In dit artikel hebben we een reproduceerbaar, temperatuurgecontroleerd protocol beschreven voor ex vivo Fosfor-31 Magnetische Resonantiespectroscopie, waarmee seriële, kwantitatieve beoordeling van myocardenergetica tijdens orgaanbehoud mogelijk is.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
* These authors contributed equally
In dit artikel hebben we een reproduceerbaar, temperatuurgecontroleerd protocol beschreven voor ex vivo Fosfor-31 Magnetische Resonantiespectroscopie, waarmee seriële, kwantitatieve beoordeling van myocardenergetica tijdens orgaanbehoud mogelijk is.
Betrouwbare orgaanbehoud is cruciaal om de beschikbaarheid van donoren te vergroten en de transplantatieresultaten te verbeteren. Hoewel statische opslag de standaard blijft voor donorharten, is er behoefte aan precieze methoden om myocardenergetica tijdens de hele conservering te monitoren.
Fosfor-31 Magnetische Resonantiespectroscopie (31P MRS) maakt directe, dynamische meting mogelijk van belangrijke energiemetabolieten, waaronder fosfocreatine (PCr), adenosinetrifosfaat (ATP), anorganisch fosfaat (Pi) en intracellulaire pH. Deze techniek maakt longitudinale, kwantitatieve en precieze evaluatie van de myocardmetabole status tijdens ex vivo opslag mogelijk. Voordelen van MRS zijn onder andere een dynamische beoordeling van de energiestatus en een wereldwijde beoordeling van de ventrikelenergie.
Het protocol begint met het herstel van de varkensdonor, het toedienen van cardioplegie en een cariectomie. De aortabooghoek wordt proximaal van de brachiocefale stam doorgesneden om de lengte van de opstijgende aorta te maximaliseren. Een geribbelde canule wordt vastgezet in de distale opstijgende aorta, het linker atrium wordt gemarkeerd en het hart wordt geplaatst in een cilindrische, geïsoleerde container die vooraf is gevuld met temperatuurspecifieke cardioplegie. Het deksel is verbonden met de canule, waarbij het hart erin wordt opgehangen, en de container wordt afgesloten, waarbij een temperatuur binnen 1 °C gedurende 1 uur wordt gehouden.
De container wordt geplaatst in een op maat gemaakte piepschuimen doos met een opening voor een fosforafgestemde spoel, waarbij het spiraalcentrum ligt uitgelijnd met het centrum van de linker ventrikel (LV). Scout-beelden bevestigen de plaatsing van de LV nabij de 31P spoel. B0 shimming zorgt voor uniforme excitatie, gevolgd door het verwerven van een niet-gelokaliseerd 31P MR-spectrum. Nabewerking identificeert spectrale pieken voor het berekenen van PCr/ATP, PCr/Pi-verhoudingen en intracellulaire pH.
In ons protocol wordt 31P MRS uitgevoerd op seriële tijdstippen tussen h 0 en 8. Tussen tijdstippen wordt het hart opgeslagen in een standaard opslagapparaat op de gewenste temperatuur.
31P MRS heeft ons in staat gesteld tijdsafhankelijke veranderingen in energieverlies te bestuderen en de rol van opslagtemperatuur bij het verminderen van energieverlies in de loop van de tijd.
Harttransplantatie blijft de definitieve behandeling voor geselecteerde patiënten met eindstadium hartfalen1. Echter, een aanhoudend tekort aan geschikte donororganen en de beperkingen van de huidige conserveringsstrategieën vormen grote barrières voor optimale uitkomsten en een grotere beschikbaarheid van transplantaties 2,3. Traditioneel worden donorharten bewaard met koude statische opslag, wat eenvoudig en kosteneffectief is, maar gevoelig is voor subklinische energetische uitputting tijdens langdurig transport 2,4. Nu programma's steeds vaker organen met een hoger risico en geografisch ver weg accepteren, is er een groeiende behoefte aan objectieve instrumenten die de metabole toestand van het myocardas tijdens behoud karakteriseren, in plaats van uitsluitend te vertrouwen op ischemische tijd en grove inspectie 5,6,7. Daarnaast worden myocardmetabolisme en ischemische tolerantie sterk beïnvloed door temperatuur, en zowel onvoldoende koeling als overmatige onderkoeling kunnen de energetische uitputting en celbeschadiging tijdens opslag verergeren. Het evalueren van donorharten bij meerdere, klinisch relevante conserveringstemperaturen helpt daarom om aandoeningen te identificeren die de myocardiale levensvatbaarheid het beste over tijd behouden3.
Nauwkeurige, dynamische beoordeling van myocardiale bio-energetica tijdens opslag is essentieel om conserveringstechnieken te verbeteren en het orgaangebruik te maximaliseren. Momenteel is de standaardpraktijk gebaseerd op statische koude opslag bij temperaturen rond 4-8 °C8. Hoewel dit protocol succesvolle resultaten heeft laten zien over korte opslagtijden, kan langdurige opslag bij deze temperatuur de integriteit van het myocardiale geheugen in gevaar brengen. Daarom is het essentieel om seriële metingen van metabole activiteit uit te voeren over een bereik van temperaturen en duurheden om de optimale opslagcondities te bepalen die nodig zijn voor een succesvolle orgaantransplantatie. Conventionele evaluatie van preservation injury is vaak gebaseerd op histologisch onderzoek of biochemische assays van myocardbiopsieën, die invasief en destructief zijn en slechts intermitterende, regionale momentopnames van weefselstatus9 bieden. Daarentegen is fosfor-31 magnetische resonantiespectroscopie (31P MRS) een krachtige, niet-destructieve methode die directe, seriële metingen mogelijk maakt van belangrijke energiemetabolieten, waaronder fosfocreatine (PCr), adenosinetrifosfaat (ATP), anorganisch fosfaat (Pi) en intracellulaire pH, binnen intact hartweefsel 6,10,11,12. Door herhaalde metingen in hetzelfde orgaan toe te staan zonder extra weefselbehandeling, biedt 31P MRS globale en longitudinale inzichten in de energetische status van het myocard, wat de experimentele precisie en reproduceerbaarheid verbetert in vergelijking met biopsie-gebaseerde of serumsurrogaatbenaderingen 6,13.
De beoordeling van de levensvatbaarheid van harttransplantaten met 31P MRS is beoordeeld door Bernard et al.14. Hier wordt een gedetailleerd, temperatuurgecontroleerd protocol voor ex vivo 3 Tesla 31 PMRS van het varkenshart tijdens conservering gepresenteerd. Deze methode biedt een praktisch kader voor het monitoren van substraatuitputting, het testen van opslagvariabelen en het valideren van conserveringsinterventies. Het protocol is bijzonder geschikt voor laboratoria die seriële metingen van de hele ventrikel tijdens statische koude opslag zoeken, zoals studies naar temperatuurafhankelijke conservering, ischemie-reperfusieschade of optimalisatie van oplossingen voor marginale en uitgebreide criteria donorharten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit protocol volgt de richtlijnen voor institutionele dierenzorg en is goedgekeurd door de Johns Hopkins Animal Care and Use Committee (Protocol nummer SW24M319) voor alle procedures waarbij levende dieren betrokken zijn tot en met chirurgische oogst. Alle daaropvolgende ex vivo experimenten werden uitgevoerd met weefsels verkregen na euthanasie.
1. Pre-Harvest procedure
2. Oogstprocedure
3. Spectroscopieprotocol
4. Data-analyse
5. Vergelijkingen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De gelokaliseerde2e-orde shimming16 resulteerde in een homogener B0 magnetisch veld over het interessegebied, zoals blijkt uit een vermindering van de standaardafwijking op elk tijdstip (0 uur: 14,0 tot 4,0 Hz; 4 uur: 17,5 tot 3,2 Hz; 8 uur: 16,0 tot 3,2 Hz). Dit zorgde ervoor dat op elk tijdstip uitstekende spectrale kwaliteit werd bereikt (Figuur 7). De veranderingen in de myocardiale stofwisseling tijdens ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit manuscript beschrijft een chirurgische voorbereiding en een 31P MRS-acquisitie- en analyseprotocol voor de seriële beoordeling van myocardenergetica tijdens hartbehoud. 31P MRS maakt seriële, niet-destructieve beoordeling van belangrijke hartmetabolieten bij verschillende koude opslagtemperaturen mogelijk, wat nieuwe inzichten biedt in de metabole levensvatbaarheid van het myocardweefsel. Dit 31P MRS-protocol is relatief snel en vereist minimale scann...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
We hebben geen belangenconflict.
Wij willen ons team van Johns Hopkins op de afdeling hartchirurgie en radiologie erkennen voor het succesvol uitvoeren van dit onderzoek. Deze studie werd gefinancierd door The American Association for Thoracic Surgery (AATS).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Incubator | Benchmark Scientific | H2265-HC | MyTemp 65HC Heating Cooling Incubator |
| Isoleerkoeler | Gatorade | UPC 052000047097 | Gatorade Geïsoleerde sportdrankkoeler |
| jMRUI versie 7.0 | Java | www.jmrui.eu | Grafische gebruikersinterface voor gegevensanalyse |
| Myocard temperatuur sonde | DeRoyal | 81-030415 | DeRoyal 400 serie myocard temperatuur sonde (15mm) |
| Magnetische resonantie scanner | Philips | https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imaging | Achieva 3T, Philips Healthcare |
| Enkel lus fosfor spoel | Philips Healthcare | https://www.philips.com/healthcare/diagnostic-imaging/magnetic-resonance-imaging | P140, Philips Healthcare |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar