Method Article

Invloed van verschillende extractiemethoden op de in vitro bioactiviteitsprofielen van Terfezia claveryi

DOI:

10.3791/69950

⸱

March 20th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics, Department of Basic Medical Sciences, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Genetics and Bioengineering, Faculty of Engineering and Architecture, Kirsehir Ahi Evran University, 3Department of Physiology, Gulhane Faculty of Medicine, University of Health Sciences, 4Department of Medical Services and Techniques, Medical Laboratory Techniques Program, Vocational School of Health Services, Kirsehir Ahi Evran University, 5Department of Field Crops, Faculty of Agriculture, Kirsehir Ahi Evran University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De in vitro bioactiviteit van Terfezia claveryi-extracten was afhankelijk van de biofysische extractiemethode en de polariteit van het oplosmiddel. Het waterextract uit maceratie-geassisteerde extractie (MAE) vertoonde de sterkste antioxidantactiviteit, terwijl het Soxhlet-extractie (SE) extract een grotere cytotoxiciteit veroorzaakte in SH-SY5Y-cellen. Deze resultaten tonen duidelijke methode-afhankelijke verschillen aan in de in vitro bioactiviteit van Terfezia claveryi-extracten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terfezia claveryi is een eetbare woestijntruffel die traditioneel wordt gegeten in droge gebieden. In de afgelopen jaren heeft het toenemende wetenschappelijke belangstelling gekregen vanwege de potentiële antioxidanten, antimicrobiële en therapeutische eigenschappen, wat op mogelijke toepassingen in voedings- en gezondheidsgerelateerde vakgebieden wijst. Ondanks groeiend bewijs voor het biologische potentieel ervan, is de invloed van verschillende extractiestrategieën op het terugwinnen van bioactieve verbindingen en het resulterende in vitro bioactiviteitsprofiel van Terfezia claveryi nog niet opgehelderd in de literatuur. In deze studie werd de in vitro bioactiviteit van Terfezia claveryi-extracten verkregen met verschillende extractiemethoden en oplosmiddelen met verschillende polariteit geëvalueerd. De extractieopbrengst werd bepaald en de verkregen extracten werden beoordeeld op antioxidante, antimicrobiele, antibiofilm- en cytotoxische activiteiten met behulp van gevestigde testsystemen. De antioxidantcapaciteit werd gemeten met 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur) (ABTS) en ferric reducing antioxidant power (FRAP) tests, terwijl cytotoxische effecten werden onderzocht in SH-SY5Y neuroblastoomcellen. De extractieopbrengst varieerde afhankelijk van zowel methode als de polariteit van het oplosmiddel, waarbij de hoogste opbrengst werd verkregen uit het waterige extract dat met de ultrasone extractiemethode (VAE) werd bereid (18,40%). Er werd vastgesteld dat de antioxidantactiviteit significante verschillen vertoonde afhankelijk van de extractiemethode, en waterige extracten verkregen met de maceratie-geassisteerde extractie (MAE) methode vertoonden een profiel rijk aan fenolische verbindingen samen met het sterkste radicaalafzuigvermogen. LC-MS/MS-analyse van dit extract toonde de aanwezigheid van negen fenolverbindingen aan; Chinezuur en chlorogeenzuur werden geïdentificeerd als de dominante componenten. Daarentegen veroorzaakten extracten uit Soxhlet grotere cytotoxische effecten in SH-SY5Y-cellen. Antimicrobiële en antibiofilmresponsen vertoonden relatief beperkte variatie tussen extractiemethoden, wat wijst op een zwakkere afhankelijkheid van extractiestrategie voor deze activiteiten. Al met al tonen deze bevindingen aan dat de biofysische extractiemethode en de selectie van oplosmiddelen cruciale factoren zijn voor het in vitro bioactiviteitsprofiel van Terfezia claveryi-extracten , met uitgesproken effecten waargenomen voor antioxidant- en cytotoxische activiteiten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van verschillende paddenstoelensoorten om de gezondheid te verbeteren en ziekten te voorkomen en te behandelen gaat terug tot de oudheid 1,2,3. Macroschimmels worden over het algemeen ingedeeld in twee groepen: epigeus (paddenstoelen) en hypogeïsch (truffels)4. Bekend als de woestijntruffel, is Terfezia claveryi (T. claveryi) een wereldberoemde en eetbare truffelsoort die behoort tot het geslacht Terfezia5. T. claveryi komt veel voor in droge en semi-aride gebieden waar Helianthemum-soorten veel voorkomen: 6,7,8,9,10,11. In de afgelopen jaren is de wereldwijde last van chronische ziekten zoals kanker en neurodegeneratieve aandoeningen aanzienlijk toegenomen, wat de dringende behoefte aan nieuwe, veilige en effectieve therapeutische middelen benadrukt. Volgens wereldwijde gezondheidsrapporten blijft kanker een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd, terwijl neurodegeneratieve ziekten blijven toenemen naast een vergrijzende bevolking. Gezien dit groeiende volksgezondheidsprobleem is het onderzoeken van natuurlijke producten afkomstig van schimmels en medicinale planten als potentiële bronnen van bioactieve verbindingen een belangrijke onderzoeksprioriteit12 geworden.

Tegelijkertijd vormt de snelle opkomst van antimicrobiële resistentie een andere grote bedreiging voor de wereldgezondheid. Resistentie tegen geneesmiddelen heeft de effectiviteit van traditionele antibiotica aanzienlijk verminderd, waardoor er dringend behoefte is aan alternatieve antimicrobiële strategieën13. Secundaire metabolieten afkomstig van natuurlijke bronnen, met name fenolische en polyfenolische verbindingen, trekken toenemende belangstelling vanwege hun diverse antimicrobiële mechanismen en lage neiging om resistentie te ontwikkelen14. Oxidatieve stress is een fundamentele mechanistische factor die ten grondslag ligt aan veel chronische ziekten, waaronder kanker, neurodegeneratieve aandoeningen en metabole syndromen. Overmatige productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) kan uiteindelijk de cellulaire homeostase verstoren door DNA-schade, lipideveroksidatie en eiwitoxidatie te veroorzaken. In deze context worden natuurlijke antioxidanten die vrije radicalen kunnen opvangen en de redoxbalans kunnen reguleren als veelbelovende middelen beschouwd om oxidatieve schade en ziekteprogressie te beperken15.

Truffels zijn rijk aan onverzadigde vetzuren, eiwitten, mineralen, vitaminen, aminozuren, fenolen en polyfenolen, componenten die in verband worden gebracht met antimicrobiële, antioxiderende en antikanker eigenschappen 16,17,18,19,20,21,22,23,24. Hun antioxidantcapaciteit is gekoppeld aan hun effectiviteit bij het ophalen van vrije radicalen 25,26,27. Onder truffelsoorten is T. claveryi bijzonder opmerkelijk vanwege zijn eetbare structuur, regionale economische waarde en gerapporteerde rijkdom aan fenolverbindingen23. Ondanks opkomend bewijs over het traditionele verbruik en de biologische activiteit, blijven uitgebreide studies die onderzoeken hoe extractiestrategieën de chemische samenstelling en biologische effecten beïnvloeden, beperkt.

Het terugwinnen van biologisch actieve verbindingen uit truffels wordt sterk beïnvloed door extractieparameters, waaronder de toegepaste extractietechniek en de polariteit van het oplosmiddel. Biofysische extractiemethoden zoals ultrageluidsgeassisteerde extractie (VAE), maceratie-geassisteerde extractie (MAE) en Soxhlet-extractie (SE) tonen significante verschillen in termen van energie-invoer, extractie-efficiëntie en selectiviteit voor polaire verbindingen28. Het meeste onderzoek heeft echter vertrouwd op één extractiemethode of beperkte oplosmiddelsystemen, en studies die de effecten van deze methoden op het in vitro biologische activiteitsprofiel van T. claveryi vergelijkend behandelen, zijn beperkt. Daarom vergelijkt deze studie systematisch meerdere biofysische extractiemethoden met oplosmiddelen van verschillende polariteit om de in vitro biologische activiteiten van T. claveryi-extracten te evalueren. Er werd verondersteld dat de extractiemethode en de polariteit van het oplosmiddel zouden leiden tot methode-afhankelijke verschillen in biologische activiteiten. De doelstellingen van de studie zijn dienovereenkomstig: (i) het vergelijken van extractieopbrengsten tussen verschillende methoden en oplosmiddelen, (ii) het evalueren van methode-afhankelijke variatie in antioxidante en cytotoxische activiteiten, en (iii) het onderzoeken van antimicrobiële en antibiofilmreacties, rekening houdend met hun gevoeligheid voor de extractiestrategie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De algehele experimentele workflow voor de bereiding en analyse van T. claveryi-extracten wordt schematisch samengevat in Figuur 1. Alle materialen die in de studie worden gebruikt, worden beschreven in de Materiaalkundige Tabelle.

1. Verificatie en voorbereiding van schimmelmateriaal

  1. Verzameling en verwerking van materiaal
    OPMERKING: Verse T. claveryi-truffels zijn in mei 2023 verzameld van steppe- en zanderige, onbebouwde (niet-agrarische) gronden in de provincie Kırsehir, Centraal-Anatolië, Turkije. De bemonstering werd uitgevoerd op drie verschillende locaties: Dedeli Village (38°54′15,8" N, 34°06′40.3" E; ~1050 m boven zeeniveau), Buyukkayapa Village (38°53′45,1" N, 34°19′37,5" E; ~1020 m boven zeeniveau) en Akcaagıl Village (39°01′39,9" N, 34°12′39,8" E; ~1100 m boven zeeniveau). De verzamellocaties worden gekenmerkt door een semi-aride continentaal klimaat, met koude winters, hete en droge zomers en een gemiddelde jaarlijkse neerslag van ongeveer 380–420 mm. Alle monsters werden tijdens het natuurlijke vruchtseizoen geoogst uit gebieden zonder recente landbouwactiviteiten om mogelijke door de mens veroorzaakte besmetting te minimaliseren.
    1. Selecteer schone en onbeschadigde truffels, pel ze en was drie keer met gedestilleerd water.
    2. Snijd de monsters in kleine stukjes en droog in de schaduw tot een constant gewicht is bereikt (ongeveer 20 dagen).
    3. Verpulver het gedroogde materiaal met een mechanische molen en haal het door een zeef van 328 micron (50 mesh).
    4. Bewaar de bewerkte monsters in ziplockzakken in een koele, droge en donkere omgeving op kamertemperatuur tot verdere analyses.
  2. Moleculaire identificatie van T. claveryi
    1. Isoleer genomisch DNA uit gedroogde T. claveryi-monsters voor moleculaire identificatie.
    2. Beoordeel de DNA-hoeveelheid en zuiverheid spectrofotometrisch.
    3. Voer soortidentificatie polymerasekettingreactie (PCR) uit door het gebied van de interne getranscribeerde spacer (ITS) te amplificeren met universele primers ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) en ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′).
    4. Oplos PCR-versterkingsproducten door elektroforese op een 1,5% agarosegel bereid in 1x TAE-buffer en visualisatie onder UV-verlichting na ethidiumbromidekleuring.
    5. Zuiver single-band PCR-producten volgens de instructies van de fabrikant29. Onderwerp gezuiverde amplicons naar Sanger-sequencing.
    6. Assembleer voor- en achteruit-sequentieleesopdrachten in consensusreeksen met behulp van het contig assembly programme (CAP)-algoritme.
    7. De soortidentiteit werd bevestigd door de vergelijking van de consensus ITS-sequentie met referentiesequenties die beschikbaar zijn in openbare databases.
      OPMERKING: Een voucherexemplaar van T. claveryi werd in de laboratoriumcollectie bewaard voor toekomstige referentie. Soortidentificatie werd bevestigd door ITS-gebaseerde moleculaire analyse (Aanvullend Dossier 1).

2. Bereiding en extractie van schimmelmateriaal

  1. Bereiding van T. Claveryi-extracten
    1. Weeg ongeveer 30 g gedroogd T. claveryi-poeder .
    2. Voeg 150 mL oplosmiddel toe (methanol, aceton, n-hexaan, ethylacetaat of gedestilleerd water) om een constante vaste-vloeistofverhouding te behouden in alle extractiemethoden.
    3. Gebruik analytische oplosmiddelen van analytische kwaliteit voor alle extractieprocedures.
    4. Filter elk extract onder verminderde druk met kwalitatief filterpapier.
    5. Concentreer de filtraten onder verminderde druk bij 30–45 °C met behulp van een roterende verdamper.
    6. Vriesdroog (lyophiliseer) de geconcentreerde extracten totdat volledige verwijdering van het oplosmiddel is bereikt.
    7. Bewaar de gedroogde ruwe extracten bij −20 °C tot verdere analyse.
      OPMERKING: Pas identieke post-extractieprocessen toe op alle monsters om methodologische consistentie en vergelijkbaarheid te waarborgen.
  2. Biofysische extractiemethoden
    1. Maceratie-geassisteerde extractie (MAE)
      1. Plaats het poedervormige T. claveryi-monster in een gesloten extractiecontainer.
      2. Voeg het geselecteerde oplosmiddel toe terwijl je een constante oplosmiddel-vaste verhouding handhaaft.
      3. Incubeer het mengsel op kamertemperatuur onder donkere omstandigheden gedurende 72 uur.
      4. Houd de containers gesloten om verdamping van oplosmiddelen te voorkomen.
      5. Breng geen externe beweging toe tijdens de maceratieperiode.
      6. Laat het mengsel aan het einde van de extractieperiode bezinken.
      7. Filter het extract voordat je verder verwerkt wordt.
    2. Soxhlet-extractie (SE)
      OPMERKING: Zorg voor een goede circulatie van condensorwater en vermijd droge verwarming tijdens reflux.
      1. Plaats het poedervormige monster in een cellulose-extractievingerhoed.
      2. Plaats de vingerhoed in de Soxhlet-extractiekamer, verbonden met een rondbodemfles.
      3. Voeg het geselecteerde oplosmiddel toe aan de kolf terwijl je een constante oplosmiddel-vastestofverhouding aanhoudt.
      4. Verhit het oplosmiddel tot terugvloei met een thermostatisch gereguleerde verwarmingsmantel.
      5. Houd de continu extractie 24 uur in handen.
      6. Houd de extractietemperatuur op het kookpunt van elk oplosmiddel (n-hexaan: 68,7 °C; ethylacetaat: 77,1 °C; methanol: 64,7 °C; aceton: 56 °C; gedestilleerd water: 100 °C).
    3. Ultrasone geassisteerde extractie (VAE)
      OPMERKING: Houd de temperatuur continu in de gaten om oververhitting tijdens de sonicatie te voorkomen.
      1. Plaats het poedervormige T. claveryi-monster in het extractievat.
      2. Voeg het geselecteerde oplosmiddel toe terwijl je een constante oplosmiddel-vaste verhouding handhaaft.
      3. Sonicate het mengsel op een vaste frequentie van 35 kHz en een uitgangsvermogen van 520 W gedurende 25 minuten.
      4. Houd de extractietemperatuur ongeveer 30 °C.
      5. Voeg ijs toe met intervallen van 5 minuten om de temperatuur tijdens de sonicatie binnen 25–28 °C te houden.
  3. Extractie-efficiëntie
    1. Weeg het gedroogde schimmelmateriaal (Wp) voordat het wordt geteist.
    2. Weeg het gedroogde ruwe extract (Wext) na volledige verwijdering van het oplosmiddel.
    3. Bereken de extractie-efficiëntie met behulp van Vergelijking (1).
      figure-protocol-1(1)
    4. Los elk gedroogd ruwe extract opnieuw op in het bijbehorende oplosmiddel om een voorraadoplossing te bereiden bij een gestandaardiseerde concentratie van 10 mg/mL.
    5. Maak bouillonoplossingen vers voor elk in vitro bioactiviteitsexperiment.
      OPMERKING: Standardiseer alle extractconcentraties om vergelijkbare doseringen te garanderen bij latere bioactiviteitsassays.

3. Bepaling van antioxidantactiviteit

  1. Voer antioxidantactiviteitsanalyse uit met behulp van DPPH-, ABTS- en FRAP-assays.
  2. Bereid vijf verschillende extractconcentraties voor van 0,25 tot 1,0 mg/mL uit vers bereide bouillonoplossingen.
  3. Voer alle metingen driemaal uit om reproduceerbaarheid te garanderen.
  4. Neem absorptiewaarden spectrofotometrisch vast met behulp van een microplaatleser.
    OPMERKING: Voer alle assays uit volgens vastgestelde literatuurprotocollen met kleine aanpassingen.
  5. DPPH-radicale aaseringactiviteit
    OPMERKING: De DPPH-radicaalverwijderingsactiviteit van T. claveryi-extracten werd geëvalueerd volgens de in de literatuur beschreven methode, met kleine aanpassingen30. Bescherm DPPH-oplossing en reactiemengsels tegen lichtblootstelling.
    1. Maak een DPPH-oplossing in 70% methanol.
    2. Stel de DPPH-oplossing bij op een absorptie van 1,00 ± 0,02 bij 517 nm.
    3. Pipetteer 50 μL extract bij verschillende concentraties in een microplaatput.
    4. Voeg 250 μL DPPH-oplossing toe aan elke put.
    5. Incubeer het reactiemengsel in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    6. Meet de absorptie bij 517 nm met een microplaatspectrofotometer.
    7. Gebruik methanol als negatieve controle en ascorbinezuur als positieve controle.
    8. Bouw dosis-responscurves en bereken IC₅₀-waarden om radicaal scavenging-activiteit te kwantificeren.
  6. ABTS kationradicaal opschrapingsactiviteit
    OPMERKING: Voer de ABTS radicaal-scavenging assay uit volgens de in de literatuur beschreven methode, met kleine aanpassingen31. Bereid de ABTS⁺ radicaaloplossing minstens 16 uur voor gebruik voor en bescherm deze tegen licht.
    1. Genereer de ABTS-radicaaloplossing door het reactiemengsel 16 uur in het donker bij kamertemperatuur te incuberen.
    2. Verdun 1 mL ABTS-oplossing met 80 mL ethanol vóór de analyse.
    3. Stel de absorptie van de verdunde ABTS-oplossing aan naar 0,80 ± 0,02 bij 734 nm.
    4. Pipetteer 50 μL extract bij verschillende concentraties in een microplaatput.
    5. Voeg 250 μL ABTS-oplossing toe aan elke put.
    6. Incubeer het mengsel 10 minuten op kamertemperatuur.
    7. Meet de absorptie bij 734 nm met een microplaatspectrofotometer.
    8. Bouw dosis-responscurves en bereken IC₅₀-waarden.
  7. Ferric-reducerende antioxidantkracht (FRAP) assay
    OPMERKING: Voer de FRAP-assay uit volgens de methode die in de literatuur is voorgesteld, met kleine aanpassingen32. Bereid het FRAP-reagens vers voor gebruik voor gebruik en bescherm het reactiemengsel tegen licht.
    1. Bereid het FRAP-reagens voor volgens het genoemde protocol.
    2. Pipetteer 20 μL extract bij verschillende concentraties in een microplaatput.
    3. Voeg 280 μL vers bereide FRAP-reagens toe.
    4. Incubeer het reactiemengsel 45 minuten op kamertemperatuur in het donker.
    5. Meet de absorptie bij 593 nm met een microplaatspectrofotometer.
    6. Genereer een kalibratiecurve met Trolox als standaard.
    7. Druk de antioxidantcapaciteit uit als mg Trolox-equivalenten (TE) per gram extract.

4. Analyse van de totale fenolische inhoud (TPC)

OPMERKING: Bepaal het totale fenolische gehalte (TPC) van T. claveryi-extracten met behulp van de Folin–Ciocalteu-methode zoals beschreven in de literatuur, met kleine aanpassingen33. Bescherm de reactiemengsels tegen licht tijdens de incubatie. Maak de natriumcarbonaatoplossing vers voor gebruik.

  1. Bereid extractoplossingen voor in een concentratie van 1 mg/mL uit vers bereide bouillonoplossingen.
  2. Pipetteer 25 μL extract in een microplaatput, voeg 75 μL gedestilleerd water toe en voeg vervolgens 25 μL Folin–Ciocalteu-reagens toe.
  3. Incubeer het mengsel 6 minuten op kamertemperatuur.
  4. Voeg 100 μL natriumcarbonaatoplossing van 7% (w/v) toe aan elke put.
  5. Incubeer het reactiemengsel 90 minuten op kamertemperatuur in het donker.
  6. Meet de absorptie bij 665 nm met een microplaatspectrofotometer.
  7. Bereid een kalibratiecurve op met gallenzuur als standaard en bereken het totale fenolische gehalte, waarbij de resultaten worden uitgedrukt als mg gallische zuur-equivalenten (GAE) per mL extract.

5. Fytochemische analyse met LC-MS/MS

OPMERKING: Voer LC-MS/MS-analyse uit volgens eerder gepubliceerde chromatografische methoden met kleine aanpassingen34. Filter alle monsters en mobiele fasen door 0,22 μm membraanfilters en ontmagnetiseer de mobiele fasen voorafgaand aan analyse.

  1. Selecteer het extract met het hoogste totale fenolgehalte voor kwantitatieve fytochemische profilering.
  2. Voer chromatografische scheiding uit met behulp van een omgekeerde fase C18-kolom die op 30°C wordt gehouden.
  3. Bereid de mobiele fase voor bestaande uit (A) 0,1% mierenzuur in gedeïoniseerd water en (B) 0,1% mierenzuur in acetonitril, stel de debiet in op 0,4 mL/min, pas het injectievolume aan op 5 μL en stel de totale looptijd in op 17 minuten.
  4. Voer massaspectrometrische detectie uit onder elektrospray-ionisatie (ESI) condities waarbij stikstof wordt gebruikt als droog-, omhul- en nebulatiegas.
  5. Stel de drooggastemperatuur in op 350 °C met een debiet van 12 L/min, stel de temperatuur van het mantelgas in op 250 °C met een debiet van 5 L/min, en stel de druk van de vernevelaar aan op 55 psi.
  6. Bereid externe kalibratiecurves voor voor elke fenolstandaard en kwantificeer de analyten met behulp van de bijbehorende kalibratiecurves.

6. Antimicrobiële activiteitstest

OPMERKING: Evalueer de antibacteriële activiteit met behulp van de agarputdiffusiemethode volgens vastgestelde microbiologische protocollen. Voer alle microbiologische procedures uit onder aseptische omstandigheden in een bioveiligheidskast. Steriliseer alle materialen voor en na gebruik.

  1. Selecteer de volgende typestammen voor antimicrobiële tests: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Bacillus cereus ATCC 14579, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Listeria monocytogenes ATCC 19115, Acinetobacter baumannii ATCC 17978, Shigella dysenteriae ATCC 13313, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, en Enterobacter aerogenes ATCC 13048.
  2. Inoculeer elke bacteriële stam in trypton-sojabouillon (TSB) en incubeer bij de optimale groeitemperatuur totdat een optische dichtheid van OD₆₀₀ = 0,7 is bereikt.
  3. Breng de bacteriële culturen gelijkmatig uit op tryptone sojaagar (TSA) platen met behulp van een steriel staafje.
  4. Punch wellt aseptisch in de agar met behulp van een steriele kurkboor.
  5. Voeg 100 μL van elk extract (100 μg/mL) toe aan de overeenkomstige putten.
  6. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 18 uur.
  7. Meet de diameters van de inhibitiezones rondom elke put om de antimicrobiële activiteit te beoordelen.
  8. Voer alle experimenten driemaal uit en druk de resultaten uit als gemiddelde waarden.

7. Biofilmremming

OPMERKING: Evalueer de antibiofilmactiviteit met behulp van een kristalvioletkleuringstest tegen referentiebacteriestammen. Voer alle procedures uit onder aseptische omstandigheden en vermijd het verstoren van vastzittende biofilms tijdens wasstappen.

  1. Selecteer Escherichia coli ATCC 25922 en Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 als referentiestammen en kweek deze in TSB bij 37 °C totdat de logaritmische groeifase is bereikt.
  2. Stel de bacteriële suspensies bij op een optische dichtheid van OD₆₀₀ = 0,132.
  3. Pipetteer 100 μL extractoplossingen (0,625–10 mg/mL) in steriele 96-put polystyreen microtiterplaten, voeg 100 μL bacteriële suspensie toe aan elke put en meng voorzichtig.
  4. Breng de platen uit bij 37 °C gedurende 24 uur. Gebruik putten die alleen TSB bevatten als blanks en putten met bacteriële suspensie zonder extract als controle.
  5. Verwijder voorzichtig niet-hechtende cellen, was de putten twee keer met gedestilleerd water en laat de platen aan de lucht drogen.
  6. Voeg 200 μL 0,4% (w/v) kristalvioletoplossing toe aan elke put en laat het 30 minuten incuberen.
  7. Verwijder overtollige vlekken, spoel de putten twee keer af met gedestilleerd water en laat de platen volledig drogen.
  8. Voeg ethanol toe om de gebonden kleurstof op te lossen en meet de absorptie bij 595 nm met een microplaatlezer.
  9. Bereken de antibiofilmactiviteit met behulp van Vergelijking (2).
    figure-protocol-2(2)

8. Celkweek- en cytotoxische activiteitsanalyse (MTT-assay)

OPMERKING: Evalueer cytotoxische effecten met behulp van de MTT-assay volgens standaard cellevensvatbaarheidsprotocollen. Voer alle procedures uit onder steriele omstandigheden in een bioveiligheidskast en voorverwarmen van media en reagentia tot 37 °C vóór gebruik.

  1. Verkrijg de humane neuroblastoomcellijn SH-SY5Y uit een geaccrediteerd celdepot en kweek de cellen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM), aangevuld met 10% foetaal rundereserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine en 1% L-glutamine in 25 cm2 kweekkolven.
  2. Houd de culturen op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5%CO2 en laat de cellen groeien tot ongeveer 80% confluentie.
  3. Verwijder de cellen door trypsinisatie, zaai ze in 96-wellplaten met een dichtheid van 2 × 104 cellen per put, en incubeer 24 uur om hechting mogelijk te maken.
  4. Behandel de cellen met T. claveryi-extracten bij concentraties van 150, 300, 600, 1200 en 2000 μg/mL en incubeer gedurende 24 uur.
  5. Verwijder het kweekmedium, voeg 100 μL vers medium met 10 μL MTT-oplossing toe aan elke put en incubeer 4 uur bij 37 °C.
  6. Aspireer het medium, los de formazankristallen op door 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO) aan elke put toe te voegen, en meet de absorptie bij 570 nm met een microplaatspectrofotometer.
  7. Voer alle experimenten in drievoud uit.

figure-protocol-3
Figuur 1: Schematisch overzicht van de experimentele workflow. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

9. Statistische analyse

  1. Voer statistische analyses uit met geschikte statistische softwarepakketten en vergelijk controle- en behandelgroepen met behulp van de Student's t-test of tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA), indien passend.
  2. Druk alle gegevens uit als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
  3. Definieer statistische significantie op p < 0,05.
  4. Geef statistische significantie aan in figuren met asterisks als volgt: **** voor p < 0,0001, *** voor p < 0,001, ** voor p < 0,01 en * voor p < 0,05, en gebruik "ns" om niet-significantie aan te duiden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Moleculaire identificatie van T. claveryi
PCR-versterking van het ITS-gebied werd uitgevoerd met behulp van de universele primers ITS1 en ITS4 voor moleculaire identificatie van T. claveryi. De resulterende sequenties werden geanalyseerd en vergeleken met referentiesequenties in de NCBI-database met behulp van het BLAST-algoritme, waardoor definitieve soortidentificatie mogelijk werd (Supplementair bestand 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie stelt een vergelijkend en gestandaardiseerd extractie–bioactiviteitsplatform voor T. claveryi vast, waarmee wordt aangetoond dat de extractiestrategie een doorslaggevende factor is voor zowel chemische samenstelling als biologische functionaliteit. De belangrijkste methodologische kracht van dit protocol ligt in de strikte controle van extractieparameters, met name de vaste vaste–vloeistofverhouding, gestandaardiseerde oplosmiddelvolume, identieke verwerking na...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. Alle gegevens die de bevindingen van deze studie ondersteunen, zijn beschikbaar in het hoofdmanuscript en de aanvullende informatiebestanden. De datasets die tijdens de huidige studie zijn gegenereerd en geanalyseerd, zijn op redelijke aanvraag beschikbaar bij de corresponderende auteur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaarden dat deze studie geen financiële steun heeft ontvangen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

```html

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-wells polystyreen microtiterplatesNest Scientific701001Cell culture / assay plates
ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))Sigma-AldrichA3219Cation radical scavenging assay
Aceton (Analytical grade)Sigma-Aldrich179124Extraction solvent
Acetonitrile (LC-MS grade)Sigma-Aldrich34851Organic mobile phase
Acinetobacter baumanniiATCCManassas, VA, USAATCC 17978
Triple Quad LC-MS/MS with 1290 Infinity UPLC systemAgilent Technologies6460Quantitative analysis
Analytical column ( C18, 4.6 × 100 mm, 3.5 μm)Agilent Technologies (Zorbax)959990-902Reversed-phase column
Antioxidant standards (Ascorbic acid / Trolox)Sigma-AldrichA7506 / 238813Positive controls
Applied Biosystems 3730xl DNA AnalyzersApplied Biosystems 3730xl DNA AnalyzersDNA Sequencing System
Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitApplied Biosystems 4337455Sanger Sequencing Kit
Bacillus cereusATCCManassas, VA, USAATCC 14579
Bioinformatics Analysis, BioEdit software, Algorithm used: CAP contig assemblyIbis BiosciencesNASequence Assembly Software
Cellulose extraction thimbleFisherbrand™ 11724043Used for Soxhlet extraction
Dimethylsulfoxide (DMSO)Merck102952Solvent
DNA isolation kit (Plant&Fungi DNA isolation kit (Poland) )EurX GeneMATRIXE3595DNA isolation 
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)Sigma-AldrichD9132Radical scavenging assay
Dulbecco's Modified Eagle MediumCapricorn, DMEM-HA
Enterobacter aerogenesATCCManassas, VA, USAATCC 13048
Enterococcus faecalisATCCManassas, VA, USAATCC 29212
Escherichia coliATCCManassas, VA, USAATCC 25922
EthanolMerck100983Solvent
Ethyl acetateMerck109623Extraction Solvent
Fetal Bovine Serum (FBS)Capricorn ScientificFBS-16A
BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing KitThermoFisher4337455Sequencing Kit
Folin-Ciocalteu reagentSigma-Aldrich 47641Total phenolic content
Formic acidSigma-Aldrich 33015Mobile phase additive
Gallic acidCarlo Erba406335Calibration curve
Gene MATRIX Plant&Fungi DNA isolation kitEurX E3595DNA isolation kit
GraphPad Prism (v9)Data visualization and statistical analysisN/AStatistical analysis
Heating mantleElectrothermal EME30500Used to maintain solvent reflux
HighPrep™ PCR Clean-upSystemMAGBIOAC-60005
IceLaboratory grade—Temperature control during UAE
Klebsiella pneumoniaeATCCManassas, VA, USAATCC 13883
L-glutamineCapricorn ScientificGermany
Listeria monocytogenesATCCManassas, VA, USAATCC 19115
LyophilizerScientzN/AFreeze-drying of extracts
Magnetic bead–based PCR clean-up systemMAGBIOAC-60005PCR
MethanolMerck106009Extraction solvent
n-HexaneMerck103701Extraction solvent
Penicillin/StreptomycinCapricorn ScientificGermany
Pseudomonas aeruginosaATCCManassas, VA, USAATCC 27853
Filter paper (No. 541)Cytiva1541-125 VIn the extract filtration process
Rotary evaporatorBuchi R10011100V101Solvent removal
Shigella dysenteriaeATCCManassas, VA, USAATCC 13313
Sodium carbonateMerck106392Total phenolic analysis
SPECTROstar Nano Microplate Reader BMG LabtechAbsorbance measurements
Staphylococcus aureusATCCManassas, VA, USAATCC 25923
Staphylococcus epidermidisATCCManassas, VA, USAATCC 12228
Statistical analysis software (SPSS, v23)Data analysisNA
Thermo Scientific Nanodrop 2000 Thermo Fisher ScientificND-2000
Tryptone Soy Agar (TSA)MerckGermany—
Tryptone Soy Broth (TSB)MerckGermany—
Ultrasonic homogenizerScientzSCIENTZ-650LUltrasound-assisted extraction
```

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wasser, S. P., Weis, A. L. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (Review). Int. J. Med. Mushrooms. 1 (1), 31-62 (1999).
  2. Wasser, S. P. Current findings, future trends, and unsolved problems in studies of medicinal mushrooms. Appl. Microbiol. Biotechnol. 89 (5), 1323-1332 (2011).
  3. Badalyan, S. Medicinal aspects of edible ectomycorrhizal mushrooms. Edible Ectomycorrhizal Mushrooms: Current Knowledge and Future Prospects. Zambonelli, A., Bonito, G. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 317-334 (2012).
  4. El Enshasy, H. A., Hatti-Kaul, R. Mushroom immunomodulators: unique molecules with unlimited applications. Trends Biotechnol. 31 (12), 668-677 (2013).
  5. Morte, A., Kagan-Zur, V., Navarro-Ródenas, A., Sitrit, Y. Cultivation of desert truffles—A crop suitable for arid and semi-arid zones. Agronomy. 11 (8), 1462(2021).
  6. Gutiérrez, A., Morte, A., Honrubia, M. Morphological characterization of the mycorrhiza formed by Helianthemum almeriense Pau with Terfezia claveryi Chatin and Picoa lefebvrei (Pat.) Maire. Mycorrhiza. 13 (6), 299-307 (2003).
  7. Loizides, M., Hobart, C., Konstandinides, G., Yiangou, Y. Desert truffles: the mysterious jewels of antiquity. Field Mycology. 13 (1), 17-21 (2012).
  8. Atila, F., Kazankaya, A. Terfezia species natural distributed in Türkiye and their ecologies. Mantar Dergisi. 13 (3), 119-130 (2022).
  9. Türkoğlu, A., Castellano, M., Trappe, J., Yaratanakul Güngör, M. Turkish truffles I: 18 new records for Turkey. Turkish J. Bot. 39, 359-376 (2015).
  10. Doğan, H., Kurt, F. New macrofungi records from Turkey and macrofungal diversity of Pozantı-Adana. Turkish J. Bot. 40, 209-217 (2016).
  11. İnci, Ş, Kırbağ, S. Nutritional content, antioxidant and antimicrobial activity of Terfezia claveryi Chatin. Artvin Çoruh Univ. J. For. Fac. 19 (2), 138-143 (2018).
  12. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J. Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  13. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P T. 40 (4), 277-283 (2015).
  14. Cushnie, T. P. T., Lamb, A. J. Antimicrobial activity of flavonoids. Int. J. Antimicrob. Agents. 26 (5), 343-356 (2005).
  15. Valko, M., et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 39 (1), 44-84 (2007).
  16. Morte, A., Honrubia, M., Gutiérrez, A. Biotechnology and cultivation of desert truffles. Mycorrhiza: State of the Art. Varma, A. , 467-483 (2008).
  17. Corrêa, R. C. G., et al. Biotechnological, nutritional and therapeutic uses of Pleurotus spp. related with its chemical composition: a review. Trends Food Sci Technol. 50, 103-117 (2016).
  18. Ma, G., et al. A critical review on the health promoting effects of mushrooms nutraceuticals. Food Sci. Hum. Wellness. 7 (2), 125-133 (2018).
  19. Reis, F. S., et al. Functional foods based on extracts or compounds derived from mushrooms. Trends Food Sci. Technol. 66, 48-62 (2017).
  20. Mandeel, Q. A., Al-Laith, A. A. Ethnomycological aspects of the desert truffle among native Bahraini and non-Bahraini peoples. J. Ethnopharmacol. 110 (1), 118-129 (2007).
  21. Patel, S. Food, health and agricultural importance of truffles: a review. Curr. Trends Biotechnol. Pharm. 6, 15-27 (2012).
  22. Janakat, S., Nassar, M. Hepatoprotective activity of desert truffle (Terfezia claveryi) compared with Nigella sativa in rats. Pak. J. Nutr. 9, 52-56 (2010).
  23. Al-Laith, A. A. A. Antioxidant components and activities of desert truffle (Tirmania nivea). J. Food Compos. Anal. 23 (1), 15-22 (2010).
  24. Shavit, E., Shavit, E. The medicinal value of desert truffles. Desert Truffles. Kagan-Zur, V., Roth-Bejerano, N., Sitrit, Y., Morte, A. 38, 323-340 (2014).
  25. Patel, S., et al. Potential health benefits of natural products derived from truffles. Trends Food Sci. Technol. 70, 1-8 (2017).
  26. Beara, I. N., et al. Phenolic profile, antioxidant, anti-inflammatory and cytotoxic activities of truffles. Food Chem. 165, 460-466 (2014).
  27. Dahham, S. S., et al. Antioxidant, anticancer and apoptosis properties of Terfezia claveryi. Saudi J. Biol. Sci. 25 (8), 1524-1534 (2018).
  28. Azmir, J., et al. Techniques for extraction of bioactive compounds: a review. J. Food Eng. 117 (4), 426-436 (2013).
  29. Kumar, M., Shukla, P. K. PCR targeting of ITS regions for rapid diagnosis of mycotic keratitis. J. Clin. Microbiol. 43 (2), 662-668 (2005).
  30. Bondet, V., Brand-Williams, W., Berset, C. Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH method. LWT Food Sci. Technol. 30, 609-615 (1997).
  31. Re, R., et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS assay. Free Radic. Biol. Med. 26 (9-10), 1231-1237 (1999).
  32. Đorđević, T. M., et al. Effect of fermentation on antioxidant properties of cereals. Food Chem. 119 (3), 957-963 (2010).
  33. Herald, T. J., et al. High-throughput micro plate assays for screening flavonoid content and DPPH-scavenging activity in sorghum bran and flour. Sci. Food Agric. 92 (11), 2326-2331 (2012).
  34. Kısa, D., et al. Evaluation of Biological Potency of two Endemic Species Integrated with in vitro and in silico Approches: LC-MS/MS Analysis of the Plants. Chem. Biodivers. 21 (3), e202301351(2024).
  35. Kumoro, A., Singh Hasan, Effects of solvent properties on the soxhlet extraction of diterpenoid lactones from andrographis paniculata leaves. ScienceAsia. 35, 306-309 (2009).
  36. Ng, Z. X., Samsuri, S. N., Yong, P. H. The antioxidant index and chemometric analysis of tannin, flavonoid, and total phenolic extracted from medicinal plant foods with the solvents of different polarities. Food Process. Preserv. 44 (9), e14680(2020).
  37. Kıvrak, İ Analytical methods applied to assess chemical composition, nutritional value and ın vitro bioactivities of Terfezia olbiensis and Terfezia claveryi from Turkey. Food Anal. Methods. 8 (5), 1279-1293 (2015).
  38. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2015).
  39. Monteiro, M., et al. Effect of extraction method and solvent system on the phenolic content and antioxidant activity of selected macro- and microalgae extracts. J. Appl. Phycol. 32 (1), 349-362 (2020).
  40. Pingret, D., et al. Degradation during application of ultrasound in food processing: A review. Food Control. 31, 593-606 (2013).
  41. Şahin, A., et al. Total phenol, antioxidant activity, fatty acid composition and mineral contents of the species of fungi known as domalan. J. Agroalimentary Process. Technol. 26 (3), 149-154 (2020).
  42. Fidan, M., et al. cytotoxic and protective effects of truffles. Anal. Biochem. 641, 114566(2022).
  43. Awika, J. M., et al. Screening methods to measure antioxidant activity of sorghum (sorghum bicolor) and sorghum products. J. Agric. Food Chem. 51 (23), 6657-6662 (2003).
  44. Gursoy, N., et al. Antioxidant activities, metal contents, total phenolics and flavonoids of seven Morchella species. Food Chem. Toxicol. 47 (9), 2381-2388 (2009).
  45. Elsayed, E., et al. Truffles: A potential source of bioactive compounds. Bioactive Compounds in Food. , CRC Press. 163-174 (2021).
  46. Elsayed, E. A., et al. Mushrooms: a potential natural source of anti-inflammatory compounds for medical applications. Mediators Inflamm. 2014, 805841(2014).
  47. Stanikunaite, R., et al. Cyclooxygenase-2 inhibitory and antioxidant compounds from the truffle Elaphomyces granulatus. Phytother. Res. 23 (4), 575-578 (2009).
  48. Doğan, H. H., Aydın, S. Determination of antimicrobial effect, antioxidant activity and phenolic contents of desert truffle in Turkey. Afr. J. Tradit. Complement. Altern. Med. 10 (4), 52-58 (2013).
  49. Abu-Odeh, A., et al. In vitro and In vivo Antidiabetic Activity, phenolic content and microscopical characterization of Terfezia claveryi. Molecules. 27 (15), 4843(2022).
  50. Nguyen, V., et al. Chlorogenic Acid: A systematic review on the biological functions, mechanistic actions, and therapeutic potentials. Nutrients. 16 (7), 924(2024).
  51. Suhag, R., et al. Mapping antioxidant mechanisms in plant extracts via reactivity kinetics inhibiting oil autoxidation. Appl. Food Res. 5 (2), 101476(2025).
  52. Harir, M., et al. Evaluation of antimicrobial activity of Terfezia arenaria extracts collected from Saharan desert against bacteria and filamentous fungi. 3 Biotech. 9 (7), 281(2019).
  53. Hamza, A., et al. Nutraceutical potential, antioxidant and antibacterial activities of Terfezia boudieri Chatin, a wild edible desert truffle from Tunisia arid zone. Arab. J. Chem. 9 (3), 383-389 (2016).
  54. Neggaz, S., et al. In vitro evaluation of antioxidant, antibacterial and antifungal activities of Terfezia claveryi Chatin. Phytothérapie. 13, 1-7 (2020).
  55. Dib, S., Fortas, Z. Antimicrobial activities of desert truffle extracts and their chemical ıdentification. J. Pharm. Pharmacol. 7, 1-7 (2019).
  56. Gargano, M. B., et al. Antimicrobial activity of the extracts of Terfezia Claveryi and Tirmania Pinoyi against gram-positive and gram-negative bacteria causal agent of diseases in tomato. Chem. Eng. Trans. 58, 73-78 (2017).
  57. Khojah, H. M. J., et al. Antimicrobial efficacy of extracts of Saudi Arabian desert Terfezia claveryi truffles. Saudi J. Biol. Sci. 29 (11), 103462(2022).
  58. Akyüz, M., et al. Cytotoxicity and DNA protective effects of the Terfezia and Picoa species from the eastern region of Turkey. Istanbul J. Pharm. 51 (2), 198-203 (2021).
  59. Al Obaydi, M. F., et al. Terfezia boudieri: A Desert Truffle With Anticancer and Immunomodulatory Activities. Front. Nutr. 7, 38(2020).
  60. Pakrashi, S., et al. Quercetin alleviates 6-OHDA-caused apoptosis in SH-SY5Y cells. Toxicol. Res. 13 (4), tfae117(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Terfezia ClaveryiExtraction MethodsIn Vitro BioactivityAntioxidant ActivityAntimicrobial ActivityCytotoxic ActivityUltrasound Assisted ExtractionMaceration Assisted ExtractionPhenolic CompoundsLC MS MS Analysis

Related Articles