Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

DNA-virale fractie metagenomica voor menselijke ontlastingsmonsters

397 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70187

⸱

24 maart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of California, Davis

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een flexibel protocol voor het genereren van hoogwaardige virale fractiemetagenomen (viromen) uit menselijke ontlastingsmonsters. Oorspronkelijk ontwikkeld voor bodemviromica, werd dit protocol hier met succes toegepast op ontlastingsmonsters, waardoor een robuuste karakterisering van de menselijke darmvirosfeer mogelijk is.

Samenvatting

Het begrijpen van de gezonde menselijke virosfeer (de virale component van het microbioom) vereist nauwkeurige metingen van de samenstelling van de virale gemeenschap over een breed scala aan virale types. Voortbouwend op eerdere ervaring met methoden voor de ecologie van bodemvirale gemeenschappen, demonstreren we hier een reeks laboratoriumbenaderingen voor het verrijken en extraheren van DNA uit extracellulaire DNA-virussen in menselijke ontlastingsmonsters. Er wordt een werkend primair protocol gepresenteerd, samen met opties voor afwijkingen bij verschillende stappen. De algemene aanpak omvat het toevoegen van een vloeistofbuffer (standaard: eiwitversterkte fosfaatgereserveerde zoutoplossing, PPBS) om het verwijderen van vrije virale deeltjes uit de ontlastingsmatrix te vergemakkelijken, centrifugatie om de vloeistoffractie met virale deeltjes te scheiden, filtratie (standaard: 0,2 μm poriegrootte) om de meeste cellen te verwijderen, concentratie van virale deeltjes (standaard: ultracentrifugatie), verwijdering van vrije nucleïnezuren met nucleasen voorafgaand aan virionlysis, en daarna DNA-extractie voor sequencing. Alternatieve technieken, waaronder verschillende buffers, filtergroottes en concentratiemethoden, worden ook genoemd. Over het algemeen worden er meerdere opties aangeboden om hoogkwalitatief viromisch DNA te genereren voor sequencing. In plaats van de aanpak af te stemmen op specifieke apparatuur en middelen, zou de flexibiliteit van het protocol het breed toepasbaar moeten maken in laboratoria met verschillende standaard moleculaire biologische apparatuur.

Inleiding

Viromics, oftewel de niet-gerichte metagenomische sequencing van het virale aandeel van gemengde gemeenschappen, kan inzicht geven in de diversiteit, evolutie en ecologie van niet-gekweekte virussen. Sinds de vroege pogingen om darmvirale gemeenschappen meer dan 20 jaar geleden te catalogiseren, waarbij met name methoden werden gebruikt die zijn ontwikkeld voor omgevingsmonsters zoals zeewater1, zijn viromische benaderingen doorgegaan om ontdekkingen in virale ecologie binnen het menselijke microbioom mogelijk te maken2. Er is echter geen enkel universeel viromics-protocol, en variaties in technieken kunnen de sequencingresultatenbeïnvloeden 3,4, wat uiteindelijk de interpretatie van virale gemeenschapsdynamiek beïnvloedt en vergelijkingen tussen studies belemmert. Geoptimaliseerde protocollen, gecombineerd met een grondig begrip van hoe methodologische keuzes viromprofielen vormgeven, zijn nodig om de menselijke virosfeer robuust te karakteriseren.

Hoewel er geen universeel viromics-protocol is, bestaat de algemene basis van viromics-methoden uit het fysiek scheiden en concentreren van extracellulaire virusachtige deeltjes (virionen) op basis van hun grootte en/of dichtheid, het verwijderen van vrije nucleïnezuren (deels afkomstig van cellulair afval of aangetaste virale capsiden) vóór virionlysis, en het extraheren van DNA en/of RNA voor sequencing. Sommige viromics-technieken selecteren voor of tegen specifieke virale types, hetzij als een bewuste keuze van onderzoekers of als onbedoelde methodologische beperking. Spuit- of vacuümfiltratie wordt vaak gebruikt om microbiële cellen en ander afval te verwijderen, en de filtergrootte beïnvloedt inherent de kwaliteit en samenstelling van het teruggewonnen viroom. Filtratie kan bijvoorbeeld de viromzuiverheidverhogen 5, maar het kan grotere virale deeltjes 6,7 uitsluiten. Virionconcentratiemethoden, zoals ultracentrifugatie, polyethyleenglycol (PEG) neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en ultrafiltratie, hebben ook afwegingen tussen zuiverheid, doorvoer en apparatuurkosten 3,8. Meervoudige bufferchemieën zijn bekend effectief voor viromics. Ze hebben misschien geen buitensporige impact op viromkarakterisering9, maar opslag- en resuspensionbuffers kunnen nog steeds virusherstel en de viromprofielen die uit bio-informatische analyse worden gegenereerdbeïnvloeden 10,11. Tot slot, omdat de concentraties van virale nucleïnezuren laag kunnen zijn in natuurlijke monsters, kiezen veel studies ervoor om viraal DNA te amplificeren vóór de bibliotheekconstructie (bijvoorbeeld door multiple displacement amplification (MDA) of sequentie-onafhankelijke single-primer amplificatie (SISPA)). Toch introduceren sommige van deze technieken aanzienlijke vooringenomenheid12,13. Over het algemeen, hoewel veel viromics-methoden succesvol viromen kunnen genereren, zullen geoptimaliseerde protocollen die biases erkennen en enigszins gestandaardiseerd zijn, nauwkeurig en reproduceerbaar viromonderzoek mogelijk maken.

Dit artikel presenteert een flexibele workflow voor het genereren van viromen uit menselijke ontlastingsmonsters. Aangepast van bewezen bodemviromica-technieken 14,15,16, bevat dit protocol verschillende stappen die modificatie faciliteren, zodat onderzoekers het kunnen aanpassen aan hun eigen apparatuur en onderzoeksbehoeften. De standaard grondviromica-methode die hieronder wordt beschreven, succesvol toegepast op zowel bodem- als bevroren ontlastingsmonsters, levert hoogwaardige viromen op zonder een virale DNA-amplificatiestap vóór de bibliotheekconstructie. De suggesties voor protocolwijzigingen zijn in verschillende mate getest in andere studies, maar hun specifieke, downstream effecten op menselijke ontlastingsviromsequenties zijn hier niet onderzocht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle proefpersonen die werden gerekruteerd voor ontlastingsmonsters gaven geïnformeerde toestemming. Protocollen voor het verzamelen van monsters zijn goedgekeurd door de University of California, Davis Institutional Review Board, en de studies voldoen aan de Verklaring van Helsinki. Dit protocol is aangepast van Emerson et al. (2022)17.

1. Voorbereiding van materialen

  1. Bereid eiwitverrijkte, fosfaatgepufferde zoutoplossing voor (PPBS, 10x PBS, 1% K-citraat, 150 mM MgSO4, 2% rundserumalbumine (BSA))18.
    OPMERKING: Andere veelgebruikte buffers in viromica-protocollen zijn zoutoplossing magnesium (SM)19 en aangepaste kaliumcitraat prime (AKC') buffer11.
    1. Voeg 10 ml 10x PBS, 10 g K-citraat, 18,05 g watervrij MgSO4 toe aan een 1 L autoclavabele glazen fles en vul tot 1 L met ultrazuiver laboratoriumwater. Stel de pH aan naar 6,5 (vereist meestal ongeveer 50 μL van 6 M HCl of ongeveer 100 μL van 2 M HCl). Laat een roerreep in de fles voor gebruik in stap 1.1.2.
    2. Autoclaveer de fles met buffer en één lege 1 L autoclavabele glazen fles. Na het autoclaveren, zodra de buffer is afgekoeld tot kamertemperatuur, plaats je deze op een magnetische roerplaat en voeg je langzaam 20 g BSA direct in de fles toe, waarbij je telkens ongeveer 5 g BSA toevoegt (om schuimvorming te voorkomen, minimaliseer je het onrustige roeren, bijvoorbeeld begin je met een langzame roersnelheid en verhoog geleidelijk).
    3. Filter het gehele buffervolume via een steriel 0,22 μm vacuümfilter in de lege autoclaveerde 1 L fles vanaf stap 1.1.2. Bewaar de buffer op 4 °C tot gebruik.
      OPMERKING: PPBS-buffer kan ongeveer 3 maanden bij 4 °C worden bewaard, maar is niet stabiel op de lange termijn wanneer hij boven het vriespunt wordt bewaard.
  2. Maak de ultracentrifugebuizen klaar.
    OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van ultracentrifugatie om virionen te concentreren. Andere veelvoorkomende benaderingen zijn polyethyleenglycol (PEG) neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (bijv. cesiumchloridegradiënten) en ultrafiltratie.
    1. Om de ultracentrifugebuizen schoon te maken, schrop je eerst de buizen met ultrazuiver laboratoriumwater. Spoel daarna de buisjes af met ultrazuiver laboratoriumwater.
    2. Vul de buisjes met 1 M NaOH en laat ze minstens 1 uur weken (kan een nacht laten weken). Maak de plastic/rubber ultracentrifugedoppen en hun o-ringen schoon door ze onder te dompelen in 1 M NaOH.
      OPMERKING: dompel de metalen schroefdoppen niet onder in NaOH.
    3. Na het weken spoel je drie keer af met ultrazuiver laboratoriumwater, gevolgd door één spoeling met nucleasevrij, moleculair biologisch water. Droog de buisjes door om te keren en zachtjes te tikken, of laat ze 's nachts helemaal drogen. Label elke ultracentrifugebuis met een monsteridentificatie.
  3. Koel de ultracentrifugerotor vooraf op 4 °C door de rotor een nacht in de koelkast of koelkamer te laten staan.

2. Virionzuivering en concentratie

  1. Weeg de ontlasting in een steriele, DNase-, RNase- en DNA-vrije 50 mL conische buis.
    OPMERKING: De hoeveelheid gebruikte ontlasting kan afhangen van de hoeveelheid beschikbare monstermateriaal. Hier werd 2 g ontlasting gebruikt. Als ongebruikt monstermateriaal bevroren moet worden bewaard, overweeg dan om het hele monster te aliquoteren voordat het wordt bevroren om toekomstige vries-dooicycli te minimaliseren.
  2. Voeg 8 mL PPBS-buffer direct toe aan de conische buizen waarin de ontlasting zit (conisch #1). Volledig opnieuw ophangen door te vortexen.
  3. Schud de buizen op 300 toeren per minuut bij 4 °C gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: Indien nodig kan het schudden op kamertemperatuur, maar 4 °C wordt aanbevolen.
  4. Centrifugemonsters in kegelvormige #1 bij 4.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: Gebruik indien mogelijk een schwenkbare emmerrotor om verticale dichtheidsafstand te vergemakkelijken en de volgende stappen makkelijker te maken.
  5. Geef het supernatant voorzichtig over in een nieuw steriel 50 mL conisch (conisch #2) en bewaar het bij 4 °C (het supernatant bevat de virionen). Gooi de kegelvormige buis die de pellet bevat (conisch #1) niet weg, want deze wordt opnieuw gebruikt in stap 2.6.
  6. Herhaal stappen 2.2-2.5 nog twee keer (zodat het monster in conisch #1 in totaal 3x resuspension met buffer, 3x schudden en 3x centrifugatie heeft ondergaan) en ga door met het poolen van het supernatant in conisch #2.
    OPMERKING: Drie patronen zouden in totaal ~24 mL supernatant moeten opleveren.
  7. Centrifugeer de 50 mL conische buis met opgehoopt supernatant (conisch #2) gedurende 8 minuten bij 10.000 x g bij 4 °C.
  8. Voer een tweede centrifugatieronde uit. Eerst giet je het supernatant van conisch #2 over in een nieuwe 50 mL kegelvormige buis (conisch #3). Centrifugeer conisch #3 gedurende 8 minuten op 10.000 x g bij 4 °C.
  9. Met spuitfiltratie filter je het supernatant sequentieel vanuit kegelvormige #3, waarbij je de pellet op of bij de onderkant van de buis vermijdt. Voorfilter met een steriel 5,0 μm polyethersulfon (PES) spuitfilter, gevolgd door een steriel 0,20 μm PES spuitfilter, direct in een ultracentrifugebuis.
    OPMERKING: Het doel van voorfilteren met 5,0 μm-filters is om verstopping van de 0,20 μm-filters te verminderen. Het kan nog steeds nodig zijn om de spuitfilters weg te gooien en te vervangen als ze verstopt raken. Filtratie kan in één stap worden uitgevoerd door het 5 μm-filter bovenop het 0,20 μm-filter te stapelen, aan één spuit te koppelen, en direct in een ultracentrifugebuis te plaatsen. PES-membranen hebben de voorkeur, omdat andere membraanmaterialen virionen (bijv. glasvezel) kunnen vasthouden of sneller kunnen verstoppen (bijv. polyvinylidienfluoride, PVDF). 0,45 μm is een andere veelvoorkomende filtergrootte.
  10. Controleer de massa van alle ultracentrifugebuizen met hun monsterinhoud, en koppel buizen in de ultracentrifuge op basis van massa. Voeg indien nodig PPBS toe aan de lichtere buis van elk paar om het gewicht gelijk te maken (binnen een foutmarge van 0,05 g voor gekoppelde buizen).
  11. Ultracentrifuge op 112.000 x g bij 4 °C onder vacuüm gedurende 2 uur en 25 minuten.
    OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte rotor zal de spinduur verschillen (afhankelijk van de sedimentcoëfficiënt (s) = 58). Zie de Materiaaltabel voor de gebruikte rotor hier. Voordat je de buizen uit de ultracentrifuge verwijdert, let op de oriëntatie van elke buis in de rotor om het virale pelletje te lokaliseren. Soms is de virale pellet na ultracentrifugatie niet zichtbaar, en moet extra voorzichtig worden betracht bij het verwijderen van het supernatant in de volgende stap.

3. Resuspension van virale pellets en behandeling van DNase-onderdelen

  1. Verwijder het supernatant door te decanten of met een pipet, waarbij je erop let dat je de pellet niet verstoort, die fragiel kan zijn (de pellet bevat de geconcentreerde virionen).
    OPMERKING: Zoals vermeld in Stap 2.11 kan de pellet wel of niet zichtbaar zijn, maar een 'hole punch-sized' bruine of gele pellet is vaak te zien.
  2. Behandel de monsters met DNase.
    OPMERKING: Als u ervoor kiest om monsters niet te behandelen, ga dan door naar Stap 4 en volg "Als DNase-behandeling niet is uitgevoerd". Raadpleeg de Discussie voor overwegingen over het uitvoeren van DNase-behandeling.
    1. Suspendeer de pellet opnieuw in 100 μL nucleasevrij, moleculair biologisch water in een gelabelde 1,5 mL microcentrifugebuis.
    2. Maak de DNase-behandelingsmaster mix door 10 μL DNase-reactiebuffer en 10 μL DNase toe te voegen voor elk monster dat behandeld wordt. Pipette om goed te mengen.
      OPMERKING: Bereid voldoende DNase-behandelings-mastermix voor voor extra reacties om mogelijk volumeverlies tijdens pipetteren in stap 3.2.3 te compenseren.
    3. Voeg 20 μL van het DNase-behandelings-mastermengsel toe aan de geresuspendeerde virionen. Meng goed door zachtjes te pipetteren. Bred 30 minuten uit bij 37 °C.
    4. Voeg 10 μL DNase-stopoplossing toe om de nucleasen te inactiveren. Kort vortex.

4. Extractie van virale nucleïnezuren

  1. Voer de DNA-extractie uit met de DNA-extractiekit die in de Materiaaltabel staat.
    OPMERKING: Maak twee aanpassingen aan de instructies van de fabrikant. 1) Na stap 1 in de kitprocedure verhit je de kraalbuis met de virionen in buffer CD1 op 65 °C gedurende 10 minuten, waarna je de extractie uitvoert volgens de instructies van de fabrikant. 2) Tijdens de DNA-elutiestap (stap 16 in de kitprocedure) incubeer je de kolommen 5 minuten op kamertemperatuur na toevoeging van C6.
    1. Als er een DNase-behandeling is uitgevoerd: Nadat de nucleasen zijn geïnactiveerd (in stap 3.2.4), gebruik dan het volledige volume als input voor de DNA-extractie (d.w.z. in stap 1 van de DNA-extractiekitprocedure voeg je dit volume toe aan de kraalbuis met 800 μL CD1). Zorg ervoor dat je geen oplossing achterlaat (deze oplossing bevat de virionen).
    2. Als er geen DNase-behandeling is uitgevoerd: Voeg 100 μL nucleasevrij, moleculair water toe aan de ultracentrifugebuis met de pellet uit stap 3.1. Schraap het pelletje voorzichtig en stil het opnieuw. Gebruik de hersuspendeerde pellet als input voor DNA-extractie.

5. DNA-kwantificatie

  1. Kwantificeer het geëxtraheerde DNA met de fluorescentie-gebaseerde methode van keuze.
    OPMERKING: De opbrengsten van virome DNA zijn zelden hoog genoeg voor absorptie-gebaseerde kwantificatie; Dit kan echter nog steeds nuttig zijn bij het identificeren van chemische verontreinigingen.
  2. Voor kortetermijnopslag bewaar je DNA bij -20 °C na kwantificering. Voor langere tijdopslag bewaar je bij -80 °C. Het DNA is nu klaar voor bibliotheekvoorbereiding en sequentie. Raadpleeg de Materiaaltabel voor de bibliotheekvoorbereidingskit en het sequencingplatform dat hier wordt gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een verkennende inspanning waarbij dit protocol werd toegepast op één bevroren ontlastingsmonster (bewerkt in technische drievoud voor viromen) samen met twee bodemmonsters toonde de effectiviteit aan bij het produceren van hoogwaardige viromen uit verschillende monstertypes. Met behulp van kwaliteitsgefilterde sequencinggegevens en de novo geassembleerde contigs die door dit protocol zijn gegenereerd, werden vermeende virale sequenties geïdentificeerd met een open-sour...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een relatief eenvoudige en aanpasbare methode om viromen te genereren. Bewezen in bodems 14,15,16,21, wordt het hier met succes toegepast op menselijke ontlastingsmonsters. Dit protocol zal het beste extracelluliaire, intacte DNA-virussen terugwinnen en is niet ontworpen om opzettelijk intracellulaire virussen of profage te recupderen (hoewel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Wij danken Drs. Sean Adams, Trina Knotts en Mohamed R. Ali (University of California, Davis School of Medicine) voor het verzamelen en verstrekken van het ontlastingsmonster in overeenstemming met IRB-protocollen en ethische normen. Wij danken Dr. Matthew R. Olm (University of Colorado, Boulder) voor de samenwerking bij de analyse van het ontlastingsmonster. Dit onderzoek werd ondersteund door het NIH Common Fund (Human Virome Program), Award # U01DE034198. LSH werd ook gedeeltelijk ondersteund door het Amerikaanse Department of Energy (DOE), Office of Science, Office of Biological and Environmental Research (BER), Genomic Science Program, toekenningsnummer DE-SC0023127 (subsidie aan JBE, subsidie-PI Sydney Glassman).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- en Protease-vrije PoederFisher BioReagentsBP9706100Voor PPBS recept (Stap 1.1)
DNeasy PowerSoil Pro KitQIAGEN47016DNA extractie kit (Stap 4.1)
KAPA DNA HyperPrep bibliotheek kitRochen/aBibliotheken gegenereerd door deze kit werden gesequenced met behulp van het Illumina NovaSeq 6000 platform (2 x 150 bp).
Magnesiumsulfaat (MgSO4), watervrij, ≥99,5%Sigma-AldrichM7506Voor PPBS recept (Stap 1.1)
Fosfaat-gebufferd Saline (PBS), 10x, pH 7.4, RNase-vrijInvitrogenAM9624Voor PPBS recept (Stap 1.1)
Polyethersulfone (PES) membraan spuitfilters, steriele, 28 mm, 0,2 μmCorning431229Voor spuitfiltratie (Stap 2.9)
Polypropyleen conische centrifugebuizen, steriele, 50 mLOlympus Plastics28-108
Kaliumcitraat Monohydraat (Kristallijn/Gecertificeerd)Fisher ChemicalP222Voor PPBS recept (Stap 1.1)
Qubit  AssaybuisjesInvitrogenQ32856Voor DNA kwantificering (Stap 5.1)
Qubit 4 FluorometerInvitrogenQ33238Voor DNA kwantificering (Stap 5.1)
Qubit dsDNA Kwantificering Assay KitsInvitrogenQ32850Voor DNA kwantificering (Stap 5.1)
RQ1 RNase-Vrije DNasePromegaPR-M6101Bevat de reactiebuffer, DNase, en stopoplossing
Supor hydrofiel polyethersulfone (PES) membraan spuitfilters, steriele, 32 mm, 5,00 µm Cytiva (Voorheen Pall Lab)28150-956Voor spuitfiltratie (Stap 2.9)
Ultracentrifuge rotor: Type 50.2 Ti Vast-Hoek Rotor, 50.000 rpm, 302.000 x g, 12 x 39 mBeckman Coulter337901We gebruiken ook de Beckman Coulter Type 70 Ti Vast-Hoek Titanium Rotor (Cat. 337922). Centrifugeer gedurende 3 uur als je de 70 Ti gebruikt.
Ultracentrifuge buizen: 26,3 mL Polycarbonaat Fles met Dop Montage, 25 x 89mmBeckman Coulter355618Compatibel met Type 50.2 Ti (Cat. 337901) en Type 70 Ti (Cat. 337922) Beckman Coulter rotors
Ultracentrifuge: Beckman Instruments Optima LE-80K Vloer UltracentrifugeBeckman Coulter365668We gebruiken ook de Beckman Coulter L8-70M Gekoelde Ultracentrifuge (Cat. 344196)

Referenties

  1. Breitbart, M., et al. Metagenomic Analyses of an Uncultured Viral Community from Human Feces. J Bacteriol. 185 (20), 6220-6223 (2003).
  2. Liang, G., Bushman, F. D. The human virome: assembly, composition and host interactions. Nat Rev Microbiol. 19 (8), 514-527 (2021).
  3. Callanan, J., Stockdale, S. R., Shkoporov, A., Draper, L. A., Ross, R. P., Hill, C. Biases in Viral Metagenomics-Based Detection, Cataloguing and Quantification of Bacteriophage Genomes in Human Faeces, a Review. Microorganisms. 9 (3), 524(2021).
  4. Garmaeva, S., Sinha, T., Kurilshikov, A., Fu, J., Wijmenga, C., Zhernakova, A. Studying the gut virome in the metagenomic era: challenges and perspectives. BMC Biol. 17 (1), 84(2019).
  5. Lewandowska, D. W., et al. Optimization and validation of sample preparation for metagenomic sequencing of viruses in clinical samples. Microbiome. 5 (1), 94(2017).
  6. Conceição-Neto, N., et al. Modular approach to customise sample preparation procedures for viral metagenomics: a reproducible protocol for virome analysis. Sci Rep. 5 (1), 16532(2015).
  7. Palermo, C. N., Shea, D. W., Short, S. M. Analysis of Different Size Fractions Provides a More Complete Perspective of Viral Diversity in a Freshwater Embayment. Appl Environ Microbiol. 87 (11), e00197-e00221 (2021).
  8. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16 (1), 7(2015).
  9. Fudyma, J. D., et al. Exploring viral particle, soil, and extraction buffer physicochemical characteristics and their impacts on extractable viral communities. Soil Biol Biochem. 194, 109419(2024).
  10. Zhai, X., et al. The impact of storage buffer and storage conditions on fecal samples for bacteriophage infectivity and metavirome analyses. Microbiome. 11 (1), 193(2023).
  11. Trubl, G., Solonenko, N., Chittick, L., Solonenko, S. A., Rich, V. I., Sullivan, M. B. Optimization of viral resuspension methods for carbon-rich soils along a permafrost thaw gradient. PeerJ. 4, e1999(2016).
  12. Roux, S., et al. Towards quantitative viromics for both double-stranded and single-stranded DNA viruses. PeerJ. 4, e2777(2016).
  13. Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification methods bias metagenomic libraries of uncultured single-stranded and double-stranded DNA viruses. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7668(2011).
  14. ter Horst, A. M., et al. Minnesota peat viromes reveal terrestrial and aquatic niche partitioning for local and global viral populations (vol 9, 233, 2021). Microbiome. 9 (1), (2021).
  15. Sorensen, J., Zinke, L., ter Horst, A., Santos-Medellín, C., Schroeder, A., Emerson, J. DNase Treatment Improves Viral Enrichment in Agricultural Soil Viromes. mSystems. 6 (5), e00614-e00621 (2021).
  16. Santos-Medellín, C., Estera-Molina, K., Yuan, M., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Spatial turnover of soil viral populations and genotypes overlain by cohesive responses to moisture in grasslands. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (45), e2209132119(2022).
  17. Emerson, J. B., Geonczy, S. E., Santos-Medellín, C., ter Horst, A. M., Fudyma, J. D. Soil Viromics Protocol - Emerson Lab v1. Protocols.io. , https://protocols.io/view/soil-viromics-protocol-emerson-lab-v1-b7nyrmfw/v1 (2022).
  18. Göller, P. C., Haro-Moreno, J. M., Rodriguez-Valera, F., Loessner, M. J., Gómez-Sanz, E. Uncovering a hidden diversity: optimized protocols for the extraction of dsDNA bacteriophages from soil. Microbiome. 8 (1), 17(2020).
  19. Larsen, F. SM buffer. , Protocols.io. https://www.protocols.io/view/sm-buffer-8epv5967jg1b/v1 (2021).
  20. Camargo, A. P., et al. Identification of mobile genetic elements with geNomad. Nat Biotechnol. , (2023).
  21. Santos-Medellín, C., Blazewicz, S. J., Pett-Ridge, J., Firestone, M. K., Emerson, J. B. Viral but not bacterial community successional patterns reflect extreme turnover shortly after rewetting dry soils. Nat Ecol Evol. 7 (11), 1809-1822 (2023).
  22. Halary, S., Temmam, S., Raoult, D., Desnues, C. Viral metagenomics: are we missing the giants. Curr Opin Microbiol. 31, 34-43 (2016).
  23. Williamson, S. J., et al. Metagenomic exploration of viruses throughout the Indian Ocean. PLoS One. 7 (10), e42047(2012).
  24. Liang, G., et al. The stepwise assembly of the neonatal virome is modulated by breastfeeding. Nature. 581 (7809), 470-474 (2020).
  25. Hillary, L. S., Knotts, T. A., Adams, S. H., Ali, M. R., Olm, M. R., Emerson, J. B. DNA extraction and virome processing methods strongly influence recovered human gut viral community characteristics. bioRxiv. , (2025).
  26. Santos-Medellín, C., Zinke, L. A., ter Horst, A. M., Gelardi, D. L., Parikh, S. J., Emerson, J. B. Viromes outperform total metagenomes in revealing the spatiotemporal patterns of agricultural soil viral communities. ISME J. 15 (7), 1956-1970 (2021).
  27. Gregory, A. C., Zablocki, O., Zayed, A. A., Howell, A., Bolduc, B., Sullivan, M. B. The Gut Virome Database Reveals Age-Dependent Patterns of Virome Diversity in the Human Gut. Cell Host Microbe. 28 (5), 724-740 (2020).
  28. Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nat Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
  29. Kosmopoulos, J. C., Klier, K. M., Langwig, M. V., Tran, P. Q., Anantharaman, K. Viromes vs. mixed community metagenomes: choice of method dictates interpretation of viral community ecology. Microbiome. 12 (1), 195(2024).
  30. Zhai, X., Gobbi, A., Kot, W., Krych, L., Nielsen, D. S., Deng, L. A single-stranded based library preparation method for virome characterization. Microbiome. 12 (1), 219(2024).
  31. Hillary, L. S., Adriaenssens, E. M., Jones, D. L., McDonald, J. E. RNA-viromics reveals diverse communities of soil RNA viruses with the potential to affect grassland ecosystems across multiple trophic levels. ISME Commun. 2, 34(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Virale metagenomicahumaan viroomfeces viroomDNA extractieultracentrifugatiesamenstelling van de virale gemeenschapfiltratiemethodeshotgun metagenomicaviroomsequencing
DNA-virale fractie metagenomica voor menselijke ontlastingsmonsters
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.