RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interactie methode

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interacties vast te leggen voor het in kaart brengen van RNA-gerelateerde driedimensionale genoomorganisatie.

Samenvatting

RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interactie methode (RDD) is een gerichte strategie voor het in kaart brengen van chromatineinteracties die verankerd zijn door een specifiek RNA. Tegelijkertijd identificeert het genomische loci die geassocieerd zijn met het RNA van belang en lost het langeafstandscontacten tussen DNA-DNA tussen deze loci op, waardoor ruimtelijke organisatie en regulatoire relaties kunnen worden gevolgd. In RDD worden biotinyleerde antisense-probes die complementair zijn aan het doel-RNA gebruikt om RNA-chromatinecomplexen te verrijken. Cellen worden gekruist, chromatine wordt gefragmenteerd en aan het einde gerepareerd, en nabijheidsligatie wordt uitgevoerd met een ontworpen linker om DNA-fragmenten te verbinden die ruimtelijk naast elkaar liggen binnen de gevangen complexen. De ligatieproducten worden gezuiverd, omgezet in sequencingbibliotheken en geanalyseerd met high-throughput sequencing om RNA-verankerde interactiekaarten te genereren. RDD is toepasbaar op endogene RNA's evenals exogene RNA's afkomstig van gastinfecterende micro-organismen en virussen, en het is compatibel met diverse celtypen en experimentele omstandigheden. De methode levert locus-specifieke, hoogresolutie contactprofielen op die geschikt zijn voor het dissectieren van enhancer-promotor koppeling, langeafstandsregulatie en een driedimensionale genoomarchitectuur die geassocieerd is met regulatoire codering en niet-coderende RNA's. Door biochemische verrijking te integreren met proximity ligation en next-generation sequencing, biedt RDD een robuuste en reproduceerbare workflow om te laten zien hoe RNA's chromatine organiseren en genexpressie beïnvloeden.

Inleiding

Hi-C en ChIA-PET hebben studies naar de organisatie van driedimensionale (3D) genoomen getransformeerd door ruimtelijke nabijheid tussen chromatinefragmenten om te zetten in covalente DNA-verbindingen die kunnen worden gesequenced om fysieke contacten af te leiden over schalen van lussen tot compartimenten ^1,2. Naast eiwitten nemen talrijke RNA's deel aan chromatine-interacties, wat de communicatie tussen enhancer/repressor-promotor en de hogere-orde chromatineorganisatie^{beïnvloedt 3}; echter, ondanks vooruitgang in eiwit-geankerde assays, blijft het lastig om direct te bepalen hoe een specifiek RNA langeafstands-DNA-interacties tussen zijn gebonden loci organiseert. Het overkoepelende doel van de RNA-Associated Chromatin DNA-DNA Interaction Method (RDD)⁴ is het genereren van hoogresolutie, RNA-geankerde chromatine-interactiekaarten die laten zien hoe een gedefinieerde RNA-soort met chromatine associeert en DNA-DNA-contacten binnen zijn lokale omgeving orkestreert, waardoor mechanistische afleiding mogelijk is over enhancer/repressor-promotor communicatie en een hogere-orde genoomarchitectuur gecentreerd rond dat RNA⁵. Methodologisch verrijkt RDD crosslinked RNA-chromatinecomplexen met biotinylerende antisense-probes tegen het RNA van belang, voert on-complex proximity ligation uit met een ontworpen linker om ruimtelijk aangrenzende DNA-fragmenten te verbinden, en construeert sequencing-bibliotheken om locus-specifieke contactprofielen te genereren die geschikt zijn voor hypothesegedreven analyses over diverse celtypen en omstandigheden, inclusief contexten met exogene bacteriële of virale RNA's in geïnfecteerde gastheren. Deze kenmerken positioneren RDD als een RNA-verankerde tegenhanger van gevestigde chromosoomconformatiemethoden, en bieden interpreteerbare contactinformatie met resoluties die geschikt zijn voor regulatieanalyse.

De reden voor RDD komt voort uit beperkingen van bestaande RNA-chromatine mapping strategieën. Gerichte capture-benaderingen zoals ChIRP-seq en CHART-seq identificeren genoom-brede DNA-bezetting van één RNA, een paradigma van één RNA tot heel DNA dat binding rapporteert maar niet de fysieke DNA-DNA-contacten tussen bezette loci ^6,7. Wereldwijde assays, waaronder GRID-seq en MARGI, zijn uitgebreid naar alle RNA-nabijheden, waarbij RNA-DNA-nabijheden genoombreed worden gecatalogiseerd, maar het expliciete resolutie van DNA-DNA-contacten binnen RNA-gecentreerde complexen^{ontbreekt 3,8}. Multiplex-methoden zoals RD-SPRITE rapporteren hogere-orde co-lokalisatie tussen veel RNA's en DNA-loci en dragen aspecten van nucleaire topologie⁹ over, maar signalen worden doorgaans gedomineerd door overvloedige RNA's, die laag-abundantie regulerende RNA's kunnen verhullen en de beoogde diepte voor het interactienetwerk van één RNA kunnen beperken. Eiwit- of mark-verankerde verrijking-plus-ligatiestrategieën, zoals ChIA-PET¹⁰, PLAC-seq¹¹ en HiChIP¹², brengen effectief factor-gecentreerde lussen in kaart maar verankeren interacties niet aan een gedefinieerd RNA zonder een RNA-specifieke capturemodule, waardoor de RNA-geankerde DNA-DNA-dimensie onopgelost blijft. Door gerichte biochemische verrijking te integreren met on-complex proximiteitsligatie, vangt RDD direct DNA-DNA-contacten tussen chromatinefragmenten die samen met het RNA van belang^{worden ingenomen}, verhoogt het de gevoeligheid en specificiteit voor RNA's met lage tot matige abundantie, en genereert het hoogresolutie, locus-specifieke contactkaarten die bezettingscentrische (ChIRP/CHART)^6,7 en proximiteit-centrische globale methoden (GRID-seq/MARGI/RD-SPRITE)^{3, 8,9} terwijl conceptueel parallelle eiwitfactor-verankerde ligatiestrategieën (ChIA-PET/PLAC-seq/HiChIP) worden gevolgd10,11,12. Lezers zouden RDD moeten overwegen wanneer een biologische vraag ruimtelijke relaties tussen chromatineloci die specifiek geassocieerd zijn met een doel-RNA vereist – vooral wanneer dat RNA verondersteld wordt langeafstands-genomische interacties te ondersteunen, te overbruggen of te beperken om transcriptie af te stemmen – of wanneer zij veronderstelde regulerende doelen uit de bindingsset van een RNA prioriteren, waarbij directe RNA-gecentreerde hubs worden onderscheiden van louter co-occupantie, het afbakenen van enhancer-/repressornetwerken voor specifieke RNA's, of het volgen van herbedrading van RNA-verankerde contacten over verstoringen, ontwikkelingsstadia of infecties. In dergelijke scenario's pakt RDD een onvervulde behoefte aan door RNA-verankerde DNA-DNA-interactie-informatie te leveren met de gevoeligheid, specificiteit en resolutie die nodig zijn voor rigoureuze mechanistische studies.

Protocol

OPMERKING: Voor deze RDD-methode gebruikt het voorbeeldsysteem Drosophila S2-cellen en zowel de roX2 - als 7SK ncRNA's; reactiereagentia staan vermeld in Tabel 1, buffersamenstellingen zijn in Tabel 2, reagensdetails en instrumentdetails zijn in Materiaal. Figuur 1 geeft een overzicht van het protocol voor het genereren van RDD-bibliotheken. Procedures waarbij rotatie (F8) betrokken is, gebruiken de volgende parameters: F8, 20 rpm, uu20 en UU30. Voor alle buffers die van Stap 2 tot Stap 10 worden gebruikt, kun je vers aanvullen met een 1x proteïnase-remmer (PI) en een RNase-remmer (RI, 0,05 U/μL).

Probe-ontwerpprincipes: Voor nieuw, niet-gerapporteerd RNA ontwerp je probes online met de Stellaris Probe Designer, filter vervolgens niet-specifieke sequenties eruit met behulp van uitlijningstools (bijv. BLAST-achtige uitlijning) of UCSC BLAT, gevolgd door 3′-biotinylatie van de geselecteerde probes. Voor nieuwe doel-RNA's ontwerpen sequenties die overeenkomen met het doel-RNA om als negatieve controles te dienen, ook onderworpen aan 3′-biotinylering. Kwaliteitscontrole omvat het ontwerpen van reverse transcriptieprimers tegen het doel-RNA voor transcriptievalidatie en genomische DNA-gerichte primers voor qPCR om contaminatie te beoordelen; Includeer primers die genomische bindingsplaatsen en niet-bindende regio's lokaliseren om de bindingsspecificiteit te evalueren. roX2 - en 7SK-gerelateerde sondes zijn weergegeven in Tabel 1.

1. Celoogst en dubbele kruisverbinding

1. Kweek Drosophila S2-cellen bij 27 °C. Streef ernaar om in totaal ongeveer 3 x 10 cellen van⁹ te verzamelen. Sussen de cellen direct opnieuw in het kweekmedium en na trypan-blauw tellen 8 x 10^{cellen in} elke 50 mL conische centrifugebuis plaatsen.
   1. Meng 2 μL cellen met 8 μL DPBS, voeg 10 μL Trypan Blue toe en laad vervolgens op de hemocytometer voor celtelling.
      OPMERKING: Drosophila S2-cellen worden als voorbeeld gepresenteerd. Typisch komen 8 x 10^{8 cellen} overeen met ongeveer 40 mL kweekvolume verwerkt in één enkele 50 mL conische buis. Gebruikers kunnen de kweekomstandigheden aanpassen en celhoeveelheden oogsten op basis van het gebruikte celtype en de hoeveelheid van het doel-RNA.
2. Voeg formaldehyde toe tot een uiteindelijke concentratie van 1% (w/v) en draai 20 minuten op 27 °C.
   OPMERKING: Voer fixatie uit bij kweektemperatuur of bij kamertemperatuur (RT; 20-25°C). Tenzij vermeld, wissel de mixer aan (F1, 12 rpm). Voor hechtende cellen gebruik je een orbitale shaker (50 rpm).
   VOORZICHTIG: Formaldehyde is giftig; Gebruik een afzuigkap.
3. Pelletcellen op 845 x g gedurende 5 minuten bij RT; Gooi supernatant weg naar het juiste chemische/biologische afval. De celpellet van 8 x 10⁸ S2-cellen is doorgaans ongeveer 1 cm³ in volume.
4. Suss de pellet opnieuw in vers bereide 2 mM EGS tot een totaal volume van 40 mL in DPBS, en draai 40 minuten op 27 °C.
   OPMERKING: Los EGS op in DMSO en zet over naar DPBS (zie Tabel 2). EGS in DMSO is gevaarlijk.
5. Quench door 2 mL 2,5 M glycine toe te voegen (definitieve 0,125 M); Draai 10 minuten op 27 °C.
6. Pellet op 845 x g voor 5 minuten bij RT; Gooi supernatant weg naar het juiste chemische/biologische afval. Was pellet twee keer met 40 ml voorverwarmde DPBS bij 27 °C.
7. Pellet op 845 x g gedurende 5 minuten. Susstrueer de celpellet opnieuw in 10 ml DPBS en tel cellen. Het aantal cellen kan tijdens de crosslinking-stap afnemen, meestal met ongeveer 30%.
8. Aliquot 1 x 10 cellen van⁹ cellen in elke 50 mL buis; pellet op 845 x g voor 5 minuten bij RT; Gooi supernatant weg. Bewaar de pellets bij −80 °C.
   OPMERKING: Alle volgende reactiestappen zijn voor één RDD-bibliotheek.

2. Cellyse en kernpermeabilisatie

1. Neem 1 x 10 stuks⁹ S2 dubbelgekruiste gekruiste cellen uit de −80 °C vriezer. Ontdooi op ijswater gedurende 30 minuten.
2. Suspendeer de cellen opnieuw in 50 mL DPBS, centrifugeer op 845 x g gedurende 5 minuten bij RT en gooi het supernatant weg.
3. Cellyse: Susselt de celpellet opnieuw in 20 mL 0,1% FA-lysebuffer (zonder Triton X-100). Roteer 15 minuten bij RT. Controleer met een microscopie; Pas de tijd aan op celtype. Succesvolle lysis wordt aangegeven door plasmamembraanpermeabilisatie en cytoplasmatische afgifte, zodat kernen gemakkelijk zichtbaar worden als afzonderlijke structuren onder een standaard lichtmicroscoop (Figuur 2A).
4. Permeabilisatie van kernen: Voeg 1,8 mL toe van 10% SDS (laatste 1%). Draai 15 minuten op 37 °C. Centrifugeer op 3.200 x g gedurende 20 minuten bij RT en gooi het supernatant weg. Controleer met microscopie (Figuur 2B); Pas de tijd aan op celtype. Kernen lijken donkerder, membraan-sluierachtig, of sommige zijn losgeraakt. Herhaal dit tot de lysis voltooid is.
5. Nucleus wash: Suss de pellet opnieuw in een 20 mL 0,1% FA lysisbuffer (zonder Triton X-100), draai 10 minuten op RT, centrifugeer dan op 3.200 x g voor 20 minuten bij RT, gooi het supernatant weg en markeer de grootte van de kernpellet. Bewaar de kernpellet bij −80 °C voor later gebruik.

3. Chromatinefragmentatie

1. Sussief de kernpellet opnieuw in 15 mL 0,1% FA-lysebuffer (met Triton X-100). Aliquot 1,5 mL van de kernsuspensie in elke 14 mL ronde bodem reageerbuis, zonder belletjes te voorkomen.
   1. Markeer de pelletgrootte vóór de sonicatie ter vergelijking en herhaal de sonicatie als de pellet na de sonicatie groot blijft.
2. Sonicate op amplitude 38% gedurende 4,5 minuten, met 30 s AAN / 30 s UIT cycli. Verzamel alle sonicatiechromatine in een 15-mL buis en centrifugeer op 3.200 x g gedurende 20 minuten bij RT, en breng dan het supernatant (~13 mL) over in een nieuwe 15-mL buis.

4. Preclear chromatine met C1-kralen

1. Bereid Streptavidin C1-kralen voor: Aliquot 400 μL Streptavidine C1-kralen in een 1,5 mL buis (100 μL per 1 × 10^{à 9} S2-cellen), plaats deze 30 seconden op de magneet en verwijder het supernatant. Was twee keer met 200 μL 0,1% FA lysisbuffer (met Triton X-100), en doe daarna opnieuw in 100 μL 0,1% FA lysisbuffer (met Triton X-100).
2. Chromatinepreclear: Voeg de 100 μL voorbereide Streptavidine C1-kralen toe aan de buis met ~13 mL sonicated chromatine supernatant (vanaf stap 3.2); 20 minuten rouleren bij RT; plaats het op een magnetisch rek voor 1 minuut en breng het supernatant (vooraf vrijgegeven chromatine) over in nieuwe 50-mL buizen; Neem 10 μL en bewaar bij −20 °C voor QC1 (Figuur 3A).

5. Hybridiseer de RNA-probe met de vooraf vrijgegeven chromatine

1. Voeg 2 volumes (26 mL) van vers bereide Hybridisatiebuffer toe aan 1 volume (13 mL) voorgezuiverde chromatine; Roteer 30 minuten bij RT.
2. Aliquot het mengsel in drie 15-mL buizen; voeg 6 μL van 100 μM biotinyleerde probes (DNA-oligonucleotide, Tabel 1) toe aan elk monster (2 μL per buis van 15 mL); Draai 's nachts op 37 °C. Sluit buisdoppen af met folie.

6. Immobilisatieprobe - chromatinecomplex op C1-kralen

1. Blok Streptavidine C1-kralen met blokkerende buffer: Neem 400 μL verse streptavidine C1-kralen en was twee keer met 800 μL 0,1% FA-lysebuffer (zonder Triton X-100); voeg 400 μL Blocking Buffer toe en incubeer op een mixer (F8) gedurende 30 minuten bij RT. Plaats het op een magneet gedurende 10 minuten en gooi het supernatant weg; Was drie keer met 800 μL 0,1% FA lysisbuffer (zonder Triton X-100). Voor elke wasbeurt pipette je voorzichtig om te mengen, plaats je het op de magneet voor minstens 30 seconden en gooi je het supernatant weg.
2. Susselt de C1-kralen opnieuw in 400 μL hybridisatiebuffer.
3. Immobiliseer het probe-chromatinecomplex op Streptavidine C1-kralen: Voeg de met Blocking Buffer behandelde streptavidine C1-kralen toe aan de bijbehorende gehybridiseerde chromatine en draai 2,5 uur bij RT.
4. Breng de immobiliseringsreactie over van 15-mL buizen naar een 1,5 mL buis met behulp van een magnetisch rek. Plaats elke 15-mL buis 5 minuten op een magnetisch rek; Verwijder het supernatant. Suss de kralen opnieuw met 1 ml Wash buffer en zet het over op een nieuwe 1,5 mL buis.
5. Was de kralen vijf keer met 800 μL Wash buffer, daarna twee keer met TE-buffer. Om te wassen, voeg je buffer toe, incubeer je op een mixer (F1, 12 rpm) 5 minuten op 37 °C, plaats je het op een magnetisch rek voor 30 seconden en gooi je het supernatant weg.
6. Houd de kralen in 1.000 μL TE-buffer (1x PI) op RT.

7. Blokkeren van onbezette locaties op C1-kralen met gedenatureerde jodoacetyl-PEG2-biotine (IPB)

1. Los 4,8 mg IPB op in 400 μL IPB Wash buffer; Wissel 15 minuten op RT.
2. β-ME oplossing: Voeg 1 μL β-ME toe aan 312 μL H₂O; Mix en wissel 15 minuten bij RT.
3. Denatureer IPB: Voeg 44 μL van de β-ME-oplossing toe aan 400 μL IPB; Mix en wissel 15 minuten bij RT.
4. Blokkeer de C1-kralen: Voeg 220 μL van de gedenatureerde IPB toe aan de C1-kralen die gebonden zijn met het probe-chromatinecomplex (in 1.000 μL TE); Wissel 15 minuten op RT.
5. Was de C1-kralen vijf keer met TE. Voeg buffer toe, incubeer op een mixer (F8) 5 minuten bij RT, plaats het dan 30 seconden op een magnetisch rek en gooi het supernatant weg.

8. Chromatine-eindreparatie (op kralen)

1. Voeg 693 μL eindreparatiemengsel toe aan de chromatine op C1-kralen en meng goed; voeg vervolgens 7 μL T4 DNA-polymerase toe.
2. Incubeer op thermomixer (800 rpm) bij 12 °C gedurende 30 minuten; daarna op mixer (F8) op 16 °C gedurende 15 minuten.
3. Was de kralen drie keer met 800 μL ijskoude ChIA-PET-buffer, daarna één keer met TE. Voor elke wasbeurt pipette je voorzichtig om te mengen, plaats je het op de magneet voor minstens 30 seconden en gooi je het supernatant weg.

9. Chromatine A-tailing (op kralen)

1. Voeg 693 μL A-tailingmengsel toe aan de chromatine op C1-kralen en meng goed, voeg dan 7 μL Klenow-fragment toe (3'-5' exo-).
2. Incubeer op een mixer (F1, 12 rpm) bij 37 °C gedurende 50 minuten. Was de kralen drie keer met 800 μL ijskoude ChIA-PET buffer, en daarna één keer met elution-buffer.

10. Chromatine-nabijheidsligatie (op kralen)

1. Voeg 1.390 μL proximity ligation mengsel toe aan de chromatine op C1-kralen. Incubeer op mixer (F8) bij RT gedurende 5 minuten.
2. Voeg dan 10 μL T4 DNA-ligase toe. Draai 5 minuten op de mixer (F8) op RT, schakel dan 50 minuten over op F1 (12 rpm) bij RT, gevolgd door 16 °C 's nachts.
3. Was de kralen drie keer met 800 μL ijskoude ChIA-PET-buffer, daarna twee keer met TE-buffer.

11. Het vrijgeven van het proximiteit-geligeerde chromatine-DNA uit de C1-kralen

1. Voeg 480 μL LC ChIP elusjonsbuffer toe aan de chromatine op C1-kralen, meng goed, en voeg 20 μL 20 mg/mL proteïnase K toe voor het decrosslinken.
2. Incubeer op een thermomixer (950 rpm) bij 65 °C gedurende de nacht.

12. Nabijheidsgeligeerde DNA-zuivering (met fenol: Chloroform: IAA-reagentia)

1. Draai de high-density phase-lock tube op 13.500 x g gedurende 2 minuten bij RT. Voeg gede-crosslinked producten (500 μL) toe aan de high-density phase-lock tube.
2. Voeg 500 μL fenol:Chloroform:IAA (met een pipettip van 5 mL) toe aan de fasevergrendelingsbuis met hoge dichtheid. Meng voorzichtig met de hand.
   VOORZICHTIG: Voer uit in een afzuigkap.
3. Centrifugeer op 13.500 x g voor 6 minuten bij RT. Tijdens het centrifugeren bereid je een buis van 1,5 mL voor door 52 μL 3 M natriumacetaat (pH 5,5) aan de onderkant toe te voegen. Plaats 1 μL glycogeen met blauwe kleurstof op de dop. Meng of sluit de buis op dit punt niet.
4. Breng het supernatant snel over van de high-density fasevergrendelingsbuis naar de voorbereide 1,5-mL buis.
5. Voeg 520 μL ijskoude isopropanol toe aan de 1,5 mL buis. Meng voorzichtig en plaats het dan 's nachts op -80 °C.
6. Haal de buis van -80 °C en ontdooi bij RT (~10 min). Centrifugeer op 13.500 x g gedurende ~1 uur bij 4 °C om DNA neer te slaan. Er zal een blauwe pellet op de bodem van de buis aanwezig zijn.
7. Was de DNA-pellet met 75% ethanol en verwijder voorzichtig het supernatant. Voeg 800 μL 75% ijskoude ethanol toe, centrifugeer op 13.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, en verwijder het supernatant. Herhaal de ethanolwas één keer.
   VOORZICHTIG: Verwijder het supernatant direct na centrifugatie: eerst met een 1-mL tip, daarna met een 100-μL tip. Warme buizen kunnen de blauwe pellet losmaken.
8. Na de laatste ethanolwasbeurt centrifugeer je op 13.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om eventueel restanten van ethanol op de bodem op te vangen, en verwijder daarna voorzichtig de resterende ethanol.
9. Droog de DNA-pellet in een vacuüm (meestal 1 minuut 30 seconden tot 2 minuten). Suspendeer de DNA-pellet opnieuw in 10 μL elutiebuffer en incubeer bij RT gedurende ongeveer 2 uur. Kwantificeer het DNA met een nucleïnezuurkwantificeerder en beoordeel de kwaliteit met een automatisch capillair elektroforesesysteem (Figuur 3B-C).

13. Proximiteit-geligeerde DNA Tn5-tagmentatie

1. Tn5 Tagmentatietest: Bereid een totaal reactievolume van 50 μL voor volgens Tabel 1. Voeg in een PCR-buis op ijs achtereenvolgens 50 ng QC1-DNA, ddH₂O, en 12,5 μL 4x Tagmentatiebuffer toe. Voeg tenslotte de benodigde hoeveelheid Tn5-enzym toe. Meng voorzichtig door 10 tot 20 keer na elke toevoeging op en neer te pipetteren, zodat je belletjes vermijdt. Draai de buis kort door als dat nodig is.
   OPMERKING: Voorzichtig mengen en bellen vermijden is cruciaal voor de tagmentatie. Daarnaast moet de hoeveelheid Tn5 empirisch worden geoptimaliseerd om de gewenste fragmentverdeling te bereiken (voornamelijk 200 bp-1 kb), en gebruikers kunnen het groottebereik aanpassen door de Tn5-ingang af te stemmen.
2. Tagmentatie-reactie: Incubeer de reactie bij 55 °C gedurende 10 minuten in een PCR-instrument met het deksel ingesteld op 70 °C, en houd het daarna vast op 4 °C.
3. Tn5-afgifte en DNA-zuivering: Voeg 50 μL ChIP Elutionbuffer en 1 μL Proteinase K toe aan het getagmenteerde DNA (voor een uiteindelijke SDS-concentratie van 0,5%). Meng en incubeer op de thermomixer bij 65 °C en 900 rpm gedurende 30 minuten. Zuiver het DNA met een DNA-zuiveringskit en kwantificeer DNA met een automatisch capillair elektroforesesysteem (Figuur 3D).
   OPMERKING: In dit stadium zouden DNA-fragmenten voornamelijk moeten variëren van 200 bp tot 1 kb. De verhouding tussen Tn5-enzym en DNA moet empirisch geoptimaliseerd worden.
4. Tn5 Tagmentatie-opschaling: Op basis van de Tn5-testresultaten schaal je de reactie op voor proximiteit-geligeerd DNA met dezelfde omstandigheden. Na het taggen haal je het monster uit het PCR-instrument en leg je het op ijs. Kort spin down, incubeer 2 minuten bij RT, voeg dan 5,5 μL van 10% SDS toe (met /v; uiteindelijke SDS-concentratie: 1%). Meng door 10 tot 20 keer op en neer te pipetteren, waarbij je bellen vermijdt, en kort naar beneden draait. Incubeer monsters bij 37 °C in een PCR-instrument gedurende minstens 15 minuten. Getagmenteerd DNA kan enkele dagen worden opgeslagen bij -20 °C.

14. Blokkerende M280-kralen

1. Neem 20 μL M280-kralen en was twee keer met 200 μL 1x zwart-wit buffer. Om te wassen, voeg je buffer toe, suspendeer de kralen opnieuw door te pipetteren, draai kort naar beneden, plaats het 30 seconden op een magneet en verwijder het supernatant.
2. Kraalblokkering met blokkeringsbuffer: Suspendeer de M280-kralen opnieuw in 100 μL blokkeringsbuffer; Wissel 45 minuten op mixer (F8) bij RT.
3. Bead washing: Kort draaien, 10 minuten op de magneet leggen en de Blocking buffer weggooien. Was de kralen twee keer met 200 μL 2x B&W buffer.
4. Bead blocking met genomisch DNA: Repussing de kralen in 100 μL 2x B&W buffer, voeg 100 μL gescheurd genomisch DNA toe (~500 ng, 300-500 bp), meng goed en draai op menger (F8) op RT gedurende 30 minuten.
5. Verwijder het genomische DNA-mengsel en was de kralen twee keer met 200 μL 1x B&W-buffer.

15. Immobilisatie van geligeerd DNA op M280-kralen

1. Binden van geligeerd DNA aan M280-kralen: Verwijder 1x zwart-wit buffer. Voeg al het gefragmenteerde geligeerde DNA toe aan de M280-kralen, meng en draai 45 minuten op de mixer (F8) bij RT.
2. Draai kort naar beneden, plaats het op de magneet en gooi supernatant weg. Was kralen vijf keer met 500 μL voorverwarmde wasbuffer bij 37 °C; één keer met 500 μL van 1x B&W; en één keer met 200 μL 1x B&W. Plaats het 1 minuut op een magneet, meng voorzichtig op de buisbodem en gooi supernatant weg. Voeg 30 μL elutiebuffer toe aan de kralen (niet mengen).
   1. Om te wassen, voeg je buffer toe, incubeer je 5 minuten op de mixer (F8), plaats je het op de magneet, en gooi dan supernatant weg. Kralen met gebonden geligeerd DNA kunnen worden opgeslagen bij -20 °C.

16. Amplificatie van geligeerd DNA op M280-kralen

1. Bereid een PCR-reactie voor (volgens de DNA-bibliotheekvoorbereidingskit). Breng de PCR-buizen over naar de PCR-machine en stel het programma in.
   OPMERKING: PCR-versterkingscycli zijn cruciaal voor de uiteindelijke bibliotheekkwaliteit; Het verhogen van het aantal cycli vermindert de complexiteit van de bibliotheek. Optimaliseer het aantal cycli empirisch en overschrijd over het algemeen niet de 15 cycli.
2. Zuiver het PCR-product met magnetische kralen (Figuur 3E). Groottekeuze: Gebruik (0,8-0,61) magnetische kralen om de RDD-bibliotheek dubbel te selecteren.
   1. De uiteindelijke DNA-bibliotheek zou voornamelijk moeten variëren van 250 tot 600 bp (Figuur 3F). Zorg ervoor dat 10-30 ng bibliotheek-DNA wordt gemeten met een nucleïnezuurkwantor voor sequencing.
3. Sequencing: onderwerp voor Illumina-sequencing met 2x 150 bp. De sequencingdiepte hangt af van RNA-expressie, dichtheid van bindingsplaatsen en genome-brede patronen. Hier verzadigt roX2 bij ~23 miljoen leesopdrachten en 7 SK bij ~8 miljoen lees, dus de laatste heeft minder diepte nodig. Begin per soort, beoordeel dan de redundantie voor eventuele extra diepte: ~5M voor Drosophila, ~20M voor mens/muis, aangepast aan QC-metriek.

Resultaten

Dit protocol beschrijft de RDD-methode voor het detecteren van RNA-geassocieerde chromatine DNA-DNA interacties. De workflow begint met biochemische verrijking van RNA-chromatinecomplexen met behulp van biotinyleerde probes, gevolgd door proximity ligation om ruimtelijk aangrenzende DNA-fragmenten te koppelen. Na het construeren van sequencing-bibliotheken wordt high-throughput sequencing uitgevoerd.

Bio-informatische analyse van RDD-gegevens wordt gestroomlijnd door het ChIA-PIPE platform¹³. Belangrijke stappen in deze analytische pijplijn zijn: het trimmen van sequencing-linkers uit ruwe reads, het koppelen van reads aan het referentiegenoom, filteren voor uniek gemapte leesparen, het verwijderen van PCR-duplicaten en het toewijzen van interacties aan gerichte RNA-locaties op basis van probecoördinaten. Typisch wordt ongeveer 50% van de gesequenteerde reads succesvol behouden na linker- en kwaliteitsfiltering. Geldige interactiegebeurtenissen werden vervolgens geaggregeerd om locus-specifieke contactkaarten te genereren, die gedetailleerde profielen van de RNA-geleide chromatinearchitectuur opleverden. Voor RDD-gegevens hebben we drie ChIA-PIPE-aanpassingen geïmplementeerd: de RDD-linkersequentie ("ACGCGATATCTTATCTGACT") werd gebruikt in plaats van de standaard ChIA-PET-linker ("ACGCGATGGCTCTCTGACT"); lusclustering werd uitgevoerd met een verkorte PET-extensie van 50 bp naast de standaard 500 bp om de positionele precisie van RNA-interactieplaatsen te verhogen; en RNA-verrijkingsdekking werd berekend met deepTools (bamCoverage v3.5.1) met een bin-grootte van 1 bp. Deze aanpassingen - linkerconfiguratie, verminderde PET-extensie voor fijnere clustering, en hoogresolutie coverage-adapted ChIA-PIPE voor de RDD-bibliotheken.

Figuur 4 toont representatieve RDD-resultaten voor twee niet-coderende RNA's: roX2¹⁴ (Figuur 4A,C; groen), een doseringscompensatiecomplex RNA dat betrokken is bij het reguleren van de X-chromosoomstructuur en genexpressie bij Drosophila, en 7SK¹⁵ (Figuur 4B,D; paars), een sterk geconserveerd klein nucleair RNA dat transcriptie-elongatie moduleert door de activiteit van P-TEFb in metazoa te reguleren. RNA-binding en chromatine-interacties die door RDD worden gedetecteerd, worden samen met RNAPII ChIA-PET-gegevens (blauwe bogen) gevisualiseerd, waarmee de structurele relatie tussen RNA-geassocieerde lussen en belangrijke regulerende elementen zoals promotoren (P), enhancers (E) en transcriptiestart- of eindplaatsen (TSS/TES) wordt benadrukt. Prominente interactiepieken in de geaggregeerde data ondersteunen een model waarin zowel roX2 als 7SK kritische enhancer-promotor of langeafstandschromatinecontacten mediëren.

Multidimensionale analyse wordt bereikt door RDD-verankerde interacties te integreren met Hi-C genoombrede chromatineconformatiekaarten (onderste paneel rode heatmaps) en epigenomische markeringen (H3K27ac, H3K27me3), beginnende transcriptie (RNA-seq) en RNAPII ChIA-PET-gegevens (Figuur 4C,D). In deze regio's worden topologisch associerende domeinen (TAD's) duidelijk zichtbaar, waarbij RNA-geleide chromatinelussen vaak aan TAD-grenzen liggen of meerdere TAD's beslaan. Aanvullende annotatie met histonmodificatie en transcriptiegegevens maakt onderscheid mogelijk tussen actieve en inactieve chromatineregio's. Belangrijke RNA-centrische regulerende hubs zijn in de figuur omcirkeld.

Er ontstaan duidelijke patronen voor verschillende ncRNA's. roX2 wordt gekenmerkt door binding in TES-gebieden en lussen naar TSS'en, waarbij vaak gelokaliseerde bij TAD-grenzen en langeafstandscontacten worden gevormd die meerdere TAD's kunnen kruisen. Daarentegen bindt 7SK voornamelijk aan enhancers en vormt kortere loops met naburige promotors, meestal zonder TAD-grenzen te passeren.

Gezamenlijk bevestigen deze resultaten dat RDD een betrouwbare en hoogresolutiemethode is voor het dissectieren van RNA-specifieke 3D-chromatineorganisatie. Deze aanpak maakt direct onderzoek mogelijk naar de ruimtelijke rollen van regulerende RNA's in genoomarchitectuur en genexpressie in diverse biologische omgevingen.

Figuur 1: Schema van de RDD-bibliotheekgeneratieworkflow. De centrale workflowstappen voor het genereren van RDD-bibliotheken worden in volgorde weergegeven en vergezeld van bijbehorende schematische illustraties. De procedure begint met dual-crosslinking en chromatinetagmentatie, gevolgd door hybridisatie met een biotine-gemodificeerde RNA-probe en immobilisatie via streptavidine. Vervolgstappen omvatten A-tailing, proximity ligation met biotine-gemodificeerde linkers en bibliotheekconstructie. Na het ligateren van het DNA worden zuivering, Tn5-gemedieerde fragmentatie, biotineverrijking en bibliotheekamplificatie uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve microscopiebeelden van Drosophila S2-cellen die visuele kwaliteitscontrolecriteria voor cellyse en kernpermeabilisatie aantonen. (A) Succesvolle cellyse wordt gekenmerkt door plasmamembraanpermeabilisatie en cytoplasmatische afgifte, waardoor de kernen duidelijk zichtbaar worden. (B) Succesvolle kernpermeabilisatie wordt aangegeven door celzwelling, gedeeltelijke loslating van het plasmamembraan en intacte, duidelijk zichtbare kernen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Elektroferogramanalyse van chromatinepreparaten. Screenshot van een capillair elektroforesesysteem met elektroferogrammen die verschillende chromatinemonsters profileren. (A) Toont gefragmenteerde chromatine (sonicatie) met een grootte variërend van ongeveer 1000 tot 3000 bp, wat wijst op geslaagde fragmentatie. (B) Illustreert chromatine geassocieerd met RNA (RNA-geassocieerd + ongebonden probes), met een kleinere piek die ongebonden probes vertegenwoordigt, zoals aangegeven door de pijl. (C) Toont RNA-geassocieerd chromatine, eveneens met een concentratiebereik van 1000 tot 3000 bp, wat RNA-eiwitcomplexen weerspiegelt. (D) Toont chromatine getagd met Tn5, wat een bereik toont dat de tagmentatie-efficiëntie aangeeft. (E) Toont de fragmentgrootteverdeling van de sequencingbibliotheek na amplificatie, die ongeveer 180-1000 bp beslaat. (F) Toont de fragmentgrootteverdeling van de sequencingbibliotheek na grootteselectie, waarbij fragmenten voornamelijk verrijkt zijn in het ~250-600 bp-bereik. De RFU (relatieve fluorescentie-eenheden) waarden worden voor elk monster aangegeven, wat een effectieve kwantificering van chromatineintegriteit en -grootte aantoont. De paarse pieken vertegenwoordigen de markering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve resultaten van RDD voor ncRNA-geassocieerde chromatineinteracties. (A-B) Toont de genomische locaties van ncRNA roX2 (groen) en 7SK (paars) binding, samen met de bijbehorende remote chromatine interactielussen. Gegevens van RNAPII ChIA-PET (blauw) tonen een duidelijke regulatorische relatie tussen deze ncRNA's en genexpressie, met pieken die de interactiesterkte aangeven. Afkortingen: TSS = transcriptiestartplaats; TES = transcriptie-eindplaats; P = promotor; E = versterker. (C-D) Biedt een hoger dimensionaal beeld van de relatie tussen ncRNA roX2- en 7SK-gerelateerde chromatinelussen en TAD's (rood), evenals de verschillende actieve versus inactieve chromatinetoestanden en genexpressieniveaus. Cirkels markeren gebieden met significante interacties tussen TADs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: RDD-reactiereagentia. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: RDD-buffercomposities. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Kritieke stappen in de methode
Het schatten van de hoeveelheid RNA-probes en de bijbehorende RNA-niveaus in chromatine is cruciaal. Overmatige probes kunnen ertoe leiden dat ongebonden probes streptavidine-plaatsen bezetten tijdens de immobilisatiestap, wat de beoogde vangst van doel-RNA-interacties kan belemmeren. Bovendien verspilt te veel streptavidine materialen en vereist het meer gedenatureerde IBP voor effectief blokkeren van braakliggende terreinen. Onvoldoende blokkering kan de efficiëntie van latere proximiteitsligatie negatief beïnvloeden, vooral omdat de proximiteitsligatielinker ook biotinemodificaties bevat. Als blokkering niet voldoende wordt uitgevoerd, kunnen delen van de linker direct aan de streptavidine-kralen binden, wat de resultaten bemoeilijkt. Bovendien moet de verhouding van linker tot chromatine zorgvuldig worden geschat—te veel linker kan ervoor zorgen dat beide uiteinden van chromatine-DNA worden getagd, waardoor effectieve proximiteitsligatie wordt geremd.

Aanpassingen van de methode
In deze studie illustreren we de RDD-methode met Drosophila S2-cellen en roX2 ncRNA als voorbeeld. De reagensvolumes moeten worden aangepast op basis van celtype en ncRNA-expressieniveaus; als de ncRNA-expressie hoog is, kan men de celhoeveelheid verminderen of de concentratie van RNA-probe verhogen, en omgekeerd. Hoewel dit protocol chromatine op kralen immobiliseert, bestaat een alternatieve benadering uit het uitvoeren van in situ nabijheidsligatie gevolgd door verrijking met RNA-probes.

Specificiteit, controles en kwaliteitscontrole
We beschreven en valideerden eerder RDD en voerden parallelle RDD's uit op meerdere RNA's, waarbij sterke specificiteit werd aangetoond; Lezers kunnen verwijzen naar het eerdere werk ^4,16. RDD vereist probe-afhankelijke, locus-specifieke verrijking die reproduceerbaar is en, waar mogelijk, orthogonaal gevalideerd is. Echte interacties voldoen aan drie criteria: verrijking bij probe-gerichte loci versus nabijgelegen niet-bindende gebieden; probe-afhankelijkheid (afwezig of sterk verminderd bij negatieve controles); en reproduceerbaarheid over biologische replicaties en onafhankelijke validatie (bijv. RT-qPCR). Antisense-probes zijn ontworpen met Stellaris, gescreend door BLAST/BLAT om off-target te verwijderen, besteld met 3'-biotine en gevalideerd door RT en qPCR (inclusief DNA-contaminatiecontroles en verrijking van locatie versus niet-locatie). We raden drie controles aan – no-probe, scramble/non-targeting en niet-gerelateerde RNA- of non-bindingsregio-probes – en beoordelen de specificiteit door qPCR- of sequencingdekking te vergelijken tussen doel- en controlemonsters, waarbij fold-enrichment en achtergrond worden gerapporteerd. Voor RNA's met lage abundantie verhoog je de probedichtheid (binnen off-target beperkingen), verhoog je de sequencingdiepte en voer je orthogonale validatie uit.

Probleemoplossing voor de methode
Als de gevangen RNA-chromatine interacties opvallend laag zijn, kan de efficiëntie van nabijheidsligatie geoptimaliseerd moeten worden door aanpassingen van linker- en chromatinehoeveelheden. Daarnaast werden hoge pieken van ongebonden probes waargenomen via automatische capillaire elektroferogrammen. De resultaten geven aan dat er te veel probes zijn toegevoegd, wat kan worden opgelost door de gebruikte hoeveelheid te verminderen.

Beperkingen van de methode
Een belangrijk voordeel van de RDD-methode is de efficiëntie in het vastleggen van specifieke RNA-geassocieerde chromatineinteracties, wat betekent dat elk experiment zich slechts op één specifiek RNA tegelijk kan richten. Bovendien kunnen proximiteitsligatie ontworpen om paargewijze interacties te detecteren, waardoor interacties op meerdere locaties niet gelijktijdig kunnen worden beoordeeld.

Betekenis van de methode
De RDD-methode onthult niet alleen RNA-bindingsplaatsen, maar verduidelijkt ook de interactierelaties tussen deze plaatsen, wat ons begrip van chromatinearchitectuur vergroot.

Praktische toepassingen en toekomstig potentieel van RDD
RDD is geschikt voor diverse chromatine-geassocieerde RNA's, waaronder endogene gastheer-RNA's en exogene RNA's van virussen of andere micro-organismen, wat de brede toepasbaarheid in verschillende onderzoeksvelden benadrukt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G
1 M Magnesiumacetaat	Sigma-Aldrich	63052-100ML
1 M Tris-HCl pH 7,0	Invitrogen	AM9851
1 M Tris-HCl pH 8,0	Invitrogen	AM9856
1,5-mL buisjes	Eppendorf	30108051
10 mM dATP	Invitrogen	18252015
10% SDS (wt/vol)	Invitrogen	AM9822
10 × A-tailing buffer	NEB	B7002S
10 × End-repair buffer	NEB	B6002S
10 × T4 DNA ligase buffer	NEB	B0202S
10 × TBE buffer	Invitrogen	AM9863
14-mL ronde bodem testbuisjes	Corning	352057
2 × PCR master mix	NEB	M0541
20 × SSC buffer	Invitrogen	AM9770
200-μL PCR buisjes	Sangon Biotech	F611541-0010
250-mL vierkante PET-opslagflessen	Corning	431531
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250-100mL	! WAARSCHUWING β-ME is giftig; gebruik het altijd in een afzuigkap.
2-mL buisjes	Eppendorf	22431048
3 M Natriumacetaat pH 5,5	Invitrogen	AM9740
5 M NaCl	Invitrogen	AM9759
5 M Kaliumacetaat	Sigma-Aldrich	95843-100ML-F
500-mL vierkante PET-opslagflessen	Corning	431532
Analytische weegschaal	Sartorius	BP211D
Automatische celteller	Counterstar	IC1000
Automatisch capillaire elektroforesesysteem	Bioptic	C100100
Gelabelde sondes	GENEWIZ		Zie Tabel 1
Blockingpoeder	Invitrogen	T2015
Bridge linker oligo's	GENEWIZ		Zie Tabel 1
CO2 incubator	Thermo Scientific	51033549
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100mL
DNA bibliotheekvoorbereidingskit V2 voor Illumina	Vazyme	TD501
DNA zuiveringskit	Zymo	D4013
Dulbecco’s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) (1 ×)	Gibco	14190250
EDTA-vrije protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
EGS (Ethyleenglycol bis[succinimidylsuccinaat])	Thermo Scientific	21565
Elutie buffer	Qiagen	19086
Ethyl alcohol, puur	Sigma-Aldrich	E7023-500mL
Formaldehyde oplossing	Sigma-Aldrich	47608-250mL-F	! WAARSCHUWING Formaldehyde is giftig; gebruik het altijd in een afzuigkap.
Formamide	Invitrogen	AM9342
Gel beeldvormingssysteem	Tanon	3500R
Glycine	Invitrogen	50046-1kg
Glycogen met blauwe kleurstof	Invitrogen	AM9516
Hoge gevoeligheid cartridge	Bioptic	C105105
Hoog-dichtheids fase-lockbuisjes (1,5 mL)	Qiagen	129046
Hoge gevoeligheid dsDNA fluorimetrische assaykit	Invitrogen	Q32851
Indexkit V2 voor Illumina	Vazyme	TD202
Iodoacetyl-PEG2-Biotin (IPB)	Thermo Scientific	21334
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9030	! WAARSCHUWING Isopropyl alcohol is giftig; gebruik het altijd in een afzuigkap.
Kilo base cartridge	Bioptic	C105106
Klenow fragment (3’→5’ exo-)	NEB	M0212L
Magnetische kralen	Beckman	A63881
Magnetische scheidingsstandaard voor 15-mL buisje	Invitrogen	12301D
Magnetische scheidingsstandaard voor 2-mL buisje	Invitrogen	12321D
Magnetische scheidingsstandaard voor PCR buisje	NEB	S1515S
Microbiologische incubator	Thermo Scientific	IMH180
Microscoop	Nikon	Eclipse TS2
Mixer	ELMI	RM-2L
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	! WAARSCHUWING DMF is giftig; gebruik het altijd in een afzuigkap.
Niet gekoelde microcentrifuge	Eppendorf	5405000204
Nuclease-vrij water (niet DEPC-behandeld, 1000 mL)	Invitrogen	AM9932
Nuclease-vrij water (niet DEPC-behandeld, 50 mL)	Invitrogen	AM9937
Nucleïnezuur kwantificator	Invitrogen	Q33226
Orbitale shaker	Crystal	SYC-2102
Fenol:Chloroform:IAA	Solarbio	P1012-100mL
Proteinase K oplossing	Invitrogen	AM2548
Gekoelde centrifuge	Eppendorf	22628180
Gekoelde incubator	Thermo Scientific	IMP180
Gekoelde microcentrifuge	Eppendorf	5404F1621754