Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Postoperatief herstel en stabiliteit van chronische intracraniële multielectrode elektro-encefalografie bij ratten

153 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/69937

⸱

24 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Core Facility Center, Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Intensive Care Unit, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 3Department of Neurosurgery, Anesthesiology, Beijing Sanbo Brain Hospital, Capital Medical University, 4First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, 5Department of Cardiology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 6Institute of Heart Lung and Blood Vessel Disease, Beijing Key Laboratory of Precision Medicine of Coronary Atherosclerotic Disease, Clinical center for coronary heart disease, Capital Medical University, 7Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University, 8Department of Physiology, Amsterdam University Medical Centre

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst een gestandaardiseerd kader voor postoperatieve evaluatie na chronische multi-elektrode EEG-implantatie bij ratten, inclusief sequentiële monitoring van signaalkwaliteit, gedragsherstel en neuro-inflammatoire markers om de juiste start van stabiele langetermijnopnames te bepalen.

Samenvatting

Intracraniële multi-elektrode implantatie maakt gelijktijdige acquisitie van neurale signalen over hersengebieden mogelijk, maar introduceert postoperatieve verstoringen die de datakwaliteit en experimentele timing kunnen beïnvloeden. Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde workflow voor chronische multi-site intracraniële EEG-elektrodeimplantatie en gestructureerde post-implantatie beoordeling bij ratten van Sprague–Dawley. Wolfraamdraadelektroden worden stereotactisch geïmplanteerd op drie vooraf gedefinieerde intracraniële locaties (anterieure cingulate cortex, hippocampus CA1 en entorhinale cortex) met behulp van een chirurgische strategie die is ontworpen om weefselverstoring te minimaliseren.

Na implantatie specificeert het protocol longitudinale evaluatie over vijf domeinen: nauwkeurigheid van elektrodelokalisatie, integriteit van lokaal veldpotentiaal, pijngerelateerd gedrag, voedingsgedrag en neuro-inflammatoire markers. Elektrofysiologische en gedragsbeoordelingen worden uitgevoerd op vooraf gedefinieerde postoperatieve tijdstippen (baseline en postoperatieve dagen 1, 4, 7, 10 en 13) om consistente monitoring van vroege postoperatieve effecten te ondersteunen (n = 3). Histologische analyses worden gebruikt om lokale weefselresponsen aan het einde van de studie te karakteriseren (n = 3 per tijdstip).

Operationele criteria en beoordelingsintervallen worden gegeven om beslissingen te sturen over de gereedheid van experimentele opnames en het starten van langetermijnopnames. Dit protocol biedt een gestructureerde benadering van postimplantatiemonitoring en informeert de juiste timing van downstream neurofysiologische experimenten.

Inleiding

Intracraniële elektro-encefalografie (EEG) maakt hoogresolutiemeting van neurale activiteit mogelijk door signalen direct van hersenweefsel 1,2 op te nemen, wat voordelen biedt in ruimtelijke specificiteit en signaalnauwkeurigheid ten opzichte van hoofdhuid-EEG-benaderingen3. Intracraniële opnames in meerdere regio's bieden inzicht in netwerkinteracties, die veel worden gebruikt om neurale dynamiek ten grondslag aan cognitie en ziekte te onderzoeken en vaak worden toegepast in knaagdiermodellen voor mechanistische en longitudinale studies 4,5.

Wolfraamdraadelektroden worden vaak gebruikt voor chronische opnames vanwege hun mechanische stabiliteit en biocompatibiliteit 6,7,8. Implantatie vereist echter invasieve chirurgie die tijdelijk de neurale fysiologie, weefselintegriteit en diergedrag kan verstoren 9,10,11. Uitdagingen zoals acute chirurgische stress, lokale ontsteking, gliale reacties en veranderingen in voedings- of nociceptief gedrag kunnen de signaalkwaliteit en experimentele interpretatie tijdens de vroege post-implantatieperiodebeïnvloeden 12,13,14. Deze herstelperiode blijft echter grotendeels empirisch, met gerapporteerde herstelvensters variërend van 5 tot 7 dagen15,16. Langdurige vertragingen daarentegen kunnen extra verwarringen veroorzaken die verband houden met weefselremodellering of elektrodeverplaatsing17.

Ondanks het wijdverbreide gebruik van chronisch intracraniële EEG is er geen gestandaardiseerd kader voor postimplantatiemonitoring dat elektrofysiologische, gedrags-, ontstekings- en histologische beoordelingen integreert om de experimentele timing te informeren. Daarom pakt het huidige protocol deze kloof aan door een gestructureerde aanpak te beschrijven voor het evalueren van post-implantatie status in een chronisch intracraniaal multi-elektrode implantatiemodel bij verdoofde Sprague–Dawley (SD) ratten (6 weken oud). Met behulp van wolfraamdraadelektroden geïmplanteerd in de anterieure cingulate cortex (Cg1), hippocampus CA1 en entorhinale cortex (EC), specificeert het protocol longitudinale beoordeling van elektrodestabiliteit, EEG-signaalkenmerken, gedragsindicatoren en ontstekingsmarkers over een periode van twee weken. Hoewel beoordelingen onder algehele narcose worden uitgevoerd voor praktisch gemak, beïnvloedt deze aanpak het primaire doel van het opzetten van een kader voor elektrodeimplantatie en stabiliteit niet. Dit protocol is bedoeld om postoperatieve monitoring te sturen en consistente tijdstippen te ondersteunen voor het starten van downstream neurofysiologische studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierlijke procedures zijn uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Capital Medical University (Approval ID: AEEI-2024-391).

1. Diervoorbereiding

  1. Haal 6 weken oude mannelijke SD-ratten (lichaamsgewicht 220–230 g). Houd de dieren in een specifieke, pathogeenvrije omgeving (24 ± 2 °C, 50 ± 10% luchtvochtigheid, 12 uur licht/donker cyclus). Voorzie voedsel en water ad libitum. Acklimatiseer de ratten gedurende 7 dagen voorafgaand aan de operatie.
  2. Na de implantatie van elektroden worden huisratten individueel onder dezelfde omgevingsomstandigheden gebruikt om schade aan het hoofdpodium te voorkomen.
    OPMERKING: Het studiestroomdiagram en de bijbehorende metingen worden weergegeven in Figuur 1A. Reagentia en apparatuur zijn vermeld in de Materiaaltabel.

2. Multi-elektrode implantatiechirurgie

  1. Verdoof ratten met isoflurane (3–4% inductie, 2% onderhoud) toegediend met zuurstof bij 2 L/min.
  2. Plaats de rat in een stereotactisch frame en houd de lichaamstemperatuur op 37 °C met een thermostatisch geregeld verwarmingskussen. Breng erytromycine oogzalf aan om hoornvliesdrooging te voorkomen.
  3. Schaf de hoofdhuid en desinfecteer met 0,5% jodofooroplossing.
  4. Maak een incisie in de hoofdhuid in het midden (1 × 2 cm) om de schedel bloot te leggen en verwijder voorzichtig het periost met steriele wattenstaafjes.
  5. Schedelvoorbereiding en boren
    1. Identificeer bregma en lambda en richt de schedel in zowel de voor-achterste als mediale–laterale vlakken.
    2. Boor braamgaten (≤2 mm diameter) op de doelcoördinaten met een langzaam tandheelkundige boor en intermitterende zoutwaterirrigatie.
  6. Elektrodevoorbereiding en -invoeging
    1. Gebruik polyimide-geïsoleerde wolfraamdraadelektroden (schachtdiameter: 300 μm) met een blootgestelde tiplengte van 4–8 mm (vlak afgesneden uiteinde). Meet elektrodeimpedantie (| Z|) bij 1 kHz; acceptabele waarden variëren van 7–10 kΩ met een fasehoek van 1°–2°.
    2. Plaats langzaam elektroden in de volgende gebieden: Cg1 (voorste cingulate cortex): AP +1,2 mm, ML −0,2 mm, DV −2,4 mm; CA1 (hippocampus): AP −3,3 mm, ML −1,8 mm, DV −3,0 mm; EC (entorhinale cortex): AP −6,7 mm, ML −4,0 mm, DV −8,0 mm.
    3. Implanteer één roestvrijstalen schedelschroef over het contralaterale CA1-gebied en gebruik deze als aardelektrode.
  7. Fixatie en sluiting van elektroden
    1. Controleer de juiste elektrodediepte en richting met behulp van stereotaxische coördinaten tijdens implantatie; bevestig de elektrodelokalisatie post hoc door histologische identificatie van elektrodesporen.
    2. Bevestig elektroden en schroeven met tandhars (uithard 30–60 s per laag).
    3. Verbind elektrode leidt naar een headstage-connector en hecht de omliggende huid.
  8. Noteer de basislijn EEG-activiteit gedurende 30 minuten op het overeenkomstige tijdstip (Figuur 1A) terwijl je de anesthesie behoudt.

3. Postoperatieve zorg en behandeling

  1. Laat ratten herstellen op een verwarmingspad totdat ze volledig mobiel zijn.
  2. Huisratten onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheid met zacht bodembedekking en ad libitum toegang tot voedsel en water om stress te verminderen.
  3. Controleer dagelijks de incisieplaatsen, de stabiliteit van de elektrode en de integriteit van het hoofd.
  4. Huisdieren individueel, dagelijkse wondverzorging bieden (0,5% jodofoplossing) en het welzijn monitoren zonder farmacologische middelen om verstorende effecten te voorkomen, in lijn met eerdere studies 6,18.

4. Longitudinale EEG-opname

  1. Voer EEG-opnames uit op dag 1, 4, 7, 10 en 13 na implantatie.
  2. Verdoof ratten met isoflurane (3–4% inductie, 1,5% onderhoud).
  3. Stabiliseer opnamekabels om bewegingsartefacten en elektromagnetische ruis te minimaliseren.
  4. Neem een EEG op voor 30 minuten vanaf 9:00 uur om de circadiane variabiliteit te controleren.
  5. Gebruik de volgende verwerfparameters: bemonsteringsfrequentie: 1.000 Hz; hardware banddoorlaatfilter: 0,5–40 Hz; versterking: 8–10. Voer extra filtering en artefactafwijzing offline uit.
  6. Acceptabele EEG-signalen tonen stabiele baselines, minimale ruis of drift, en fysiologisch plausibele amplitude- en frequentieinhoud; opnames die niet aan deze criteria voldoen uitsluiten.

5. EEG-signaalanalyse

  1. Analyseer EEG-signalen met behulp van de gerefereerde software.
  2. Inspecteer signalen visueel en verwijder segmenten met bewegings- of elektrische artefacten.
  3. Bereken de vermogensspectrale dichtheid (PSD) met behulp van FFT (pwelch-functie).
  4. Kwantificeer oscillerende activiteit door het oppervlak onder de PSD-curve (AUCpsd) te berekenen voor vooraf gedefinieerde frequentiebanden.
  5. Bereken de signaal-ruisverhouding (SNR) als de verhouding van vermogen in de doelsignaalband (0,5–40 Hz) tot de achtergrondruisband (40–80 Hz).
    OPMERKING: Stabiele signalen vertonen consistente PSD-profielen over opeenvolgende registratiedagen.

6. Pijnbeoordeling

  1. Beoordeel de pijn met behulp van de Rat Grimace Scale19,20 één dag voor de operatie (baseline) en op alle opnamedagen.
  2. Gebruik een observatiekamer (25 cm × 15 cm × 15 cm) en plaats de camera linksboven onder een hoek van 45°.
  3. Maak gezichtsfoto's, randomiseer de volgorde van beelden en beoordeel orbitale vernauwing, neus/wang platdrukken, snorharenveranderingen en oorpositie (schaal 0–2).
  4. Som-scores genereren een totale pijnscore per dier per tijdstip.

7. Voedingsgedrag en lichaamsgewicht

  1. Weeg ratten en meet dagelijks de voedselinname. Bereken de voedselinname door de resterende maaltijd af te trekken van vooraf gewogen voedsel na 24 uur.
  2. Neem het gedrag van ratten continu 24 uur vast met behulp van een video-opnamesysteem. Analyseer het voedingsgedrag offline door experimentatoren die blind zijn voor experimentele omstandigheden.
  3. Houd het voeden continu in de gaten. Definieer een voedersessie als ≥1 gebeurtenis die 5 s–15 minuten21 duurt.
  4. Bereken de lichaamsgewicht-gecorrigeerde inname (g × 100/g lichaamsgewicht); gemiddelde inname per maaltijd (g/aantal maaltijden); en innamesnelheid (g/totale voedingsduur in min).

8. Beoordeling van neuroontsteking

  1. Euthanaser ratten met een overdosis isoflurane gevolgd door onthoofding.
  2. Verzamel hersenweefsel uit geïmplanteerde hemisferen op de basis- en postoperatieve dagen 1, 4, 7, 10 en 13 (n = 3 per tijdstip).
  3. Westelijke verplettering
    1. Haal het totale eiwit uit hersenweefsel en kwantificeer de eiwitconcentratie met een bicinchonininezuur (BCA) assay. Pas alle monsters aan op een eindconcentratie van 2 μg/μL en denatureer bij 100 °C gedurende 5 minuten.
    2. Splits eiwitten met 10% SDS-PAGE bij 120 V gedurende 90 minuten, laad 20 μg eiwit per lane.
    3. Eiwitten worden gedurende 1 uur overgebracht op een PVDF-membraan bij 300 mA.
    4. Blokkeer membranen en incubeer 's nachts bij 4 °C met primaire antilichamen tegen tumornecrosefactor-α (TNF-α) en interleukine-6 (IL-6) (1:1.000).
    5. Incubeer met HRP-geconjugeerde secundaire antistof (1:20.000, 2 uur, kamertemperatuur).
    6. Visualiseer banden met ECL en beeld met een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem met de automatische belichtingsmodus.
    7. Voer densitometrie uit met ImageJ.

9. Veiligheid en afvalverwerking

  1. Behandel isofluraan met een actief opvangsysteem.
  2. Verwijder scherpe voorwerpen en biologische weefsels in aangewezen biohazard-containers.
  3. Verwijder chemische reagentia volgens de institutionele veiligheidsvoorschriften.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Alle 21 SD-ratten tolereerden intracraniële elektrodeimplantatie en voltooiden het studieprotocol. Longitudinale metingen (EEG, lichaamsgewicht, voedingsgedrag en pijnscores) werden verzameld van dezelfde dieren over tijdstippen (n = 3), terwijl neuro-inflammatoire beoordelingen op elk tijdstip terminale metingen waren (n = 3 ratten per dag: baseline, 1, 4, 7, 10, 13). De gegevens werden beoordeeld op normaliteit met Shapiro-Wilk-tests. Normaal verdeelde gegevens worden uitgedrukt als ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Chronische intracraniële elektrodeimplantatie voor EEG-monitoring bij knaagdieren blijft een hoeksteentechniek voor het onderzoeken van neurale dynamiek met hoge temporele resolutie. Het vaststellen van een passend postoperatief monitorings- en herstelvenster is cruciaal om zowel signaalbetrouwbaarheid als dierenwelzijn te waarborgen. Deze studie biedt een gestructureerd kader voor het evalueren van elektrofysiologische stabiliteit, gedragsuitkomsten en ontstekingsreacties na multi-elekt...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Excellent Young Talents Project van de Capital Medical University (A2308).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Active isofluorane scavening systemRDWR510-31-6
AnimalsCharles River
BCA assay kitSolarbioPC0020
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad17001401
Dental resinVertexXG473P03
ECL detection reagentSolarbioPE0010
Erythromycin eye ointmentRenhe1.00E+11
Goat anti-rabbit secondary antibodyProteintechSA00001-2
GraphPad Prism 9.0GraphPad Softwarestatistisch analysesoftware
Headstage amplifierBIOPAC Systems IncEEG100C
Heating padYuYan technologyS-100
ImageJNational Institutes of Healthbeeldanalysesoftware
IL-6 polyclonal antibodyProteintech21865-1-AP
IodophoreCleanboom430-DFXDY100
IsofluraneRWDR510–31
Neuro-recording device with NeuroExplorer (v 5.012)PlexonOPX-A1600-128-16Celektrofysiologisch gegevensanalysesoftware
PVDF membraneCytivaRPN303F
SDS-PAGE SystemBio-Rad1658004
Stereotaxic apparatusZhongShi science technologyZS-PDC
TNF-αpolyclonal antibodyProteintech17590-1-AP
Transfer ApparatusBio-Rad1703937
Tungsten wireA-M Systems785500
Video recording systemBasleracA1920
β-actin monoclonal antibodyProteintech2D4H5

Referenties

  1. Adewole, D. O., et al. The evolution of neuroprosthetic interfaces. Crit Rev Biomed Eng. 44 (1-2), 123-152 (2016).
  2. Patil, A. C., Thakor, N. V. Implantable neurotechnologies: a review of micro- and nanoelectrodes for neural recording. Med Biol Eng Comput. 54 (1), 23-44 (2016).
  3. Ball, T., Kern, M., Mutschler, I., Aertsen, A., Schulze-Bonhage, A. Signal quality of simultaneously recorded invasive and non-invasive EEG. Neuroimage. 46 (3), 708-716 (2009).
  4. Gao, R., Peterson, E. J., Voytek, B. Inferring synaptic excitation/inhibition balance from field potentials. Neuroimage. 158, 70-78 (2017).
  5. Wang, Z., Peng, Y. B. Multi-region local field potential signatures in response to the formalin-induced inflammatory stimulus in male rats. Brain Res. 1778, 147779(2022).
  6. Morales-Villagrán, A., Medina-Ceja, L., López-Pérez, S. J. Simultaneous glutamate and EEG activity measurements during seizures in rat hippocampal region with the use of an electrochemical biosensor. J Neurosci Methods. 168 (1), 48-53 (2008).
  7. Bragin, A., Azizyan, A., Almajano, J., Wilson, C. L., Engel, J. Jr Analysis of chronic seizure onsets after intrahippocampal kainic acid injection in freely moving rats. Epilepsia. 46 (10), 1592-1598 (2005).
  8. Andiné, P., Rudolphi, K. A., Fredholm, B. B., Hagberg, H. Effect of propentofylline (HWA 285) on extracellular purines and excitatory amino acids in CA1 of rat hippocampus during transient ischaemia. Br J Pharmacol. 100 (4), 814-818 (1990).
  9. Jech, R., et al. Deep brain stimulation of the subthalamic nucleus affects resting EEG and visual evoked potentials in Parkinson's disease. Clin Neurophysiol. 117 (5), 1017-1028 (2006).
  10. Makowiecki, K., Garrett, A., Clark, V., Graham, S. L., Rodger, J. Reliability of VEP recordings using chronically implanted screw electrodes in mice. Transl Vis Sci Technol. 4 (2), 15(2015).
  11. York, M. K., et al. Cognitive declines following bilateral subthalamic nucleus deep brain stimulation for the treatment of Parkinson's disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 79 (7), 789-795 (2008).
  12. Zhang, D., et al. Tenuigenin promotes non-rapid eye movement sleep via the GABA(A) receptor and exerts somnogenic effect in a MPTP mouse model of Parkinson's disease. Biomed Pharmacother. 165, 115259(2023).
  13. Sun, X., et al. Longitudinal analysis of sleep-wake states in neonatal rats subjected to hypoxia-ischemia. Nat Sci Sleep. 14, 335-346 (2022).
  14. Rensing, N., Moy, B., Friedman, J. L., Galindo, R., Wong, M. Longitudinal analysis of developmental changes in electroencephalography patterns and sleep-wake states of the neonatal mouse. PLoS One. 13 (11), e0207031(2018).
  15. Bastianini, S., et al. Ageing-related modification of sleep and breathing in orexin-knockout narcoleptic mice. J Sleep Res. 34 (2), e14287(2025).
  16. Cao, Q., et al. a saponin derived from Radix Polygalae, exhibits sleep-enhancing effects in mice. Phytomedicine. 23 (14), 1797-1805 (2016).
  17. Chiprés-Tinajero, G. A., Núñez-Ochoa, M. A., Medina-Ceja, L. Changes in physiological and pathological behaviours produced by deep microelectrode implantation surgery in rats: a temporal analysis. Behav Neurol. 2020, 4385706(2020).
  18. Bragin, A., et al. Pathologic electrographic changes after experimental traumatic brain injury. Epilepsia. 57 (5), 735-745 (2016).
  19. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Front Mol Neurosci. 10, 284(2017).
  20. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  21. Barahona, M. J., Rojas, J., Uribe, E. A., García-Robles, M. A. Tympanic membrane rupture during stereotaxic surgery disturbs the normal feeding behavior in rats. Front Behav Neurosci. 14, 591204(2020).
  22. Moss, J., Ryder, T., Aziz, T. Z., Graeber, M. B., Bain, P. G. Electron microscopy of tissue adherent to explanted electrodes in dystonia and Parkinson's. Brain. 127 (Pt 12), 2755-2763 (2004).
  23. Kronenbuerger, M., et al. Brain alterations with deep brain stimulation: new insight from a neuropathological case series. Mov Disord. 30 (8), 1125-1130 (2015).
  24. Bishop, B. Neural plasticity: part 3. Responses to lesions in the peripheral nervous system. Phys Ther. 62 (9), 1275-1282 (1982).
  25. Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in epilepsy: heterogeneity and hub cells in network synchronization. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (11), a022889(2015).
  26. Gaire, J., et al. The role of inflammation on the functionality of intracortical microelectrodes. J Neural Eng. 15 (6), 066027(2018).
  27. Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. J Neurosci Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
  28. McConnell, G. C., et al. Implanted neural electrodes cause chronic, local inflammation that is correlated with local neurodegeneration. J Neural Eng. 6 (5), 056003(2009).
  29. Radeen, K. R., et al. A cost-effective and minimally invasive protocol for chronic multi-site electroencephalography recording in freely moving mice. J Vis Exp. (224), e69314(2025).
  30. Gulino, M., Kim, D., Pané, S., Santos, S. D., Pêgo, A. P. Tissue response to neural implants: the use of model systems toward new design solutions of implantable microelectrodes. Front Neurosci. 13, 689(2019).
  31. Green, R. A., Lovell, N. H., Wallace, G. G., Poole-Warren, L. A. Conducting polymers for neural interfaces: challenges in developing an effective long-term implant. Biomaterials. 29 (24-25), 3393-3399 (2008).
  32. Wang, Z., et al. Cortical complexity and connectivity during isoflurane-induced general anesthesia: a rat study. J Neural Eng. 19 (3), 036012(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Intracraniaal EEGimplantatie van meerdere elektrodenchronische registratielokalisatie van elektrodenlokaal veldpotentieelpijngedragvoedingsgedragneuro inflammatoire markershistologische analyse
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.