Een muismodel van lymfatische ablatie van het donorhart via elektrocauterisatie voor transplantatieonderzoek

Samenvatting

We ontwikkelden een nieuw muismodel van donor-hartlymfatische ablatie bij harttransplantatie. Dit model toont aan dat de verstoring van donorlymfekaten acute afstoting vermindert, myocardschade vermindert en de overleving van transplantaties verlengt, wat nieuwe inzichten biedt in de lymfatische functie van het hart in transplantatie-immuniteit.

Samenvatting

Hoewel hartlymfatische vaten de laatste jaren steeds meer aandacht hebben gekregen, moet de relatie tussen het lymfestelsel van het donorhart en acute afstoting bij harttransplantatie nog worden opgehelderd.

De elektrofysiologische activiteit van het hart werd beoordeeld via elektrocardiografie (ECG) bij normale muizen, zowel vóór als na de lymfatische ablatie van het hart. Belangrijke lymfevaten van donorharten werden zichtbaar gemaakt met een Evans Blue-injectie en vervolgens geableerd via elektrocauterisatie. Er werd een harttransplantatiemodel ontwikkeld met donor cardiale lymfatische dysfunctie met harten die lymfatische ablatie ondergingen. De functie van het harttransplantaat werd beoordeeld via echocardiografie, western blotting en ELISA. De impact van donorlymfatische ablatie op acute afstoting werd beoordeeld door middel van hematoxyline-eosine (HE) kleuring en monitoring van de overlevingstijd van de transplantatie.

ECG-resultaten toonden geen significante veranderingen in de elektrofysiologie van het hart vóór en na lymfatische ablatie, wat bevestigde dat grote hartvaten onbeschadigd bleven. Evans Blue werd in de hartapex geïnjecteerd om de lymfevaten te labelen. Grote lymfecellen werden vervolgens geableerd met elektrocauterisatie. Na afronding van de ablatieprocedure werden de muizen hepariniseerd en werden hun harten vervolgens geoogst. De aorta en de longslagader werden doorgesneden, en de superieure/inferieure vena cava, samen met de longaderen, werden geligeerd. De voorbereide (geableerde) donorharten werden vervolgens getransplanteerd. Niveaus van cTnI en ejectiefractie toonden aan dat lymfatische ablatie het hartletsel niet verergerde. De HE-kleuring toonde aan dat ablatie van donorhartlymfekaten acute afstoting verlichtte, myocardschade verminderde en de overleving van de transplantatie verlengde.

We hebben met succes een model voor muisharttransplantatie met donorhartlymfatische dysfunctie ontwikkeld en aangetoond dat ablatie van donorhartlymfekaten acute afstoting kan verminderen, myocardschade kan verminderen en de overleving van transplantaten kan verlengen. Deze bevindingen bieden nieuwe inzichten en een basis voor het begrijpen van de rol van het lymfestelsel van het hart bij harttransplantatie.

Inleiding

Afstoting van hartallograften blijft een van de meest voorkomende en ernstigste complicaties na harttransplantatie, voornamelijk ingedeeld in acute cellulaire afstoting en antilichaam-gemedieerde afstoting. Hoewel moderne immunosuppressieve therapieën de overlevingskansen van transplantaties aanzienlijk hebben verbeterd, blijft afstoting een belangrijke bepalende factor voor transplantatie-uitkomsten. Volgens de literatuur ervaart ongeveer 12% van de patiënten minstens één episode van matige of ernstige acute afstoting in het eerste jaar na transplantatie¹.

Het lymfestelsel van het hart krijgt steeds meer aandacht vanwege zijn mogelijke rol bij transplantatieafstoting. Naast de goed gevestigde functies in vloeistofbalans en immuunbewaking, speelt het lymfestelsel een belangrijke rol bij het moduleren van immuunreacties. Lymfevaten dienen als de primaire kanalen voor immuuncellen om weefsels binnen en uit te gaan ^2,3. In het hart vormt het lymfatische netwerk de fundamentele infrastructuur voor het transport en de recirculatie van immuuncellen, waaronder lymfocyten. Via deze route migreren lymfocyten van de bloedbaan naar de interstitiële ruimte, waar ze immuunbewaking uitvoeren. Vervolgens worden ze gedraineerd naar de lymfeklieren en keren uiteindelijk terug naar de systemische circulatie ^2,4. Bovendien geven studies aan dat T-cellen en hun subsets een centrale rol spelen in acute afstotingsreacties, en dat de activatie en migratie van deze cellen mogelijk worden beïnvloed door het lymfestelsel⁵.

Hoewel bekend is dat lymfevaten in het hart voorkomen en netwerken vormen die analoog zijn aan bloedvaten, heeft hun belang door de jaren heen niet vergelijkbare aandacht gekregen. Studies hebben aangetoond dat het ontbreken van functionerende lymfevaten leidt tot uitgesproken harthypertrofie en oedeem, wat wijst op een cruciale rol van lymfevaten bij het handhaven van de homeostase van het hartweefsel⁶. Bovendien kan een verstoorde of afwezige lymfedrainage de efficiëntie van het verwijderen van inflammatoire cellen verminderen, waardoor lokale ontstekingsreacties worden versterkt en het proces van hartvervorming^wordt beïnvloed.

Bij hartziekten bestaan er verschillende interventies gericht op lymfevaten. In muismodellen kan een hart-lymfatisch deficiënt worden geïnduceerd door het genereren van Vegfc+/- muizen⁸. Klinisch kunnen interventionele mediastinale lymfatische embolisatie⁹ en minimaal invasieve pericardiale vensterchirurgie¹⁰ worden ingezet om kyleuze pericardiale effusie te behandelen. Voor patiënten met Fontan-circulatiefysiologie kan lymfatische decompressie chirurgisch^{worden bereikt 11}, via percutane thoracale ductdecompressie¹², of door het vaststellen van lymfoveneuze anastomose¹³. Occlusietechnieken omvatten embolisatie van thoracale buis¹⁴, selectieve lymfatische buisembolisatie¹⁵ en ligaties van thoracale buis¹⁶. Directe interventies gericht op de hartlymfevaten zelf blijven echter beperkt.

Gezien de cruciale rol van lymfevaten van het hart, hebben we een nieuw model voor muisharttransplantatie ontwikkeld door grote lymfevaten in donorharten te ablateren via elektrocauterie. Dit model werd gebruikt om de impact van lymfatische dysfunctie van donortransplantaat op acute afstoting na transplantatie te onderzoeken.

Protocol

Mannelijke C57BL/6J- en BALB/c-muizen (mannelijk, 6-8 weken oud, 25-28 g lichaamsgewicht) werden onder specifieke ziekteverwekkervrije omstandigheden gehouden. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van het Fuwai Ziekenhuis (Goedkeuringsnummer: 0108-7-800-ZX(X)-019).

Visualisatie en ablatie van hartlymfevaten bij muizen
Om hartlymfatische dysfunctie te simuleren, werden grote lymfevaten van het hart geableerd via elektrocauterie.

Alle muizen werden verdoofd via intraperitoneale injectie van 1,25% tribromoethanol in een dosering van 0,2 mL per 10 g lichaamsgewicht en mechanisch geventileerd gedurende de procedure. Na anesthesie met tribromoethanol ondergingen BALB/c-muizen endotracheale intubatie met een 22-gauge katheter en werden ze aangesloten op elektrocardiogram (ECG) (Figuur 1A, Aanvullende Figuur S1). In de beademingsparameters was de ademhalingsverhouding ingesteld op 1:1 of 1:2, met een getijdenvolume van 0,3 mL en een ademhalingsfrequentie van 100 ademhalingen/min. Na het aansluiten van de katheter op de beademingsmachine werd de toestand van de muis nauwlettend gevolgd; Intubatie werd als succesvol beschouwd als de ademhalingsfrequentie van de muis overeenkwam met die van de beademingsmachine, terwijl inconsistente snelheden of buikspanning duidden op falen die reintubering vereiste. Vervolgens werd een thoracotomie uitgevoerd in de linker 3-4 intercostale ruimte met een incisielengte van ongeveer 1 cm, en een retractor werd gebruikt om het hele hart bloot te leggen (Figuur 1B). Vervolgens werd 5 μL Evans blauwe kleurstof intramusculair in de hartapex geïnjecteerd om de lymfevaten zichtbaar te maken, met een wachttijd van 1 minuut na injectie om volledige opacificatie mogelijk te maken (Figuur 1C, E; Aanvullende figuur S2A-B), waarin wordt opgemerkt dat Evans blue zeer langzaam moet worden geïnjecteerd. Na visualisatie werd de locatie van de grote lymfevaten van het hart bevestigd door te vergelijken met eerder gerapporteerde anatomische gegevens^17,18, en werd ablatie uitgevoerd met een elektrocauteriepen ingesteld op 10 W in continue modus, met een stollingstijd van ongeveer 3-7 seconden (Figuur 1D,F). Elektrocardiografie (ECG) werd gemonitord voor en na ablatie om de afwezigheid van vasculaire letsel te waarborgen (Figuur 1G, H). Ten slotte werden de muizen na een grote lymfatische ablatie hepariniseerd ter voorbereiding op de daaropvolgende donorhartoogst. Een schematische weergave van de chirurgische ingreep is te vinden in Figuur 2.

Abdominale heterotope harttransplantatie
Heterotopische harttransplantatie in de buikholte van muizen werd uitgevoerd zoals eerder beschreven¹⁹. Een kort protocol wordt hieronder samengevat:

Donorprocedure
Er werd een laparotomie uitgevoerd langs de linea alba bij BALB/c-muizen, en 1 mL 50 U/mL heparinezoutoplossing bij 4 °C werd geïnjecteerd in de inferieure vena cava, terwijl de abdominale aorta werd doorgesneden om systemische heparinisatie te induceren. Hierna werd het hart blootgelegd en stond het 8-0 Hechtingen werden gebruikt om de linker- en rechtervena superior cava te ligaeren, die vervolgens aan het distale uiteinde van de hechtingen werden doorgesneden (Figuur 3A,B). Vervolgens werd de aorta geïsoleerd van het omliggende vetweefsel en nabij de aortaboog gesneden (Figuur 3C), en werd een vergelijkbare procedure uitgevoerd om de longslagader te isoleren en te doorsnijden (Figuur 3D). De inferieure vena cava in het thoracale segment werd geligeerd met 8-0 hechtingen en doorgesneden aan het distale uiteinde (Figuur 3E), waarna de longaders werden geligeerd en doorgesneden met 7-0 zijde gevlochten hechtingen (Figuur 3F). Ten slotte werd het uitgesneden donorhart bewaard in fysiologische zoutoplossing bij 4 °C voor latere transplantatie, waarbij alle harten ongeveer 30 minuten dezelfde duur bewaarden om experimentele consistentie te waarborgen.

Ontvangerprocedure
Verdoof de C57BL/6J-ontvangermuizen ter voorbereiding op een abdominale harttransplantatie. Langs de linea alba werd een laparotomie uitgevoerd om de abdominale aorta en de inferieure vena cava van de ontvangende muis bloot te leggen (Figuur 4A). Na het ligateren van de dorsale takvaten van de onderste vena cava met 10-0 nylon hechtingen, werden vasculaire klemmen gebruikt om de bloedstroom via de abdominale aorta en de inferior vena cava af te sluiten (Figuur 4B). Vervolgens werd er een venster gemaakt in de abdominale aorta en de onderste vena cava van de ontvangende muis, en werd het bloed uit de bloedvaten gespoeld met heparinezoutoplossing. Met behulp van 11-0 nylon hechtingen werd end-to-side anastomose uitgevoerd om de longslagader van het donorhart te verbinden met de inferior vena cava van de ontvanger en de aorta van het donorhart met de abdominale aorta van de ontvanger (Figuur 4C-E). Ten slotte werden de vasculaire klemmen losgemaakt om de bloedtoevoer naar de ontvangende muis te herstellen (Figuur 4F).

Experimenteel ontwerp
Experimentele groep: Lymfevaten van het hart bij BALB/c-muizen werden gevisualiseerd met Evans blue kleurstof en geableerd met een elektrocauteriepen. De harten van BALB/c-muizen met geableerde lymfevaten werden getransplanteerd in C57BL/6J-muizen.

Controlegroep: Cardiale lymfevaten bij BALB/c-muizen werden gevisualiseerd met Evans Blue-kleurstof, maar er werd geen ablatie uitgevoerd. De harten van BALB/c-muizen werden getransplanteerd in C57BL/6J-muizen.

In deze studie werd de steekproefgrootte gestandaardiseerd over alle experimentele groepen en tijdstippen, met n=5 muizen per groep voor assays uitgevoerd 24 uur na harttransplantatie, n=5 per groep voor assays 7 dagen na transplantatie, en n=5 per groep voor de observatie van de overlevingstijd van harttransplantaties.

De geoogste donorharten werden 30 minuten bewaard in ijskoude zoutoplossing van 4 °C voorafgaand aan de harttransplantatie. Zowel experimentele als controlegroep-donorharten werden voor een identieke duur in zoutoplossing gehouden.

De klopduur van harttransplantaten werd dagelijks beoordeeld via palpatie in beide groepen (n=5 per groep).

Histologische beoordeling en parenchymale afstoting (PR) scoring
Myocardiale weefselmonsters werden 48 uur gefixeerd in 10% formaline, gevolgd door uitdroging via een gegradueerde ethanolserie (70%, 80%, 95%, 100%), xyleenzuivering, paraffine-inbedding en microtoomsectie (4 μm), met resulterende secties gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E). Graftafstoting werd geëvalueerd met behulp van de PR-score voor harttransplantatie, en de mate van graftletsel werd geblindeerd beoordeeld²⁰.

Echocardiografisch onderzoek
De hartfunctie werd beoordeeld met behulp van het ultrageluidssysteem (40 MHz 550 probe transducer). Muizen werden in rugligging geplaatst op een 360 graden draaibaar dierenplatform. Na het verwijderen van buikbeharing werd de hartfunctie geëvalueerd onder 1,0% isofluranan-anesthesie. De ejectiefractie (EF) van het harttransplantaat werd gemeten met M-mode echocardiografie.

Detectie van markers voor myocardletsel
De omvang van myocardweefselschade werd geëvalueerd door de expressie van cardiomyocyt-specifieke enzymen in het serum te meten. De waarden van cardiale troponine I (cTnI) werden geanalyseerd volgens de instructies van de fabrikant.

Westelijke verplettering
24 uur na de harttransplantatie werd myocardweefsel uit de hoofd lymfevatgebieden van de harttransplantaten in zowel de controle- als de experimentele groep verzameld. Volgens het eerder beschreven protocol²¹ werd de expressie van lymfevat-geassocieerde markers geanalyseerd. Het hartweefsel werd grondig gelyseerd in een RIPA-lysisbuffer met proteaseremmers (fenylmethaansulfonylfluoride). Voorafgaand aan warmtedenaturatie werd de eiwitconcentratie bepaald met een BCA-kit en aangepast naar een uniforme concentratie. Het totale eiwit van elke groep werd via SDS-PAGE gescheiden en vervolgens overgebracht op een PVDF-membraan. Het PVDF-membraan werd geblokkeerd met 5% magere melk (kamertemperatuur 1-2 uur) en vervolgens een nacht geïncubeerd bij 4 °C met de respectievelijke primaire antistoffen. De volgende dag werd het membraan behandeld met een secundair antilichaam (anti-konijn, 1:1000) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. De membraanstrips werden geïncubeerd met ECL-oplossing (1-2 mL) en belicht om de beelden vast te leggen.

De gebruikte antilichamen waren als volgt: LYVE1 Polyklonaal antilichaam (1:500), Podoplanine-antilichaam (1:500) en Anti-VEGF Receptor 3 (1:50).

Statistische analyse
Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van gemiddelde (SEM). Bij het vergelijken van twee groepen werden statistische analyses uitgevoerd met behulp van de Student's t-test of de Wilcoxon rangsomtest, afhankelijk van de gegevensverdeling en kenmerken. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05.

Resultaten

Beoordeling van de functie van het harttransplantaat
Muizenmodellen van harttransplantatie werden opgesteld in zowel controle- als experimentele groepen volgens het beschreven protocol. De functionele status van de transplantaties werd 24 uur na transplantatie geëvalueerd. Het expressieniveau van serum cardiale troponine I (cTnI) was hoger in de experimentele groep dan in de controlegroep, maar het verschil was niet statistisch significant (Figuur...

Discussie

Het lymfestelsel van het hart vormt een essentieel onderdeel voor het in stand houden van de homeostase van weefselvloeistof en het ondersteunen van de immuunfunctie in het hart. Door het faciliteren van interstitiële vloeistofreabsorptie, lipidentransport en het transport van immuuncellen zorgt het voor de hartprestaties onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden. In de afgelopen jaren heeft groeiend bewijs de cruciale betrokkenheid van het hartlymfestelsel bij meerdere ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Electrocoagulatiepen	Weitai	V70
Microscopische pincetten	Jinzhong	WA3030
Microscopische pincetten	Jinzhong	WA2040
Microscopische naaldhouder	Jinzhong	YZE010
Microscopische naaldhouder	Jinzhong	YZE020
Microscopische schaar	Jinzhong	YBC010
Microscopische schaar	Jinzhong	YBC020
Naaldhouder	Jinzhong	J32010
Schaar	Jinzhong	Y00010
Kleindierventilator	Zhuodi	DW-300