapier of kiemrollen die met water of 0,05 mmol L⁻¹ CaSO₄ zijn bevochtigd, totdat de radiculus tevoorschijn komt.
   3. Breng één zaailing over op elke rhizobox, plaats ze dicht bij de voorste plaat, bedek ze met wat aarde en voeg dan wat water toe.
   4. Wikkel de rhizoboxen in aluminiumfolie om fotochemische reductie in de rhizosfeer te voorkomen, de groei van algen en andere fotosynthetische micro-organismen te voorkomen, en om stress van de wortels bij blootstelling aan licht te voorkomen. Alternatief zijn zwarte voorplaten beschikbaar die geen licht doorlaten en kunnen worden gebruikt in plaats van aluminiumfolie.
   5. Plaats de rhizoboxen op een rek zodat ze in de groeikamer of kas met gecontroleerde temperatuur, relatieve luchtvochtigheid en lichtintensiteit gekanteld zijn. We raden een kanteling van 25°─35° aan.
   6. Geef de rhizoboxen minstens 2─3 keer per week gravimetrisch water, afhankelijk van de behoeften van de planten. Dit gebeurt door de rhizoboxen te wegen en water toe te voegen om het verschil met het gewicht dat in stap 1.2.11 is vastgelegd te compenseren. Wanneer de biomassa van de plant echter significant is en de watervraag toeneemt, moet de biomassa worden meegenomen en moet het bewateringsvolume dienovereenkomstig worden aangepast.
   7. Specifieke gewasbeheerspraktijken (bijv. bemesting) worden uitgevoerd volgens de experimentele opstelling, bodemkenmerken, gecultiveerde plantensoorten en de heersende behoeften aan ziekte- en ongediertebestrijding tijdens de plantengroei.
   8. De groeiperiode en het bemonsteren van worteluitscheidingen hangen grotendeels af van de grootte van de rhizoboxen, plantensoorten en de doelstellingen van de studie.

3. Wortelexsudaat bemonstering ^12,26

OPMERKING: Hier geven we details over niet-destructieve bemonstering van wortel-exsudaten. Zorg ervoor dat alle benodigde materialen vóór de bemonstering worden voorbereid en dat de experimentele blanks tijdens de bemonstering worden opgenomen. De details over de materialen en de chemicaliën staan vermeld in de Tabel van Materiaal.

1. Breng het watergehalte van de rhizoboxen langzaam naar 90%─95% WHC (80% voor zeer gevoelige gewassen voor zuurstofstress) een dag of minstens 2 uur voor de bemonstering. Dit kan nauwkeurig worden bereikt door eerst de hoeveelheid water toe te voegen (m_{w optelling}) in stap 2.1.9 met 90%─95% WHC, vervolgens het totale gewicht van de rhizobox, natte grond en een schatting van het plantengewicht opnieuw te berekenen. Voeg met een balans gedeïoniseerd water toe totdat de rhizobox het opnieuw berekende gewicht bereikt.
2. Wikkel de aluminiumfolie los van de rhizobox, identificeer en teken het interessegebied op de voorplaat. Deze stap is alleen nodig als alleen de wortelsegmenten of jonge planten bemonsterd moeten worden.
3. Snijd een kunststoffolie en ZrOH-hydrogel (zie stap 1.3) in de gespecificeerde afmetingen volgens het interessegebied en de grootte van de rhizobox. Als het nucleopoormembraan niet tijdens het vulproces is geïnstalleerd, snijd het dan op de gewenste afmetingen, iets groter dan de ZrOH-hydrogel.
4. Plaats de rhizoboxen op een vlakke standaard met de verwijderbare voorplaat naar boven gericht en open ze voorzichtig (zie Figuur 2A). Haal langzaam de plastic folie eruit terwijl je ervoor zorgt dat de wortels en de grond niet worden verstoord.
5. Plaats een liniaal op het interessegebied en maak hogeresolutiefoto's, die nodig zullen zijn voor de verdere verwerking van de gegevens. Een liniaal dient als referentie voor nauwkeurige groottebepaling direct uit het beeld tijdens de verwerking, vooral als veel rhizoboxen bemonsterd moeten worden.
6. Voeg een kleine hoeveelheid water toe aan het doelwortelgebied totdat er een dunne waterfilm op het oppervlak verschijnt (zie Figuur 2B). Een hoger vochtgehalte (bij voorkeur 90%–95% WHC of 80% voor zeer gevoelige gewassen voor zuurstofstress) van de bodem bevordert een goed contact tussen bodem en gel tijdens het bemonsteren. Een hoger vochtgehalte is noodzakelijk om een constante toestroming van moleculen op de hydrogel te garanderen.
7. Plaats het voorgesneden nucleporemembraan direct op het grondoppervlak/wortelgebied van belang en zorg ervoor dat het plat ligt op het grond-wortel grensvlak (zie Figuur 2C).
8. Plaats de ZrOH-hydrogel direct en zo plat mogelijk op het nucleporemembraan in het betreffende gebied en maak samen met de liniaal aan de linkerkant van de ZrOH-hydrogel een foto (zie Figuur 2D). De liniaal kan helpen de grootte van de ZrOH-hydrogel te bepalen en, bij veranderingen in eigenschappen tijdens de bemonstering, het bemonsterde gebied, en de zijden te identificeren tijdens langdurige opslag (>1 jaar).
9. Bescherm de ZrOH hydrogel van de voorplaat door een plastic folie op de ZrOH hydrogel te plaatsen (zie Figuur 2D).
10. Sluit de rhizobox voorzichtig om de beweging van de ZrOH-hydrogel te verminderen. Minimale beweging van de ZrOH-hydrogel bij het sluiten van de rhizobox kan ook worden bereikt door de gelsandwich (nucleporemembraan + ZrOH-hydrogel + plastic folie) met vinyl elektrische tape aan een schone voorplaat van de rhizobox te bevestigen, zoals beschreven door Wagner et al.²⁶.
11. Wikkel de rhizobox opnieuw in aluminiumfolie en zet hem 24 uur terug in de groeikamer/kas. Worteluitscheidingen kunnen langer of korter worden verzameld, mits de gel niet uitdroogt en afhankelijk van de experimentele opstelling en onderzoeksdoelstellingen.
12. Na de aanbrengperiode open je voorzichtig de rhizobox, verwijder je voorzichtig de tape en het membraan, en haal je de hydrogel eruit. Plaats de hydrogel in een steriele luchtdichte zak, voeg een paar druppels water toe voordat je sluit en bewaar dan in de koelkast (4 °C) tot analyse. Bewaar blanco gels op een vergelijkbare manier als een controle. Voor 2D-mapping tilt u de ZrOH hydrogel samen met een plastic vel en markeert u de bovenkant.
13. Verwijder de wortels en bepaal de morfologische parameters, het verse gewicht en het droge gewicht van de wortel voor normalisatie van exsudategegevens als er geen tijdresolutie-experimenten worden uitgevoerd.
14. Sluit de rhizobox en plaats deze terug in de klimaatkamer of kas als er tijdsgebonden studies worden uitgevoerd.

4. Elutie en meting van carboxylaten¹²

OPMERKING: Verse laboratoriumkwaliteit I water en analytische standaarden van hoge zuiverheid zijn vereist om de blanks en standaarden te bereiden. Als kwaliteitsborging moeten gecertificeerde kwaliteitscontrolenormen worden gebruikt. Zorg ervoor dat de oplossingen (monsters en standaarden) vrij zijn van deeltjes door de monsters te filteren met 0,2 μm of 0,45 μm nylonfilters voorafgaand aan de analyse om verstopping van de buis te voorkomen. Details over de materialen en chemicaliën staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Verwijder de geladen en blanco ZrOH hydrogels uit de koelkast, meet de afmetingen met een liniaal en bereken vervolgens het volume van elk met een dikte van 0,4 mm voor een afstandhouder van 0,25 mm en 0,64 mm voor een afstandhouder van 0,4 mm. Voor 2D-mapping snijd je de ZrOH hydrogels in de gewenste maat met een schoon scheermesje. Houd er rekening mee dat de ondergrens ongeveer 2 x 2 mm is vanwege moeilijkheden bij het snijden van kleinere stukken en het hanteren van de juiste elusievolumes.
   OPMERKING: Gebruik in plaats van een liniaal ruitjespapier (millimeter ruitjespapier) aan één kant van de plexiglazen plaat die wordt gebruikt voor het snijden, zodat het makkelijker wordt om de ZrOH-hydrogels in bijna perfecte stukken te snijden. De dikte van de ZrOH-hydrogels is bevestigd met een vernier-remklauw.
2. Plaats de ZrOH hydrogels of ZrOH hydrogelstukken in plastic flesjes, elueer ze door 0,5 mol ^L-1 NaOH toe te voegen volgens de verhouding 1 mL eluent per 0,196 cm³ ZrOH hydrogel en schud 24 uur op een plaatshaker bij 150 tpm.
3. Als het elusievolume laag is bij een zeer klein (bijv. 2 x 2 mm) ZrOH hydrogelstuk, voeg dan laboratoriumkwaliteit I water toe naar gewicht tot 45-60 μL, afhankelijk van het minimale volume dat nodig is voor de analytische methode die wordt gebruikt voor de kwantificatie van carboxylaten (bijvoorbeeld, IC-MS heeft minstens 45 μL monster nodig voor de autosampler, afhankelijk van het instrument). Noteer de exacte hoeveelheid toegevoegd water om het volume op 45-60 μL te brengen, aangezien dit vereist is voor de berekening van de verdunningsfactor en de werkelijke concentratie.
4. Filter de monsters (0,2 μm of 0,45 μm nylonfilters) en breng ze over in flesjes. We raden aan om 1,5 mL plastic IC-flesjes te gebruiken, omdat ze ingevroren kunnen worden zonder te breken. 330 μL flesjes kunnen ook voor kleinere volumes worden gebruikt, maar er moet op gelet worden dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
5. Kwantificeer carboxylaten in de elusieoplossing met de voorkeursanalytische methode (bijv. IC-MS, HPLC). We raden aan hun scheiding te gebruiken met IC in combinatie met MS-detectie. Alternatief kan hoog- of ultra-performance vloeistofchromatografie (HPLC of UHPLC) worden toegepast in combinatie met diverse detectoren, waaronder geavanceerde MS (bijv. time-of-flight of Orbitrap) of spectrofotometrische detectoren.
6. Aan het einde van de meting kunnen de monsters, samen met de standaarden, in de vriezer worden bewaard. Wij raden aan alle oplossingen met carboxylaten maximaal 1 jaar op -20 °C te bewaren. Voor opslagperiodes van langer dan 1 jaar kunnen verse standaarden worden voorbereid en gemeten als kwaliteitscontrole.
7. Bereken de totale hoeveelheid van elk carboxylaat in het totale volume van het eluaat (d.w.z. NaOH-volume + hydrogelvolume + toegevoegd water) en normaliseer op wortelgewicht of worteloppervlakte en vermenigvuldig met de eluatie-efficiëntiefactoren: 0,94 voor aconitaat, 1,00 voor citraat, 0,90 voor fumaraat, 1,02 voor lactaat, 1,05 voor malaat, 0,91 voor oxalaat en 1,00 voor succinaat (zie aanvullende tabel 1). Zorg ervoor dat de verdunningsfactoren worden meegenomen als die tijdens de eluering en meting zijn uitgevoerd.

5. 2D-mapping

OPMERKING: Er is geen specifieke software voor het maken van 2D-afbeeldingen van de exudatiegegevens. De mapping kan worden gedaan met Microsoft Excel en Python.

1. Voeg de gegevens die in stap 4.7 van elk gelstuk zijn verkregen in de bijbehorende cel binnen het 2D-raster (rijen x kolommen). Het raster wordt gegenereerd over de foto's die tijdens het bemonsteren vanaf de wortels zijn genomen (zie stap 4.1).
2. Definieer de grootte van de rasters en controleer of de data overeenkomt.
3. Selecteer de kleurschaal en geef kleurcodes aan die de laagste en hoogste waarden vertegenwoordigen.
4. Specificeer het numerieke databereik voor de legende om ervoor te zorgen dat deze nauwkeurig overeenkomt met de gekozen schaal.
5. Maak een heatmap en zorg ervoor dat deze geen labels of gridlines heeft. De heatmap kan eenvoudig worden gemaakt in R-software met het voorbeeld van het R-script dat in Supplementary File 1 is geleverd.
6. Verwerk het beeld en plaats het naast de foto van de wortels die tijdens de bemonstering zijn verkregen, om de ruimtelijke verdeling van de carboxylaten te kunnen interpreteren.
   OPMERKING: Tegenwoordig kan mapping ook worden uitgevoerd met behulp van kunstmatige intelligentietools. De procedure is eenvoudig: kopieer en plak simpelweg het numerieke raster uit Excel in de chat, en vraag vervolgens een heatmap aan met de gewenste gelstukafmetingen en kleurschaal voor de legenda. Houd er rekening mee dat de output niet altijd perfect is bij de eerste poging, maar het herhalen van het proces levert meestal nauwkeurige resultaten op. Deze aanpak biedt het voordeel dat het aanzienlijk sneller is dan handmatige methoden.

Results

De ZrOH-hydrogelmethode werd aanvankelijk ontwikkeld voor het bemonsteren van citraat uit in de grond gekweekte plantenwortels en werd met succes gebruikt om de ruimtelijke verdeling van exudatie¹¹ te bepalen. Voordat we deze methode voor andere carboxylaten toepasten, karakteriseerden we ZrOH-hydrogels om te waarborgen dat ze ook geschikt zijn voor gebruik met andere carboxylaten (zie aanvullende tabel 1). Daarnaast hebben we geladen opgeslagen ZrOH-hydrogels geëlueerd en geanalyseerd uit een rhizobox-experiment uit 2019. De ZrOH-hydrogels kunnen binnen 5 uur (~0,2 μmol, 10 mL) 100% van de geladen hoeveelheid opnemen voor aconitaat, citrat, fumaraat, lactaat, malaat, oxalaat en succinaat met behulp van dezelfde elusieparameters die door Tiziani et ^al.12 zijn vastgesteld (1 mL, 0,5 mol ^L-1 NaOH). ZrOH-hydrogels kunnen tot 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol ^cm-2 carboxylaten binden (zie Aanvullende Tabel 1), veel hoger dan de concentraties (vaak in het nmol-bereik) die gewoonlijk in de rhizosfeer voorkomen. Bovendien blijven carboxylaatrijke ZrOH-hydrogels stabiel en kunnen ze enkele weken worden opgeslagen voor analyse, waardoor microbiële afbraak tijdens en na de bemonstering wordt geminimaliseerd.

De resultaten in Figuur 3 tonen een 2D-visualisatie van de ruimtelijke verdeling van citraatexsudas langs een clusterwortel van een in de grond gekweekte Lupinus albus L (lupine) plant die wordt gekweekt in een P-deficiënte grond. De kaart bestaat uit 48 individuele metingen uitgevoerd op 5 x 2 mm gelstukken, waarin de ZrOH-gel in augustus 2025 werd gesneden na citraatmonsters in augustus 2019. Duidelijk is dat de ZrOH-hydrogels effectief het uitgescheiden citraat absorbeerden, met kwantificeerbare resultaten zelfs op een kleine gel (0,10 cm²), zonder dat er voorconcentratie van het eluaat nodig was. De hoogste citraat-exudatiesnelheden werden gevonden in de clusterwortelgebieden (tot 2,8 nmol ^cm-2 gel ^h-1), wat neerkomt op 67,2 nmol ^cm-2 gel op dag ¹, terwijl de laagste percentages werden waargenomen op de gelstukken die alleen in contact waren met de bodem. De clusterwortels varieerden in lengte van 0,2 mm tot 15,6 mm, met een totale lengte van 250 mm. Deze resultaten bevestigen de geschiktheid van de hydrogels voor wortelvrijgegeven carboxylaatmonsters gedurende 24 uur. De ZrOH-hydrogels konden naast citraat ook andere carboxylaten binden, zoals lactaat, fumaraat, malaat en oxalaat, naast citraat (Tabel 1). De detectie van het merendeel van de carboxylaten uit de ZrOH-hydrogels, die 6 jaar lang bij 4 °C werden opgeslagen, wijst op minimale afbraak van de carboxylaten. Er zijn echter experimenten gaande om aanzienlijk meer informatie te verzamelen over de zeven geteste carboxylaten van verschillende plantensoorten.

Figuur 1: Kritieke stappen voor de voorbereiding van polyacrylamide gel. (A) Uitlijning van de glasplaatassemblage met ~1 mm verschuiving. (B) Gelgieten en (C) gelijkmatige verspreiding van de geloplossing in de plaat vanaf het midden van de plaat. (D) Het heffen van de glazen plaat met een scheermesje vanaf de hoek. (E) De gels weken om ze van de glasplaat los te maken. (F) De gel afwassen in een beker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Wortelexsudaat bemonstering uit een segment van het wortelstelsel van de rhizobox met ZrOH-hydrogels. (A) Rhizobox openen na het verwijderen van de voorplaat en het plastic. (B) Passende bevochtiging van het grond-wortelinterface met gedeïoniseerd water in een wasfles. (C) Nuclepore track-etchmembraan bevestigd aan een natte bodem-wortelinterface. (D) Rhizobox met een ZrOH-hydrogel aangebracht op het interessegebied, bedekt met plastic folie voor gelbescherming tegen de voorplaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Wortelexsudaat bemonstering met ZrOH-hydrogel en millimeterschaal 2D-afbeelding van citraat-exsudate. (A) Foto van ZrOH-hydrogel over het wortelgebied van belang tijdens het bemonsteren om rasters te genereren die voor het kaarten worden gebruikt. (B) Millimeterschaal 2D-afbeelding die de verdeling van citrat-exsudatiesnelheid toont (nmol cm^–2 gel h^–1) een witte Lupinus albus L. (lupine) clusterwortel gekweekt in een fosforarmige bodem. Elk raster stelt een gelstuk van 5 x 2 mm voor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Plant	Behandeling	Aconitaat	Citraat	Fumaraat	Lactaat	Malate	Oxalaat	Succinaat
	mg P kg-1 grond	NMOL CM-2 H-1
Lupin	50		0.02	0.21	0.15		0.06
Lupin	250		0.02	0.4	0.17	0.02	0.2
Lupin	250		0.05	0.31	0.09	0.01	0.19
Lupin	0		0.03	0.21	0.15	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.24	0.04	0.02	0.1
Rice (DJ123)	250		0.01	0.39	0.12		0.1
Rijst (Nerica4)	50		0.01	0.24	0.35		0.09

Tabel 1: Aconitaat, citrat, fumaraat, lactaat, malaat, oxalaat en succinaat uitscheidingspercentages van in de grond gekweekte Lupinus albus L. (lupin) en Oryza sativa L. (rijst) planten die worden blootgesteld aan 0, 50 en 250 mg P ^kg-1 grond. LOQ is de limiet van kwantificatie

Aanvullende tabel 1: NaOH (1 mL, 0,5 mol ^L-1) elusieparameters (elusie-efficiëntie en correctiefactor) en capaciteit van de ZrOH-hydrogel voor zeven carboxylaten. De gegevens zijn gemiddelden ± standaarddeviaties van het gemiddelde (n = 4 voor elusie-efficiëntie en capaciteit van individuele carboxylaten en n = 40 voor carboxylaatmengsel). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 1: Schematische weergave van de aanbevolen rhizobox voor gemakkelijker water geven. De rhizobox bestaat uit een rhizoboxframe met gelijkmatig verdeelde watergaten aan de onderkant en achterkant om een gelijkmatige waterverdeling tijdens het bewateren te vergemakkelijken, en een verwijderbare transparante voorplaat om de wortelgroei tijdens het experiment te monitoren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Rhizobox-montage en grondvullingsproces. (A) Bedek de gaten aan de achterkant van het rhizoboxframe met plakband. (B) Bevestig een (nucleporemembraan) en vervolgens kunststof folie aan de voorkant of open zijde van het Rhizobox-frame (zorg dat het strak genoeg en vlak zit). (C) Plaats de voorplaat en klem de rhizobox vast. (D) Vul de rhizobox terwijl je hem naar voren kantelt zodat de fijnere deeltjes op het verwijderbare oppervlak vallen en zo een glad oppervlak krijgen, zoals op de afbeelding. (E) Of vul het bedekte rhizoboxframe (A) vanaf de open zijde, richt het met de verwijderbare plaat en bedek het vervolgens met nucleopormembraan, plastic folie en de voorplaat. (F) Definitieve opstelling van de Rhizobox, bewaterd en geplant. Een alternatieve vulprocedure wordt getoond in Wagner et al. (2020). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Bestand 1: Het bestand bevat details over het R-script dat wordt gebruikt om een heatmap te genereren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De hier beschreven carboxylaatbemonsteringsmethode maakt gebruik van ZrOH-hydrogels, waarvoor een juiste gelvoorbereiding en -behandeling cruciaal zijn. Voor het hanteren van ZrOH-hydrogels raden we aan ze vochtig te houden met enkele druppels laboratoriumwater. Tijdens de voorbereiding is het belangrijk om de gel direct na het bereiden van het gelmengsel te gieten (stap 1.1.3) en ervoor te zorgen dat er geen belletjes tussen de glazen platen ontstaan. Bubbels in het midden van de ZrOH-hydrogel zijn bijzonder kritisch, omdat ze de bemonstering kunnen verstoren. Daarentegen kunnen bellen aan de randen worden verwijderd door de gel voor het aanbrengen te trimmen. Bovendien binden wortelvrijgekomen carboxylaten aan het neergeslagen ZrOH in de hydrogels, waardoor een gelijkmatige verdeling van Zr tijdens de neerslag essentieel is. Ongelijke Zr-verdeling binnen de gel kan leiden tot laterale diffusie van carboxylaten, wat hun ruimtelijke verdeling vervormt en de betrouwbaarheid van 2D-lokalisatie²⁶ aantast. Een gelijkmatige verdeling van Zr kan worden bereikt door de polyacrylamidegels langer dan 2 uur in een ZrOCl₂·8H_2O-oplossingte dompelen in een bredere beker en door minder gels¹² te plaatsen (stap 1.2.3). Bovendien kan de Zr-verdeling worden geverifieerd met behulp van een scanning-elektronenmicroscopie (SEM, S-3400N II, Hitachi, Japan) zoals aanbevolen door Guan et ^al.14, die de ZrOH-hydrogels ontwikkelden. SEM is echter niet haalbaar als standaardprocedure voor enorme monsters.

Een andere cruciale stap betreft het vullen van de rhizobox, het aanbrengen van het nucleporemembraan en het bewateren vóór het toedienen van de gel voor carboxylaatmonsters. Er moet bijzondere zorg worden besteed aan het vullen en hanteren van zanderige of zware kleigrond om een uniform glad oppervlak te garanderen, wat essentieel is voor goed gelcontact, terwijl ook goed doorlatende omstandigheden behouden blijven. Een glad oppervlak is ook essentieel voor een goede bevestiging van het nucleporemembraan. Het is cruciaal om goed contact te leggen tussen de wortel en de ZrOH-hydrogel door ervoor te zorgen dat het nucleporemembraan correct aan het bodemoppervlak hecht met minimale luchtbellen. Voor de ZrOH-geltoepassing is het ook cruciaal om de bodem goed te verzadigen zodat de ZrOH-hydrogel stevig kan worden bevestigd, plat en vochtig kan worden gehouden om de integriteit tijdens het bemonsteren te behouden. Bij het snijden van de gel voor 2D-carboxylaatmapping kan het een uitdaging zijn om millimeterprecieze sneden te bereiken; daarom raden we aan niet onder een resolutie van 2 x 2 mm te gaan. Bovendien is het belangrijk om ze na het bemonsteren vochtig te houden omdat de gels krimpen na het bemonsteren om hun integriteit te behouden (stap 3.12). De huidige methode is aangepast van Tiziani et ^al.12 , die het gebruik van NaN₃ als microbiële remmer aanbevelden om de afbraak van carboxylaten te voorkomen. In dit protocol gebruiken we geen microbiële remmers, die vaak worden gebruikt voor het bemonsteren van wortelexsudaten (NaN₃ of micropur, een op AgCl₃ gebaseerd materiaal)²³, vanwege hun interferentie met de analysemethoden en mogelijke effecten op het IC-MS-systeem.

Tot nu toe is de methode uitsluitend gevalideerd voor zeven carboxylaten (aconitaat, citrat, fumaraat, lactaat, malaat, oxalaat, succinaat), terwijl het wortelexudoom bestaat uit een complexe mix van verbindingen (bijv. fenolen, aminozuren, koolhydraten en carboxylaten). Deze andere belangrijke verbindingen worden momenteel niet meegenomen in de methode, noch zijn de ZrOH-hydrogels gekarakteriseerd voor hun bemonstering. De aanwezigheid van andere oxyanionen in de bodem (zoals fosfaat, nitraat) kan mogelijk de opname, capaciteit en eluatie van carboxylaat beïnvloeden, evenals de kwantificering van carboxylaat op IC of HPLC. Daarnaast kan het bemonsteren van zeer grote hele wortelsystemen van grotere planten (bijv. bomen of struiken) erg uitdagend zijn vanwege de moeilijkheden bij het produceren van zeer grote ZrOH-hydrogels (>30 cm). Dit is echter een probleem in alle huidige exsudate-bemonsteringstechnieken⁸. Een verdere beperking is het gebruik van rhizofosen. Hoewel plantengroei in rhizofosen veel realistischer is dan in hydroponische systemen⁸, blijft het een kunstmatige opstelling, met beperkte driedimensionale ruimte voor wortelontwikkeling³³. Bovendien vindt bemonstering plaats op een 2D-oppervlak, wat theoretisch kan leiden tot verlies van carboxylaten die in andere richtingen worden uitgescheiden die niet in contact zijn met de gels. Deze beperking kan echter worden gecompenseerd door diffusie, een hogere bindingscapaciteit van ZrOH-hydrogels voor de carboxylaten, en het hoge watergehalte van de rhizosfeerbodem tijdens de toepassing. Er zijn echter aanvullende validaties nodig om deze aspecten te bepalen.

De ZrOH-hydrogelmethode voor het bemonsteren van wortelvrijgegeven carboxylaten biedt verschillende voordelen ten opzichte van de gangbare methoden (d.w.z. bodem-hydroponische hybride en hydroponische benaderingen). Deze nieuwe benadering maakt in-situ bemonstering van carboxylaten uit ongestoorde bodemgegroeide wortelsystemen mogelijk, tijdsresolusie (Santner, Mühlbacher et al., ongepubliceerde gegevens) en mm-schaal 2D-mapping. Daarnaast kunnen ZrOH-hydrogels minimaal 24 uur^{en 12 uur op} wortels worden toegepast. Ook zou herhaald bemonsteren van hetzelfde wortelsegment over langere tijdsresoluties mogelijk moeten zijn. Deze methode is veel beter ontwikkeld en gekarakteriseerd dan vergelijkbare methoden, zoals het toepassen van filterartikelen⁸. Langdurige bemonstering is mogelijk met de ZrOH-hydrogels vanwege een hoge gelcapaciteit voor carboxylaten, bijvoorbeeld van het laagste bij 0,44 μmol ^cm-2 ± 0,04 μmol cm⁻² gel voor malaat tot het hoogste van 1,66 μmol ^cm-2 ± 0,10 μmol cm⁻² voor succinaat bij pH 4,00 met een totaal van 3,29 μmol ^cm-2 ± 0,40 μmol cm⁻² wanneer de carboxylaten worden gemengd (zie Aanvullende Tabel 1). Het weglaten van de wortelwasstap (die doorgaans 20–30 minuten per plant duurt) in de bodem-hydroponische hybride methode vermindert de schade aan het wortelstelsel en de bijbehorende vooringenomenheid aanzienlijk, wat resulteert in realistischere en representatievere gegevens.

Opmerkelijk is dat de geladen ZrOH-hydrogels geen speciale opslagomstandigheden vereisen, alleen koeling, en we hebben tot nu toe geen preconcentratie na eluering in onze toepassingen gevonden. ZrOH-hydrogels binden ook andere anionen, die onder dezelfde omstandigheden worden geëlueerd en kunnen worden geanalyseerd met IC^14,34. Dit maakt het mogelijk om carboxylaat-exsude te koppelen aan de ruimtelijke verdeling van voedingsstoffen in de rhizosfeer²⁹.

Samenvattend is deze nieuwe benadering van het bemonsteren van wortelvrijgegeven carboxylaten een fundamentele stap voor het onderzoek naar de rhizosfeer. Aangezien carboxylaten een cruciale rol spelen bij de mobilisatie en verwerving van plantvoedingsstoffen (bijv. P, Fe)^35,36, evenals bij de werving van nuttige micro-organismen, kan deze methode worden gebruikt om variëteiten te screenen op worteleigenschappen en plantenveredeling.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	Sigma-Aldrich		70%
Oxaalzuur	Sigma-Aldrich	194131-250G	98%
trans-Aconitinezuur	Sigma-Aldrich	122750-25G	98%
Zirconium dichlooroxide octahydraat (ZrOCl2 × 8H2O, 98%)	Thermo Scientific	A12342.22	98%
Citroenzuur	Sigma-Aldrich	C83155-500G	99%
Natriumnitraat	VWR Chemicals	Lot No: 19H224150	100%
Salpeterzuur (HNO3)	Sigma-Aldrich	CAS-No: 7697-37-2	>65% voor analyse EMSURE® Reag. Ph Eur,ISO
Fumaarzuur	Sigma-Aldrich	240745-100G	>99%
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	S8045-500G	≥98%
Ammoniumpersulfaat (APS_(NH4)2S2O8)	Thermo Scientific	201531000	≥98.0%, extra puur, voor elektroforese
Bernsteenzuur	Sigma-Aldrich	S3674-100G	≥99%
2-(N-morfolino)-ethaansulfonzuur (MES) Buffer	Sigma-Aldrich	M8250-250G	≥99.5%
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	71376-1KG	≥99.5%
Cross linker	DGT Research Ltd (Lancaster, UK)	na	2%, agarosederivaat
Plate of Horizontal shaker			Any
Ionchromatografie of IC-MS	Thermo Fischer Scientific	na	Elke hoge- of ultraprestatie vloeistofchromatografie (HPLC of UHPLC) kan worden gebruikt in combinatie met verschillende detectoren, waaronder geavanceerde MS (bijv. time-of-flight of Orbitrap) of spectrofotometrische detectoren
pH-meter			Elke laboratorium-pH-elektrode kan worden gebruikt
Oven	Binder	na	Elke kleine oven die een specifieke temperatuur kan handhaven, kan worden gebruikt, bij voorkeur een kleinere.
Nylonfilters_13 mm 0,45 µM	GVS Filter Technology	Lot No: 7135431	Grotere nylonfilters kunnen ook worden gebruikt, maar kleinere worden bij voorkeur gebruikt omdat het eluaatvolume klein is.
Calciumsulfaatdihydraat	Sigma-Aldrich	C3771-1KG /CAS-No: 10101-41-4	CaSO4 kan ook worden gebruikt.
Acryamide-oplossing, 40%	G-Biosciences	786-508	Gebruik geen acrylamide-oplossing die is gemengd met  Bis-acrylamide. Giftige verbinding die voorzichtig moet worden behandeld in een afzuigkap.
Rhizoboxes	https://www.rhizosphere.com/	na	Onze rhizoboxes zijn op maat gemaakt op basis van het ontwerp van Rhizosphere.com
Polypropyleen glasjesset, 1,5 mL	Thermo Scientific	79812	Kunststof IC-glaasjes worden geprefereerd omdat ze kunnen worden ingevroren zonder te breken. 330 µL kan ook worden gebruikt, maar er moet voor worden gezorgd dat er geen luchtbel is
cis-Aconitinezuur	Thermo Scientific	A16010.06	tech. 85%
N,N,N’,N’- tetramethylethyleendiamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	Lot No: BCBN1173V	Giftige verbinding die voorzichtig moet worden behandeld
250 mL PP-buisjes	Sarstedt	Lot No:2406082
Aluminiumfolie	Locale supermarkt	na
Bekers_1 L/ 2 L
Klemmen	Locale magazijn	na
Glazen plaat (6,1 x 17 x 0,4 cm)	Locale magazijn	na
L-(-)-Appelzuur	Sigma-Aldrich	M6413-25G
Lactaatstandaard voor IC	Sigma-Aldrich	07096-100ML
Laminaire stromingsbank
L-Melkzuur watervrij	Thermo Scientific	L13242.14
Nuclepore Track-etch membraan_0,2 µm	Cytiva	Lot No: A29983896
Kunststoffolie/kunststofzakken	Locale magazijn	na
Kunststof pincetten	Semadeni	602
Plexiglas plaat	Locale magazijn	na
PP 30 mL-buisjes	Aptaca spa	Lot No: 250552
PTFE-afstandsstuk_0,25/0,4 mm	https://www.krishplasticindustries.com/teflon-sheet.html
Scheermessen	Locale magazijn	na
Lineaal	Locale boekwinkel	na
Natriumhypochloriet (NaClO)	CARLO ERBA Reagents	CAS-No: 7681-52-9
Spuiten_1 mL	HENKE SASS WOLF (HENKE-JET)	Lot No: 22A17C8
Vinyl kleefband	Locale magazijn	na