Geavanceerde toepassing van capillaire elektroforese in de detectie van hoogresolutie serum monoklonale eiwitten

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor hoogresolutie serumeiwitanalyse met behulp van capillaire elektroforese. Onder een hoogspanningselektrisch veld migreren serumeiwitten via een capillair gebaseerd op lading en elektroforetische mobiliteit. Het resulterende elektroferogram maakt detectie, lokalisatie en kwantificering van monoklonale eiwitpieken mogelijk.

Samenvatting

Monoklonaal immunoglobuline, ook bekend als M-eiwit of paraproteïne, wordt geproduceerd door klonale proliferatie van plasmacellen of B-lymfocyten en dient als een belangrijke biomarker voor monoklonale gammopathieën. Nauwkeurige detectie en kwantificatie van het serum M-eiwit zijn essentieel voor vroege ziektediagnose, klinische classificatie en therapeutische monitoring. Dit protocol beschrijft een methode die gebruikmaakt van capillaire elektroforese (CE) voor hoogresolutie-scheiding van serumeiwitten. Eiwitten worden gescheiden in een alkalische buffer onder hoogspanningselektroforese en gedetecteerd door ultraviolet absorptie, wat elektroferogrammen genereert die een duidelijke visualisatie en kwantificering van abnormale monoklonale eiwitpieken mogelijk maken. In vergelijking met traditionele methoden biedt CE een verbeterde resolutie van het bètagebied en maakt het geautomatiseerde, snelle analyse mogelijk met minimale monsterafhandelingsvereisten. Vijf representatieve elektroferogrammen toonden migratie van M-eiwitten aan in de regio's β1, β2 en γ, met M-eiwitniveaus van 0, 44,1% (45,8 g/L), 10,5% (8,6 g/L), 35,5% (28,4 g/L) en dubbele pieken van 41,3% (46,0 g/L) en 12,4% (13,8 g/L). In een retrospectieve studie van 700 klinische serummonsters behaalde CE een positieve detectiegraad van 51,86%, vergeleken met 52,86% voor immunofixatie-elektroforese (IFE). Met IFE als referentiemethode toonde CE een gevoeligheid van 92,70% en specificiteit van 93,94% aan. Deze bevindingen bevestigden CE als een snelle, geautomatiseerde methode voor het screenen en kwantificeren van serum M-eiwit in routinematige klinische laboratoria.

Inleiding

M-eiwitgerelateerde aandoeningen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een monoklonaal immunoglobuline (M-eiwit) in het serum en/of de urine. Deze eiwitten worden typisch afgescheiden door klonale plasmacellen of B-lymfocyten en zijn voornamelijk geassocieerd met maligne plasmaceldyscrasien of goedaardige monoklonale gammopathieën ^1,2. Het klinische spectrum van deze aandoeningen omvat monoklonale gammopathie van onbepaalde significantie (MGUS), solitair plasmacytoom (SPC), smoldering multiple myeloom (SMM), multipel myeloom (MM), plasmacelleukemie (PCL), Waldenström macroglobulinemie (WM), systemische lichte-keten amyloïdose (AL), B-cel non-Hodgkin lymfoom (B-NHL) en andere B-cel lymfoproliferatieve aandoeningen (LPD)³. Een retrospectieve studie uitgevoerd in Spanje meldde dat MGUS onder deze aandoeningen het meest voorkomt, goed voor 54,1% van de gevallen, gevolgd door MM (31,3%) en andere maligne gammopathieën (14,6^%). Het is ook belangrijk op te merken dat M-eiwit kan worden geproduceerd als reactie op bepaalde niet-neoplastische aandoeningen, zoals nefrotisch syndroom⁵.

M-eiwittesten speelt een cruciale rol bij de diagnose en monitoring van M-eiwitgerelateerde aandoeningen⁶. Vroege diagnose blijft echter een klinische uitdaging, omdat patiënten met MM vaak asymptomatisch zijn in de beginfase, wat leidt tot vertraagde diagnose in een relatief vergevorderde fase van de ziekte. Ongeveer 1% van de mensen met MGUS ontwikkelt jaarlijks een kwaadaardige aandoening – meestal tot MM, WM of SPC⁷. Hoewel bijna alle MM-gevallen worden verondersteld voort te komen uit MGUS, heeft minder dan 10% van de MM-patiënten een gedocumenteerde geschiedenis van eerdere MGUS-diagnose. Daarom kan tijdige identificatie van M-eiwit in serum en/of urine waardevolle aanwijzingen geven voor vroege diagnose van deze aandoeningen, wat cruciaal is voor het verbeteren van de overleving en prognose van patiënten. Onderzoek wijst uit dat patiënten met MGUS die via actieve screening zijn geïdentificeerd, minder complicaties ervaren dan degenen die toevallig zijn gediagnosticeerd⁸. Tijdens therapeutische monitoring is informatie over het isotype en het elektroforetische migratiepatroon van het M-eiwit essentieel om het te onderscheiden tussen het recidief van het oorspronkelijke monoklonale eiwit en het ontstaan van oligoclonale banden of een secundair reactief M-eiwit⁹. Het verschijnen van een nieuw M-eiwit, dat vaak wordt waargenomen na autologe stamceltransplantatie, wordt over het algemeen beschouwd als een gunstige prognostische indicator voor de meeste patiënten¹⁰. In overeenstemming met deze observatie geven vergelijkende overlevingsgegevens aan dat patiënten die een secundair M-eiwit ontwikkelen een mediane algehele overleving van 115,3 maanden vertonen, tegenover 31,0 maanden bij degenen die dat niet^{hebben 11}.

Eiwitelektroforese is een zeer geavanceerde analytische techniek. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor het detecteren van het serum M-eiwit, waaronder serumproteïneelektroforese (SPE), IFE, capillaire elektroforese immunotypering (IT), vrije lichte keten (FLC) assay, zware en lichte keten (HLC) detectie en massaspectrometrie (MS). Elke benadering biedt unieke voordelen en kent tegelijkertijd inherente beperkingen. SPE kan verder worden onderverdeeld in agarosegelelektroforese (AGE) en CE. AGE, dat gebruikmaakt van een agarose-gebaseerd medium, is een eenvoudige, kosteneffectieve methode die geschikt is voor snelle scheiding en analyse. Het wordt echter beperkt door relatief lage gevoeligheid, met een typische detectielimiet van 0,3-0,5 g/L¹², wat kan leiden tot het niet detecteren van kleine of laag-concentratie M-eiwitten. Bovendien is de techniek gevoelig voor bandbuiging en vervorming, wat de reproduceerbaarheid belemmert.

IFE wordt algemeen erkend als de gouden standaard voor M-eiwittypering. Na de initiële elektroforese worden specifieke antilichamen (anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, κ, λ) toegepast om immunoprecipitatiebanden te vormen, waardoor de identificatie van het immunoglobulinetype en het subtype van de lichte keten mogelijk is. IFE kan M-eiwit detecteren bij concentraties zo laag als 0,05-0,15 g/L, wat een gevoeligheid geeft die meer dan 10 keer zo hoog is als die van SPE. Ondanks dit voordeel is gespecialiseerde voorbehandeling vereist voor bepaalde monsters, zoals die met M-eiwitpolymeren, om dissociatie met β-mercaptoethanol te waarborgen. Onvoldoende behandeling kan leiden tot misleidende resultaten. Daarnaast kunnen patiënten die nieuwe combinatietherapieën ondergaan (bijvoorbeeld regimes met daratumumab, bortezomib, dexamethason en thalidomide/lenalidomide) vals-positieve IFE-bevindingen¹³ opleveren. Een belangrijke beperking van IFE is dat het alleen kwalitatieve resultaten levert, omdat het M-eiwitniveaus niet kan kwantificeren en daarom ongeschikt is voor het monitoren van therapeutische werkzaamheid¹⁴. Bij behandelde patiënten kunnen de IFE-resultaten positief blijven, zelfs als de M-eiwitconcentratie tijdens succesvolle behandeling afneemt.

Daarentegen gebruikt IT capillaire buffers als scheidingsmedium, wat een hogere resolutie biedt dan conventionele IFE. Desalniettemin vereist het proces omvangrijke voorbehandelingsstappen voor monsters, zoals het mengen van antiserums, wat de algehele detectieworkflow verlengt. FLC's, die immunoglobuline-lichte ketens (κ en λ) zijn die niet aan zware ketens zijn gebonden, worden direct gekwantificeerd in serum met behulp van antilichamen die hun "hidden zone"-epitopen targeten, wat een hoge gevoeligheid biedt voor het detecteren van lichte keten-gerelateerde aandoeningen met een detectielimiet van slechts 10–30 mg/L. Bij MM correleren verhoogde serum FLC-niveaus met de tumorlast en maken ze een eerdere beoordeling van de therapierespons mogelijk, dankzij hun kortere halfwaardetijd vergeleken met intacte immunoglobulines¹⁵. De klinische toepassing ervan moet echter worden gecombineerd met andere diagnostische methoden, zoals elektroforese, om andere aandoeningen uit te sluiten en een uitgebreide evaluatie te waarborgen. Zo kan een verminderde nierfunctie leiden tot valselijk verhoogde lichtketenniveaus. HLC-assays vormen een andere kwantitatieve benadering die antistoffen gebruikt die zich richten op epitopen op zowel de constante als de lichte keten van immunoglobuline. Dit ontwerp maakt de afzonderlijke kwantificering van isotype-specifieke immunoglobulineparen mogelijk (bijv. IgGκ en IgGλ), en de afgeleide HLC-verhouding dient als een gevoelige indicator van klonaliteit. De resultaten kunnen echter worden beïnvloed door achtergrondpolyklonale immunoglobulineniveaus, en de methode kan minder betrouwbaar zijn bij het analyseren van complexe M-eiwitvarianten. MS biedt uitzonderlijke gevoeligheid en maakt diepgaande proteomische karakterisering van M-eiwitten mogelijk. De toepassing ervan wordt echter beperkt door hoge apparatuurkosten, langdurige analyseprocedures en gespecialiseerde expertise die nodig is voor data-interpretatie.

CE is een krachtige analytische scheidingstechniek die elastische gefuseerde silica-capillairen als scheidingskanalen gebruikt en een hoogspannings direct elektrisch veld als drijvende kracht. Het levert een scheiding met hoge resolutie door gebruik te maken van verschillen in de elektroforetische mobiliteit en/of het partitioneringsgedrag van doelanalyten. Sinds de introductie is de technologie geëvolueerd van enkelcapillaire configuraties naar high-throughput capillaire arrays en miniaturiseerde microfluidische apparaten. De toepassingen bestrijken nu diverse vakgebieden, waaronder farmaceutische analyse, biomedische en klinische diagnostiek, voedselveiligheidstesten en biotherapeutische karakterisering^16,17. CE wordt steeds meer erkend als een cruciaal hulpmiddel voor het screenen en kwantitatieve analyseren van M-eiwitten. Het bepaalt het percentage M-eiwit ten opzichte van het totale eiwit, dat vervolgens kan worden vermenigvuldigd met de totale eiwitconcentratie om absolute M-eiwitniveaus te berekenen. Het meest opvallend is dat de minimale monsterbehoefte het bijzonder geschikt maakt voor het analyseren van kostbare of volumebeperkte exemplaren.

CE biedt drie belangrijke technische voordelen. Ten eerste maakt de hoge analytische gevoeligheid (0,1–0,5 g/L) de effectieve detectie van laaggeconcentratie M-eiwitten mogelijk, waardoor het risico op verkeerde diagnose bij aandoeningen zoals MGUS en lichte-keten ziekten wordt verminderd. Ten tweede elimineert de volledig geautomatiseerde workflow de subjectieve interpretatiefouten die inherent zijn aan traditionele gelgebaseerde kleuringsmethoden. Ten slotte wordt de assaytijd aanzienlijk verkort tot 15–20 minuten, aanzienlijk korter dan de 60–90 minuten die nodig zijn voor conventionele elektroforese. Als een cruciale analytische techniek tussen zone-elektroforese en vloeistofchromatografie voert CE elektroforetische scheiding uit in een vrije oplossing. Onder een toegepast elektrisch veld worden eiwitmoleculen voornamelijk gescheiden door elektro-osmotische stroming binnen een alkalische buffer bij een specifieke pH. Na verdunning met een speciale buffer worden monsters onder hoge spanning bij de capillaire anode geïnjecteerd om een snelle, efficiënte eiwitafscheiding te initiëren, en vervolgens bij de kathode gedetecteerd op 200 nm. Na elke analytische cyclus ondergaan de haarvaten een geautomatiseerde reiniging en bufferaanvulling om de volgende monsters te verwerken. Eiwitseparatie vindt plaats in de volgende volgorde: gamma-globuline, beta-2-globuline, beta-1-globuline, alfa-2-globuline, alfa-1-globuline en albumine, waardoor afwijkingen in een of meer serumproteïnefracties kunnen worden geïdentificeerd. Opmerkelijk is dat CE verbeterde resolutie binnen het bètagebied biedt, waarbij het duidelijk wordt gescheiden in bèta-1 en bèta-2 globulinecomponenten, waardoor meer gedetailleerde klinische informatie wordt opgeleverd¹⁸. Gedreven door de integratie van kunstmatige intelligentie en voortdurende vooruitgang in multi-parameter detectie, staat CE op het punt zich te ontwikkelen tot een eerstelijns screeningsmethode voor M-eiwitdetectie. Daarom beschrijft dit protocol het gebruik van capillaire elektroforese voor de snelle detectie, lokalisatie en kwantitatieve analyse van serum monoklonale eiwitten in klinische monsters.

Protocol

Het studieprotocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Ethische Beoordelingscommissie van het Guangdong Provinciaal Volksziekenhuis (Goedkeuringsnummer: KY2025-176-01). Alle deelnemers gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan het afnemen van het monster.

1. Materiaalvoorbereiding

OPMERKING: De reagensset moet worden bewaard bij 2–30 °C en heeft een houdbaarheid tot 3 jaar.

1. Bewaar de loopbuffer op 2–8 °C en laat deze kamertemperatuur bereiken voordat je hem gebruikt. Eenmaal geopend blijft de oplossing tot wel 3 maanden stabiel. Gebruik deze oplossing als loopbuffer voor de scheiding van serumeiwitten in capillaire elektroforese.
   OPMERKING: De running buffer is inzetklaar met een pH van 9,9 ± 0,5. De reagenskit bevat drie flessen van 700 mL alkalische buffer die worden gebruikt als loopbuffer voor de scheiding van serumeiwitten.
2. Verdun 75 ml geconcentreerde spoelvloeistof tot 750 ml met gedeïoniseerd water vóór gebruik. Bewaar de verdunde spoeloplossing op kamertemperatuur. Eenmaal geopend blijft de oplossing tot wel 3 maanden stabiel. Gebruik deze oplossing om capillairbuizen na elektroforese schoon te maken.
   OPMERKING: De spoeloplossing bevat natriumhydroxide en wordt gebruikt voor capillairreiniging.
   VOORZICHTIG: De spoeloplossing bevat natriumhydroxide, een corrosieve stof die ernstige brandwonden kan veroorzaken. Bij oogcontact spoel je direct af met voldoende water en zoek medische hulp. Als huid of kleding besmet raakt, verwijder dan onmiddellijk de besmette kleding. Draag altijd geschikte beschermende kleding en gebruik oog- en gezichtsbescherming.
3. Bewaar de reagensbekers in de originele verzegelde verpakking bij 2–30 °C op een schone en droge plek. Gebruik de reagensbekers voor monsterverdunning op volledig geautomatiseerde instrumenten.
4. Bewaar het afgesloten filter op een droge plek bij kamertemperatuur (15–30 °C). Gebruik de wegwerpfilters om bufferoplossingen en gedeïoniseerd water te filteren.
5. Bewaar de capillaire reinigingsoplossing (zie Materiaaltabel) op 2–8 °C en voorkom neerslag.
   OPMERKING: Elke fles capillairreinigingsreinigingsconcentraat (25 mL/fles) bevat proteolytische enzymen, oppervlakteactieve stoffen en andere toevoegingen. Additieven zijn bij de toepassingsconcentratie niet gevaarlijk en noodzakelijk voor optimale prestaties. De oplossing voorkomt capillaire blokkades en behoudt optimale prestaties.
6. Gebruik gefilterd gedeïoniseerd water met een poriegrootte ≤ 0,45 μm, een geleidbaarheid onder 3 μS/cm en een weerstand van meer dan 0,33 MΩ·cm. Vervang het water dagelijks om microbiële besmetting te voorkomen. Gebruik dit water om de capillaire buizen van de elektroforese-analyzer schoon te maken.
7. Maak een natriumhypochlorietoplossing met 2–3% beschikbaar chloor. Gebruik deze oplossing voor het reinigen van monsterprobes om geadsorbeerde eiwitten te verwijderen. Bewaar de werkende chlooroplossing bij kamertemperatuur in een gesloten container. De oplossing blijft tot wel 3 maanden stabiel. Bewaar niet dicht bij zonlicht, warmte, ontstekingsbronnen, zuren of ammoniak.

2. Monsterverzameling

1. Zorg ervoor dat patiënten minimaal 8–12 uur vasten voordat het bloed wordt afgenomen.
2. Vraag patiënten om 10–15 minuten zittend of op rug te rusten om de hemodynamica te stabiliseren.
3. Bereid de volgende benodigdheden voor: wegwerp veneuze bloednaalden, vacuüm bloedverzamelbuizen (serumbuisjes), tourniquet, steriele wattenstaafjes, 75% alcohol- of jodofontsmettingsmiddel, medisch lijmverband en een container voor biohazard afval.
   OPMERKING: De mediane cubitale vena in de elleboogfossa is de voorkeursplek.
4. Breng een tourniquet aan 3–5 cm boven de prikplaats om de ader voldoende te laten opswellen.
5. Desinfecteer de huid met 75% alcohol of jodoforen in een centrifugaal spiraalpatroon van het midden naar buiten, waarbij een gebied van ≥5 cm diameter wordt bedekt, en laat het desinfectiemiddel natuurlijk aan de lucht drogen zonder het gebied opnieuw aan te raken.
6. Houd de naald met de afschuining omhoog onder een hoek van 15–30° ten opzichte van de huid en doorboor de huid en de aderwand soepel.
7. Na het zien van bloedterugvloei, bevestig je de naald en sluit je de vacuümbuis aan. Laat het bloed de buis passief vullen onder negatieve druk, zonder handmatige compressie, om hemolyse te voorkomen.
8. Na het verzamelen laat je eerst de tourniquet los, trek je de naald voorzichtig eruit en oefen je direct druk uit op de prikplaats met een steriel wattenstaafje gedurende 3–5 minuten om hemostase te garanderen.
9. Plaats het verzamelde monster rechtop op kamertemperatuur en laat het bloed natuurlijk stollen.

3. Steekproefkwaliteitsbeoordeling

1. Centrifuge-serummonsters van 2.095 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
2. Serummonsters van de proefpersoon worden strikt beoordeeld bij voldoende natuurlijk licht tegen een eenvoudige witte achtergrond.
3. Evalueer hemolyse door de kleur en helderheid van het supernatant te onderzoeken. Beoordeel monsters als niet-gehemolyseerd als het supernatant helder en geel lijkt, terwijl elke roze of rode verkleuring wijst op lichte tot ernstige hemolyse.
   OPMERKING: Hemolyse kan een dubbele alfa-2 zone produceren. De bèta-2-fractie kan afnemen in verouderde of onjuist opgeslagen serummonsters.
4. Controleer op fibrinogeninterferentie door zichtbare fibrinestrengen, stolsels of gelatineuze netwerken binnen de supernatant te controleren, evenals onvolledige fase-scheiding, troebelheid of inconsistente analytische signalen.
   OPMERKING: Fibrinogeen migreert in de bèta-2 positie (schouder op bèta-2 of overliggend met de bèta-2 zone, mogelijk met een toename van deze fractie). In sommige monsters (plasma, serum dat niet volledig gedefibrineerd is, of patiënten die anticoagulantia krijgen) kan fibrinogeen de analyse verstoren en leiden tot onnauwkeurige interpretatie, zoals de verdenking van een monoklonale band of een toename van de bèta-2-fractie.
5. Sluit monsters uit die hemolyse, fibrinogeninterferentie of andere pre-analytische afwijkingen tonen zodra deze uit de analyse zijn vastgesteld.
6. Neem een nieuw bloedmonster volgens gestandaardiseerde phlebotomie- en verwerkingsprotocollen, waarbij de juiste stollingstijd en gestandaardiseerde centrifugatieparameters worden gegarandeerd. Gebruik alleen monsters met een bevredigend uiterlijk—helder, vrij van hemolyse, fibrine, lipemie of besmetting voor latere tests.
7. Test de gescheiden serummonsters zo snel mogelijk op kamertemperatuur. Als onmiddellijke tests niet mogelijk zijn, bewaar de monsters dan tot 10 dagen bij 2–8 °C en tot 30 dagen bij -20 °C. Vries en ontdooi monsters niet herhaaldelijk.
   OPMERKING: Vermijd plasmamonsters. Bij het analyseren van verouderde plasmamonsters (wat niet wordt aanbevolen) degraderen labiele componenten zoals het C3-complement in de loop van de tijd, waardoor de beta-2-zone in wezen overeenkomt met fibrinogeen.
8. Voor het testen herstelt u de monsters op kamertemperatuur en mengt u ze grondig. Zorg ervoor dat de bevroren monsters volledig ontdooid zijn voordat je ze gebruikt.
   OPMERKING: Gebruik onverdunde serumproteïnemonsters. Sommige gekoelde sera kunnen viskeuze of troebel worden, vooral die met cryoglobulinen of cryogel. Gebruik monsters met polyimmunoglobulines direct zonder extra voorbehandeling.

4. Operationele procedures

1. Stroom op de automatische capillaire elektroforese-analyzer (zie Materiaaltabel) en het aangesloten computersysteem. Wacht tot het instrument volledig geïnitialiseerd is.
   OPMERKING: De capillaire lengte en binnendiameter zijn respectievelijk 17,5 cm en 25 μm. De scheidingsspanning varieert van 8.000–10.000 V. Elektrokinetische injectie wordt gebruikt en de scheidingstemperatuur wordt gehandhaafd op ongeveer 25 °C. De totale looptijd is ongeveer 10 minuten per monster.
2. Start de PHORESIS-software (zie Table of Materials) die op de computer is geïnstalleerd voor gegevensverwerking.
3. Selecteer vanaf de softwareinterface het programma PROTEIN (E) 6 en plaats vervolgens de lopende bufferfles in het instrument.
   OPMERKING: Dit programma is een fabrieksgekalibreerd vooraf ingesteld protocol dat speciaal is ontworpen voor serumproteïne-fractionering. Alle parameters zijn vooraf geconfigureerd in de PHORESE-software van het instrument, zonder dat handmatige aanpassing nodig is.
4. Plaats indien nodig de fles reagens met oplosbare reinigingsoplossing in het instrument.
5. Bevestig een nieuwe reagensbeker op het automatische laadplatform van de capillaire elektroforese-analyzer.
6. Installeer een nieuwe afvalbak op de standaard afvalverwerkingspositie van de capillaire elektroforese-analyzer voor gebruikte reagensbekers.
7. Laad de monsterrekken in de analyzer via de opening aan de rechterkant (maximale capaciteit: 15 racks).
   OPMERKING: Elk rack kan tot 8 monsterbuizen bevatten. De barcode op elk reageerbuisje moet zichtbaar zijn door de opening van het rek.
8. Gebruik sample rack nr. 0 voor het controleserum. Gebruik kwaliteitscontrole van derden op basis van het cumulatieve gemiddelde en de variatiecoëfficiënt berekend uit 20 testdatapunten.
9. Haal het voltooide monsterrek uit de laadbak aan de linkerkant. Verwijder en gooi indien nodig de afvalbak met de gebruikte reagensbekers weg.
   VOORZICHTIG: Ga voorzichtig met gebruikte reagensbekers om, omdat ze biologische monsters kunnen bevatten.
10. Plaats capillaire reinigingsoplossing op positie S2 in de secundaire reagenskamer. Klik op Onderhoud en Reiniging op het instrumentenscherm en selecteer vervolgens Start Capiclean.
11. Plaats 2-3% natriumhypochlorietoplossing in de secundaire reagenskamer (T1-positie). Klik op Onderhoud en Reiniging op het instrumentenscherm en kies Start Decontaminatie.
    OPMERKING: Het hele capillairreinigingsproces loopt automatisch 45 minuten.
12. Start de schoonmaakprocedure minstens één keer per week.

5. Resultaatanalyse

1. Na het voltooien van elke analyserun verzend je ruwe gegevens van het instrument naar de software voor verwerking. De software genereert een elektroferogram dat op het computerscherm wordt weergegeven.
2. Analyseer het elektroferogram en kwantificeer de relatieve absorptie-intensiteiten van elke eiwitband bij een golflengte van 200 nm met behulp van de software.
   OPMERKING: Op basis van de totale eiwitconcentraties gemeten door de volledig geautomatiseerde biochemische analyzer, berekent de software de concentratie van elke eiwitband.
3. Gebruik de gegenereerde elektroferogrammen voor visuele beoordeling en identificatie van abnormale banden.
   OPMERKING: Standaard toont het systeem elektroferogrammen in hertekenmodus.
4. Gebruik een standaardmodus om indien nodig de eerste elektroferogrammen te presenteren die zijn afgeleid van ruwe gegevens.
   OPMERKING: De referentiewaarden van de capillaire elektroforetische analyzer zijn vastgesteld door statistische analyse van 246 gezonde volwassen deelnemers (zowel mannen als vrouwen) met normale triglyceridewaarden (Tabel 1). Het wordt aanbevolen dat elk laboratorium zijn eigen normen vaststelt.

6. Instrumentuitschakeling

1. Aan het einde van elke analysesequentie start je de afschakelprocedure van de capillaire elektroforese-analyzer om de capillaire onder ideale omstandigheden op te slaan.
   1. Om de afsluitprocedure te starten, selecteer je "Afsluiten" in het hoofdmenu of gebruik je het afsluitrack dat bij de analyzer wordt geleverd.
   2. Druk op "Afsluiten" in het hoofdmenu. Druk in het venster op het scherm om de procedure te starten. Het sluitingsproces start automatisch na voltooiing van het lopende analyseprogramma.
   3. Het afsluiterrack is gelabeld als "EXTINCTION/SHUTDOWN CAPILLARYS 3 & MC". Plaats dit rack aan het einde van de sample rack-wachtrij, en het instrument start automatisch de afsluitprocedure.
      OPMERKING: Wanneer de afsluitprocedure is voltooid, wordt het instrument uitgeschakeld en schakelt het scherm uit.
2. Gebruik de fysieke aan/uit-schakelaar aan de achterkant van het instrument om de analyzer van het netnet los te koppelen.
3. Haal alle reagensflessen uit de twee reagenskamers en bewaar ze onder aanbevolen opslagomstandigheden. Veelvoorkomende fouten, mogelijke oorzaken en oplossingen van de volledig geautomatiseerde elektroforese-analyzer zijn opgenomen in Aanvullende Tabel 1.

7. Prestatieparameters

1. Om de analytische gevoeligheid van de capillaire elektroforeseprocedure te bepalen, bereid en analyseer je seriële verdunningen van een serummonster met een abnormaal eiwit in de gammazone van 1,198 g/dL. De hoogste verdunning met een waarneembare afwijking komt overeen met een concentratie van 19 mg/dL van het abnormale eiwit.
   OPMERKING: Afhankelijk van de positie van het abnormale eiwit en de polyklonale achtergrond in de gammazone kan de detectielimiet variëren.
2. Nauwkeurigheidsbeoordeling – Interne correlatie
   1. Om de integriteit van het monster te waarborgen, verwerk je alle serummonsters (inclusief 18 normale en 100 pathologische monsters) identiek en behandel je ze volgens dezelfde richtlijnen.
   2. Meet de niveaus van elke eiwitfractie door elektroforetische scheidingen verkregen met de capillaire elektroforetische procedure op de analyzer als een andere commercieel beschikbare capillaire elektroforesetechniek voor eiwitanalyse.
   3. Analyseer de gemeten waarden van beide procedures met een lineaire regressiestatistische procedure. De verkregen resultaten toonden een perfecte correlatie tussen beide procedures aan.

Resultaten

De migratieposities, piekkenmerken en relatieve percentages van elke eiwitband werden kwantitatief geanalyseerd door de absorptie van serumeiwit te detecteren. Klinische interpretatie werd vervolgens uitgevoerd op basis van de aanwezigheid en het patroon van abnormale banden die in het elektroferogram werden waargenomen. Een representatief capillair elektroferogram dat het normale migratiepatroon van serumeiwitfracties toont, is te zien in Figuur 1. Variatie...

Discussie

SPE is een fundamentele diagnostische techniek in klinische laboratoria, waarbij serumeiwitten worden gescheiden op basis van verschillen in hun iso-elektrische punten, molecuulgewichten en conformaties¹⁹. Deze studie schetst systematisch een protocol voor de snelle detectie en kwantificering van serum M-eiwit met behulp van CE. Het protocol benadrukt de uitstekende analytische prestaties van de methode, met als belangrijkste voordelen hoge gevoeligheid, hoge door...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CAPI 3 PROTEIN (E) 6 buffer	SEBIA	2503	Loopbuffer gebruikt voor serum-eiwitscheiding in capillaire elektroforese (genoemd als de loopbuffer in het manuscript).
De lavage wash solution	SEBIA	2062	Verdunde spoelvloeistof gebruikt voor het schoonmaken van capillaire buizen na elektroforese.
Reagent cups	SEBIA	2582	Voor monsterverdunning op volledig automatische instrumenten.
FILTER CAPILLARYS	SEBIA		Wegwerpfilter gebruikt voor het filteren van bufferoplossingen en gedeïoniseerd water tijdens capillaire reiniging.
CAPICLEAN	SEBIA	2060	Voor het reinigen van capillaire buizen van CAPILLARYS 3 OCTA instrumenten (genoemd als de capillaire reinigingsoplossing in het manuscript)
Sodium hypochlorietoplossing	Guangzhou Chemical Reagents Factory	1703079	Voor het reinigen van monstersondes.
Gedeïoniseerd water	Watsons	/	Gebruikt voor capillair spoelen in de geautomatiseerde capillaire elektroforese-analyzer.
Randox kwaliteitscontrole	Randox	HN1530	Voor kwaliteitscontrole.
Volledig geautomatiseerde capillaire elektroforese-analyzer	SEBIA	CAPILLARYS 3 OCTA	Instrument gebruikt voor hoogwaardige en hoogdoorvoer serum-eiwitanalyse.
PHORESIS 9.30 software	SEBIA	/	Software gebruikt voor geautomatiseerde acquisitie en analyse van elektroforesepatronen.