Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een praktische workflow voor de analyse van ruimtelijke transcriptomics-gegevens: van gegevensverwerving tot geavanceerde analyses

195 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70188

⸱

21 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Rehabilitation Medicine Center, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 2Department of Neurology, The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, 3School of Rehabilitation Medicine, Nanjing Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een reproduceerbare workflow voor het analyseren van ruimtelijke transcriptomics-gegevens en begeleidt gebruikers bij de acquisitie van openbare gegevens en Seurat-gebaseerde kwaliteitscontrole, gevolgd door integratie, detectie van ruimtelijke kenmerken, deconvolutie van celtypen, annotatie van regio's van belang en analyse van cel-celcommunicatie, inclusief praktische controlepunten die een transparante uitvoering ondersteunen.

Samenvatting

Ruimtelijke transcriptomics (ST) brengt genexpressie op genoombrede schaal in kaart terwijl de tweedimensionale ruimtelijke context van mRNA-moleculen binnen weefselcoupes behouden blijft, wat studies naar weefselarchitectuur en biologie geassocieerd met de micro-omgeving mogelijk maakt. De analyse van ST blijft echter uitdagend omdat data-import, kwaliteitscontrole, integratie, deconvolutie, ruimtelijke statistiek en visualisatie vaak meerdere softwareomgevingen en reproduceerbare parameterkeuzes vereisen. Dit protocol presenteert een praktische computationele workflow in R voor openbare ST-datasets, beginnend bij data-acquisitie en software-installatie, gevolgd door data-laden via Seurat, kwaliteitscontrole, normalisatie, integratie van meerdere monsters, clustering en analyse van ruimtelijk variabele genen. Vervolgens past de workflow complementaire deconvolutiestrategieën toe, waaronder referentie-gestuurde SPOTlight-analyse en ongesuperviseerde STdeconvolve topic-modellering, gevolgd door een Giotto-gebaseerde analyse van ruimtelijke cel-celcommunicatie en interactieve selectie van regio's van interesse (ROI) met behulp van een aangepaste Python Dash-applicatie. Door de nadruk te leggen op script-gebaseerde uitvoering, expliciete onderbouwing van parameters, verwachte resultaten en controlepunten voor probleemoplossing, biedt het protocol een aanpasbaar kader voor standaard array-gebaseerde ST-datasets en gerelateerde platforms na evaluatie van dataset- en platformspecifieke parameters.

Inleiding

Ruimtelijke transcriptomica (ST) is een transformatieve familie van technologieën die genoombrede genexpressie meet terwijl de ruimtelijke coördinaten van messenger RNA (mRNA)-moleculen binnen weefselcoupes behouden blijven. ST-methoden omvatten op sequencing gebaseerde benaderingen die gebruikmaken van arrays met positie-barcodes en in situ imaging-benaderingen die transcriptionele signalen in kaart brengen binnen intacte weefselmicro-omgevingen1,2. Door de ruimtelijke context te behouden, maakt ST de analyse mogelijk van weefselarchitectuur, de organisatie van cellulaire nabuurschappen, cel-celcommunicatie en biologische processen geassocieerd met de micro-omgeving die niet volledig kunnen worden ontrafeld na weefseldissociatie3.

De snelle groei van openbare ST-datarepositoria heeft ongekende mogelijkheden gecreëerd voor secundaire analyse en methodeontwikkeling3. Bronnen zoals de CROST-database cureren honderden ruimtelijk opgeloste transcriptomische datasets over meerdere soorten en technologieplatforms, terwijl gespecialiseerde collecties zoals STOmicsDB zich richten op specifieke methodologieën zoals Stereo-seq4,5. Ondanks deze overvloed aan gegevens blijft computationele analyse uitdagend vanwege de complexiteit van ruimtelijke datastructuren, de diversiteit aan analytische tools en technische belemmeringen bij het implementeren van reproduceerbare workflows6,7,8,9,10,11.

Om de beperkingen van het vertrouwen op een enkele softwareomgeving aan te pakken, wordt hier een geïntegreerde computationele workflow gepresenteerd die gebruikmaakt van complementaire analytische tools. Bestaande uitgebreide ST-analyse-ecosystemen omvatten voornamelijk Seurat, Giotto en Python-gebaseerde frameworks zoals Squidpy6,7,12. Hoewel Python-gebaseerde tools zoals Squidpy uitgebreide functionaliteiten bieden voor ruimtelijke graafanalyse, minimaliseert het consolideren van de primaire computationele pipeline binnen één programmeertaalomgeving de technische hindernissen tussen verschillende talen. Bijgevolg is de kernpipeline hoofdzakelijk in R geïmplementeerd om deze cross-language technische hindernissen te verminderen. Binnen deze R-gebaseerde workflow wordt Seurat gebruikt voor het laden van gegevens, kwaliteitscontrole, normalisatie, dimensionaliteitsreductie, visualisatie en multi-sample integratie, wat het veelvoorkomende gebruik ervan in workflows voor single-cell en ruimtelijke transcriptomica weerspiegelt. Vervolgens wordt Giotto gebruikt voor de constructie van ruimtelijke netwerken en ligand-receptor-gebaseerde cel-cel communicatieanalyse. Deze pipeline koppelt dus Seurat-gebaseerde pre-processing en integratie aan Giotto-gebaseerde ruimtelijke analyse, terwijl de gegevensoverdracht tussen de twee toolsets expliciet en reproduceerbaar blijft.

Binnen dit kader worden twee complementaire deconvolutiestrategieën geïmplementeerd: SPOTlight, een referentiegestuurde methode die scRNA-seq-gegevens gebruikt om celtypeproporties te schatten, en STdeconvolve, een ongesuperviseerde topic-modeling-methode die latente transcriptionele patronen identificeert8,11. De resultaten bieden complementaire inzichten in de ruimtelijke cellulaire heterogeniteit, maar worden niet beschouwd als een kwantitatieve kruisvalidatie, tenzij gebruikers de optionele concordantieanalyse uitvoeren die in het protocol wordt beschreven. Een aangepaste Python Dash-applicatie, Select Spatial Spots, is geïntegreerd voor interactieve annotatie van regio's van belang (ROI) en exporteert standaard coördinaatgebaseerde annotatiebestanden die kunnen worden gebruikt in daaropvolgende downstream-analyses.

Wat betreft de praktische toepasbaarheid is deze workflow primair bedoeld voor standaard array-gebaseerde ST-gegevens (bijv. Visium met een resolutie van 55 µm) en kan deze na evaluatie van de parameters mogelijk worden aangepast aan andere weefseltypen. Belangrijke beperkingen moeten vóór de analyse in overweging worden genomen. Ten eerste is de referentie-gestuurde deconvolutie-module afhankelijk van een hoogwaardige, weefselspecifieke scRNA-seq-referentie. Ten tweede kunnen subcellulaire of near-single-cell platforms aangepaste voorbewerking, ruimtelijke bin-aggregatie of beeldgebaseerde celsegmentatie vereisen vóór integratie2. De representatieve dataset van de muiscolon wordt gebruikt als demonstratiegeval om te laten zien hoe de workflow ruimtelijke domeinen en marker-gedefinieerde weefselorganisatie kan evalueren, en niet als bewijs voor universele platformcompatibiliteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle biologische datasets die in dit protocol worden geanalyseerd, zijn openbaar toegankelijk en worden strikt voor demonstratiedoeleinden gebruikt. Specifieke data-accessienummers en bronrepositories worden in de relevante stappen vermeld. De oorspronkelijke datasets werden gegenereerd door de oorspronkelijke onderzoekers in overeenstemming met de institutionele ethische richtlijnen die van toepassing waren op elke bronstudie. Raadpleeg de Tabel met Materialen om alle vereiste software- en R-pakketversies te verifiëren.

Hardwarevereisten: Het benodigde computermgeheugen voor deze workflow schaalt mee met het aantal geanalyseerde monsters en spots. Voor een typische spatial transcriptomics-dataset (bijv. ongeveer 3.000 spots per monster over maximaal drie monsters) is een standaard workstation met minimaal 16 GB RAM voldoende om de pipeline uit te voeren. Echter wordt 32 GB RAM of hoger sterk aanbevolen om optimale prestaties en stabiliteit te garanderen, met name tijdens geheugenintensieve computationele stappen zoals SCTransform-normalisatie en matrixfactorisatie tijdens deconvolution.

1. Gegevensverwerving en voorbereiding van de mappenstructuur

  1. Verkrijg openbare ruimtelijke transcriptomics-datasets (bijv. GEO-accessienummer GSE169749, met een indieningsdatum van 26 maart 2021 en een laatste update datum van 6 maart 2022) en referentiegegevens van single-cell RNA-seq (bijv. GEO-accessienummer GSE264408, met een indieningsdatum van 19 april 2024 en een laatste update datum van 10 december 2024).
  2. Download het archief met ruwe gegevens (bijv. GSE169749_RAW.tar) uit de repository en pak het archief uit.
    OPMERKING: Voor de representatieve dataset die in dit protocol wordt gebruikt, bevat de uitgepakte map meerdere bestanden voor elk monster, waarbij de bestandsnamen doorgaans het GEO-monster-accessienummer bevatten (bijv. GSM5213483).
  3. Organiseer de bestanden in een gestandaardiseerde mapstructuur die compatibel is met de Seurat Load10X_Spatial functie.
    1. Maak een hoofdmap voor gegevens aan (bijv. ./data/).
    2. Maak voor elk monster een aparte submap aan (bijv. ./data/sample_A1/).
    3. Verplaats (kopieer of verplaats) de volgende essentiële bestanden voor elk monster naar de betreffende submap.
      1. Plaats het bestand filtered_feature_bc_matrix.h5 in de hoofdsubmap van het monster.
      2. Maak een spatial/ submap aan binnen elke monstermap.
      3. Plaats de volgende bestanden in de spatial/ submap: tissue_positions_list.csv.gz, scalefactors_json.json.gz en tissue_hires_image.png.gz.
    4. Decomprimeer de .gz bestanden in de spatial/ map. Zorg ervoor dat de oorspronkelijke bestandsnamen exact blijven zoals vereist door de Load10X_Spatial functie (bijv. tissue_positions_list.csv).
      OPMERKING: De uiteindelijke, georganiseerde structuur voor naadloos laden moet dit patroon volgen, met monster A1 als voorbeeld:
      ./data/sample_A1/filtered_feature_bc_matrix.h5
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_positions_list.csv
      ./data/sample_A1/spatial/scalefactors_json.json
      ./data/sample_A1/spatial/tissue_hires_image.png

2. Configuratie van de softwareomgeving

  1. Installeer R (versie 4.4.3 of hoger).
  2. Download de analysescripts (1_ReadSpatialData.R tot en met 8_Giotto_Communication.R) vanuit de GitHub-repository (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow, bij commit hash 2d85e18 voor reproduceerbaarheid).
  3. Installeer de vereiste R-pakketten vanuit CRAN en Bioconductor door het script setup.R uit te voeren.
    OPMERKING: Een volledige lijst van de specifieke pakketversies die in deze workflow worden gebruikt, is opgenomen in de Table of Materials en is ook beschikbaar in het bestand session_info.txt binnen de bijbehorende GitHub-repository (https://github.com/LeafLight/SpatialTranscriptomicsWorkFlow).
  4. Installeer Giotto Suite door de installatiecommando's uit de officiële documentatie uit te voeren.
    1. Ga naar de officiële installatie-URL om de setup-scripts op te halen: https://giottosuite.com/articles/installation.html
    2. Initialiseer de vereiste Python-omgeving en systeemafhankelijkheden volgens de stapsgewijze instructies.
  5. Installeer aanvullende pakketten voor verbeterde visualisatie.
    1. Voer uit: install.packages(c("ggprism", "colorBlindness"))
  6. Installeer de aangepaste Select Spatial Spots-tool. Controleer of het besturingssysteem Windows, macOS of Linux is, en of Python versie 3.8 of hoger is geïnstalleerd. Deze stap is optioneel.
    1. Verkrijg de tool door naar de GitHub-repository te gaan (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots, bij commit hash d20946e voor reproduceerbaarheid) en de broncode te downloaden.
    2. Ga naar de directory van de tool en installeer de Python-afhankelijkheden: pip install -r requirements.txt
  7. Installeer het glmGamPoi -pakket door BiocManager::install("glmGamPoi") uit te voeren om de SCTransform-normalisatie te versnellen.
    OPMERKING: De kernworkflow vereist alleen de pakketten die worden vermeld in stappen 2.1–2.3 en 2.6. Het pakket Rfast2 wordt gebruikt om de berekening van de Moran's I-statistiek te versnellen. De optionele pakketten in stap 2.5 zijn bedoeld voor het genereren van publicatiewaardige plots met een prism-stijl thema (ggprism) en voor toegang tot een kleurenblind-vriendelijk palet (colorBlindness). De tool in stap 2.6 maakt de interactieve spotselectie-functionaliteit mogelijk. Voer het commando sessionInfo() uit en sla de volledige console-output op in een tekstbestand. Hiermee worden de exacte softwareversies en pakketafhankelijkheden gedocumenteerd, wat essentieel is voor het waarborgen van de reproduceerbaarheid op lange termijn.

3. Laden van ruimtelijke gegevens en kwaliteitscontrole (1_ReadSpatialData.R, 2_SpatialDataQC.R)

  1. Laad de ruimtelijke gegevens in Seurat-objecten.
    1. Gebruik Read10X_Image om handmatig de weefselafbeelding met hoge resolutie te laden, waarbij de image.dir en image.name worden gespecificeerd.
    2. Gebruik Load10X_Spatial met de image-parameter ingesteld op het afbeeldingsobject dat in stap 3.1.1 is aangemaakt om het Seurat-object te creëren.
  2. Bereken kwaliteitscontrolemetrieken.
    1. Bereken het percentage mitochondriale reads met behulp van PercentageFeatureSet met het patroon ^mt-.
  3. Visualiseer en interpreteer de gegevens op basis van QC-metrieken.
    1. Genereer vioolplots van nCount_Spatial, nFeature_Spatial en percent.mt met behulp van VlnPlot.
    2. Maak ruimtelijke kenmerkplots van deze metrieken met behulp van SpatialFeaturePlot om spots buiten het weefselgebied te identificeren.
      OPMERKING: Visueel controlepunt: Spots buiten het weefselgebied vertonen doorgaans lage UMI-counts (nCount_Spatial < 500) en een lage gen-detectie (nFeature_Spatial < 200)
    3. Pas voor demonstratiedoeleinden filters toe om spots van lage kwaliteit te verwijderen (bijv. subset(seurat_obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500)). Dit is een optionele stap.
      OPMERKING: Het primaire doel van QC in ruimtelijke transcriptomica is het identificeren en annoteren van technische artefacten, zoals spots buiten het weefsel. Voor de demonstratiedata van de Visium-colon worden low-complexity/achtergrondspots verwijderd met nFeature_Spatial > 200 en nCount_Spatial > 500. Inspecteer bij weefsels met een laag RNA-gehalte of gedegradeerde coupes de viool- en ruimtelijke kenmerkplots voordat drempelwaarden worden verhoogd; voor weefsels met een hoge dichtheid of hoge UMI-counts kunnen striktere drempels passend zijn. Vermijd filtering enkel op basis van hoge expressiewaarden, tenzij doubletten, weefselplooien of duidelijke artefacten zichtbaar zijn. Filtering wordt vaak niet aanbevolen, omdat het ruimtelijke locaties fysiek verwijdert, wat de continuïteit van de weefselstructuur voor downstream ruimtelijke analyse kan verstoren.

4. Voorbewerking, integratie en clustering van gegevens (3_IntegrationAndClustering.R)

  1. Normaliseer en bewerk individuele monsters voor.
    1. Pas de SCTransform-normalisatie op elk monster afzonderlijk toe met assay = Spatial.
  2. Integreer meerdere monsters.
    1. Bereid de lijst met SCT-genormaliseerde objecten voor integratie voor. Zorg ervoor dat elk object een "RNA"-assay heeft door de "Spatial"-assay te kopiëren: spatial_list[[1]][["RNA"]] <- spatial_list[[1]][["Spatial"]]
      ​OPMERKING: Het kopiëren van de "Spatial"-assay naar een standaard "RNA"-assay-slot dient als een noodzakelijke workaround om compatibiliteit te garanderen met downstream integratiefuncties die oorspronkelijk zijn ontworpen voor single-cell Seurat-objecten.
    2. Gebruik SelectIntegrationFeatures en PrepSCTIntegration om gedeelde variabele kenmerken te identificeren.
    3. Vind integratie-ankers met behulp van FindIntegrationAnchors met normalization.method = "SCT".
    4. Integreer de gegevens met IntegrateData met normalization.method = "SCT".
  3. Voer dimensionaliteitsreductie en clustering uit op de geïntegreerde assay.
    1. Voer PCA uit op de geïntegreerde gegevens met behulp van RunPCA.
    2. Bepaal het optimale aantal hoofdcomponenten (PC's) voor downstream analyse door de cumulatieve verklaarde variantie te berekenen. Identificeer het knikpunt (elbow point) programmatisch (bijv. het punt waar de cumulatieve variantie 90% overschrijdt en de marginale winst onder 0,1% daalt), met behulp van de code in 3_IntegrationAndClustering.R, regels 36-38. Het resulterende aantal PC's wordt hierna aangeduid als pc.use.
    3. Voer RunUMAP uit met dims = 1:pc.use.
    4. Cluster de cellen met behulp van FindNeighbors met dims = 1:pc.use en FindClusters met resolution = 0.5. Pas de resolutie alleen aan na inspectie van de clusterstabiliteit en de coherentie van markergenen.
    5. Voer een differentiële expressieanalyse uit tussen doelgroepen (bijv. "B1_colon_d14" versus "A1_colon_d0") met de FindMarkers-functie.
      ​OPMERKING: Visueel controlepunt: een succesvolle integratie zal een passende menging van monsters tonen in de UMAP-plot, terwijl biologisch onderscheidende clusters behouden blijven.
  4. Identificeer ruimtelijk variabele genen.
    1. Voer voor elk oorspronkelijk monster FindSpatiallyVariableFeatures uit met de "moransi"-methode op de "SCT"-assay om ruimtelijke autocorrelatie te berekenen.

5. Pre-processing van referentiedata op single-cell niveau (4_scDataPreProcessing.R)

  1. Lees de single-cell RNA-seq count-matrix in met Read10X en maak een Seurat-object aan.
  2. Voer standaard QC, normalisatie en clustering uit.
    1. Bereken het percentage mitochondriale reads (percent.mt) en filter de cellen (bijv. nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 7500 & percent.mt < 25).
    2. Normaliseer de data met SCTransform, waarbij vars.to.regress = "percent.mt" wordt ingesteld.
    3. Voer PCA en UMAP uit, en cluster de cellen met de methode voor dynamische PC-selectie zoals beschreven in stap 4.3.2.
  3. Annoteer de celtypen.
    1. Bereken de module-scores voor canonieke celtype-markergenen met AddModuleScore.
    2. Annoteer de clusters op basis van de module-scores en bekende biologie. Importeer alternatief vooraf berekende annotaties uit metadata.

6. Referentie-gestuurde deconvolutie met SPOTlight (5_SPOTlight_Deconv.R)

  1. Bereid de gegevens voor voor SPOTlight.
    1. Converteer het geannoteerde single-cell Seurat-object en het ruimtelijke Seurat-object naar SingleCellExperiment-objecten.
    2. Voer log-normalisatie uit op de single-cell-gegevens met behulp van logNormCounts.
  2. Voer de SPOTlight-deconvolutie uit.
    1. Identificeer hypervariabele genen (HVG's) in de single-cell-gegevens met behulp van modelGeneVar en getTopHVGs.
    2. Bereken celtype-markergenen met behulp van scoreMarkers en filter op hoogwaardige markers (bijv. mean.AUC > 0,8).
    3. Voer downsampling uit op de single-cell-referentie voor elk celtype naar een beheersbaar aantal (bijv. 50 cellen) om de rekentijd te verkorten.
    4. Voer de deconvolutie uit met de SPOTlight functie met weight_id = "mean.AUC", group_id = "cluster", en gene_id = "gene".
  3. Visualiseer en exporteer de resultaten.
    1. Extraheer de resultatenmatrix van de deconvolutie (celtype-proporties per spot).
    2. Gebruik plotSpatialScatterpie om de cellulaire compositie op de ruimtelijke coördinaten te visualiseren.
    3. Voeg de deconvolutieresultaten toe aan de metadata van het ruimtelijke Seurat-object met behulp van AddMetaData. Verwachte output: een deconvolutiematrix met kolommen voor de celtype-proporties voor elke ruimtelijke spot, ruimtelijke scatterpie-plots die de lokale cellulaire compositie tonen, en een Seurat-object waarin de deconvolutieproporties als metadata zijn opgenomen.

7. Referentievrije deconvolutie met STdeconvolve (7_STdeconvolve.R)

  1. Bereid de ruimtelijke gegevens voor.
    1. Extraheer de matrix met ruwe tellingen uit het ruimtelijke Seurat-object met behulp van GetAssayData met slot = "counts".
    2. Verwijder spots en genen van lage kwaliteit met behulp van cleanCounts van STdeconvolve (bijv. min.lib.size = 100).
  2. Identificeer de latente celtypen.
    1. Filter het corpus verder op genen die tot expressie komen in een minimale fractie van de spots met behulp van restrictCorpus (bijv. removeAbove=1.0, removeBelow = 0.05).
    2. Pas een Latent Dirichlet Allocation (LDA)-model toe over een reeks potentiële aantallen topics (K) (bijv. Ks = seq(2, 9, by = 1)) met behulp van fitLDA.
    3. Selecteer het optimale model op basis van de minimale perplexiteit met behulp van optimalModel met opt = "min".
  3. Analyseer en visualiseer de resultaten.
    1. Extraheer de celtype- (topic) proporties (theta) en genprofielen (beta) uit het optimale model met behulp van getBetaTheta.
    2. Om de biologische interpretatie van de gedeconvolueerde topics te ondersteunen, importeert u annotaties van interessegebieden (ROI) die zijn gegenereerd door de tool "Select Spatial Spots" (zie stap 9.3.3). Gebruik deze annotaties als de parameter groups in de vizAllTopics-functie om de gedeconvolueerde celtype-proporties terug te projecteren op de ruimtelijke coördinaten en de spots per ROI te kleuren. Dit is een optionele stap.
      OPMERKING: Verwachte output: STdeconvolve moet theta-waarden teruggeven die de topic-proporties per spot vertegenwoordigen en beta-waarden die de genprofielen voor elk topic vertegenwoordigen. Indien gebruikers de unsupervised STdeconvolve-resultaten kwantitatief willen vergelijken met de referentie-gestuurde SPOTlight-outputs (uit stap 6), kunnen zij beide proportiematrices (theta van STdeconvolve en de SPOTlight-matrix) exporteren en per-spot correlatie- of concordantiemetrieken (bijv. Pearson- of Spearman-correlatie) berekenen met behulp van standaard R-functies. Kwantitatieve vergelijking tussen SPOTlight en STdeconvolve is optioneel en niet vereist voor het uitvoeren van de kernworkflow; de relevante outputmatrices zijn echter beschikbaar uit stappen 6.3.1 en 7.3.1 voor gebruikers die een dergelijke analyse willen uitvoeren.

8. Ruimtelijke cel-cel communicatie met Giotto(8_Giotto_Communication.R)

  1. Converteer het Seurat-object naar een Giotto-object.
    1. Gebruik de functie createGiottoObject en voer de ruwe count-matrix en ruimtelijke coördinaten in.
  2. Voorbewerking van het Giotto-object en toevoegen van de deconvolution-resultaten.
    1. Normaliseer de gegevens met behulp van normalizeGiotto.
    2. Voeg de celtype-annotaties (bijv. het hoofdceltype uit de SPOTlight-deconvolution) toe aan de celmetadata met addCellMetadata.
  3. Afleiding van ruimtelijk geïnformeerde cel-celcommunicatie.
    1. Maak een ruimtelijk netwerk aan met createSpatialNetwork met method = "Delaunay" en name = "Delaunay_network".
    2. Laad een ligand-receptor-database in de R-omgeving. Zorg ervoor dat het geladen object is opgemaakt als een data frame met twee afzonderlijke kolommen die de gen-symbolen van het ligand en de receptor vertegenwoordigen (bijv. een vooraf samengesteld muisnetwerk van Zenodo: https://zenodo.org/api/records/15168114/files/lr_network_mouse.csv/content, versie v6, gepubliceerd op 7 april 2025).
    3. Voer exprCellCellcom uit met cluster_column = "celltype_major" om significante ligand-receptor-interacties te identificeren tussen celtypen die zich in ruimtelijke nabijheid bevinden. Verwachte output: een resultatentabel met ligand-receptor-paren, bron- en doelceltypecombinaties, log2 fold-change waarden en gecorrigeerde P-waarden; behoud significante interacties (bijv. p.adj < 0.05) voor visualisatie.

9. Interactieve selectie van spots met select spatial spots (6_SelectSpatialSpots.R)

  1. Bereid de gegevens voor voor de interactieve tool.
    1. Extraheer de ruimtelijke coördinaten uit het Seurat-object met behulp van GetTissueCoordinates.
  2. Formatteer en exporteer de gegevens.
    1. Formatteer het data frame met coördinaten zodat het de exacte kolomkoppen bevat: CELL_ID, X en Y.
    2. Exporteer het geformatteerde data frame naar een CSV-bestand.
  3. Voer een analyse van het interessegebied (ROI) uit.
    1. Start de aangepaste Select Spatial Spots Dash-applicatie en laad het CSV-bestand.
    2. Selecteer interactief spots op basis van de ruimtelijke locatie.
    3. Exporteer de lijst met geselecteerde spots en hun toegewezen groep-/ROI-labels als een nieuw CSV-bestand. Verwachte output: een CSV-bestand met spot-identificatoren, X/Y-coördinaten en toegewezen groep-/ROI-labels die via CELL_ID kunnen worden gekoppeld aan het Seurat-object.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De implementatie van de workflow en data-integratie illustreren belangrijke weefselkenmerken

De computationele workflow werd toegepast op ruimtelijke transcriptomics-gegevens van de muizencolon om de verwachte resultaten in de verschillende analytische fasen te illustreren. Zoals weergegeven in het schema van de workflow (Figuur 1), begon de pijplijn met gegevensverwerving en kwaliteitscontrole, waarbij ruimtelijke kenmerkplots de weefselgrenzen a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een uitgebreide computationele workflow voor de analyse van ruimtelijke transcriptomica-gegevens die een balans biedt tussen analytische diepgang en praktische toegankelijkheid. De stapsgewijze aanpak begeleidt onderzoekers door de volledige analytische pijplijn, van de initiële gegevensverwerving tot geavanceerde ruimtelijke analyses, waarbij de nadruk ligt op kritieke beslismomenten en potentiële valkuilen.

Verschillende stappen in het protocol verdienen bijzondere aandach...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de ontwikkelaars en beheerders van de Seurat-, Giotto- en SPOTlight-pakketten voor hun ondersteuning en documentatie. Ook de bijdragen van openbare datadepots en de onderzoekers die hun datasets genereus hebben gedeeld, worden dankbaar erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ggplot2Posit Software, PBCv4.0.0(CRAN)Geavanceerde datavisualisatie
GiottoDries Labv4.2.2 (GitHub)Analyse van ruimtelijke netwerken en cel-cel communicatie
patchwork Thomas Lin Pedersenv1.3.2 (CRAN)Compositie en ordening van plots
R software R Foundation for Statistical Computingv4.4.3Kernuitvoeringsomgeving (macOS aarch64)
scaterDavis McCarthy et al.v1.34.1 (Bioconductor)Kwaliteitscontrole en visualisatie van single-cell data
scranAaron Lun et al.v1.34.0 (Bioconductor)Single-cell variantiemodellering en markerdetectie
Select Spatial Spots (Aangepaste Python-tool)LeafLightv1.0.0 (GitHub)Interactieve selectie van ruimtelijke regio's van belang (ROI) (https://github.com/LeafLight/SelectSpatialSpots)
Seurat Satija Labv5.3.0 (CRAN)Preprocessing, integratie en clustering van ruimtelijke data
SeuratObject Satija Labv5.2.0 (CRAN)Datastructuren voor single-cell en ruimtelijke data
SingleCellExperimentBioconductor Core Teamv1.28.1 (Bioconductor)Gestandaardiseerde datacontainer voor scRNA-seq
SPOTlightMarc Elosua-Bayes et al.v1.10.0 (Bioconductor)Referentie-gestuurde ruimtelijke deconvolutie
StdeconvolveJean Fan Labv1.3.2 (Bioconductor)Ongecontroleerde latente topic-modellering
tidyversePosit Software, PBCv2.0.0 (CRAN)Kernsuite voor datamanipulatie en opmaak

Referenties

  1. Ozirmak Lermi N, Molina Ayala M, Hernandez S, et al. Comparison of imaging based single-cell resolution spatial transcriptomics profiling platforms using formalin-fixed paraffin-embedded tumor samples. Nat Commun. 2025;16(1):8499.
  2. Ren P, Zhang R, Wang Y, et al. Systematic benchmarking of high-throughput subcellular spatial transcriptomics platforms across human tumors. Nat Commun. 2025;16(1):9232.
  3. Danishuddin, Khan S, Kim JJ. Spatial transcriptomics data and analytical methods: An updated perspective. Drug Discovery Today. 2024;29(3):103889.
  4. Xu Z, Wang W, Yang T, et al. STOmicsDB: A comprehensive database for spatial transcriptomics data sharing, analysis and visualization. Accessed October 31, 2025. https://dx.doi.org/10.1093/nar/gkad933
  5. Wang G, Wu S, Xiong Z, Qu H, Fang X, Bao Y. CROST: A comprehensive repository of spatial transcriptomics. Nucleic Acids Res. 2024;52(D1):D882-D890.
  6. Chen JG, Chávez-Fuentes JC, O’Brien M, et al. Giotto Suite: a multiscale and technology-agnostic spatial multiomics analysis ecosystem. Nat Methods. 2025;22(10):2052-2064. doi:10.1038/s41592-025-02817-w
  7. Butler A, Hoffman P, Smibert P, Papalexi E, Satija R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 2018;36(5):411-420.
  8. Elosua-Bayes M, Nieto P, Mereu E, Gut I, Heyn H. SPOTlight: seeded NMF regression to deconvolute spatial transcriptomics spots with single-cell transcriptomes. Nucleic Acids Res. 2021;49(9):e50-e50.
  9. McCarthy DJ, Campbell KR, Lun ATL, Wills QF. Scater: pre-processing, quality control, normalization and visualization of single-cell RNA-seq data in R. Bioinformatics. 2017;33(8):1179-1186.
  10. Lun ATL, McCarthy DJ, Marioni JC. A step-by-step workflow for low-level analysis of single-cell RNA-seq data with bioconductor. F1000Research. Preprint posted online October 31, 2016. doi:10.12688/f1000research.9501.2
  11. Miller BF, Huang F, Atta L, Sahoo A, Fan J. Reference-free cell type deconvolution of multi-cellular pixel-resolution spatially resolved transcriptomics data. Nat Commun. 2022;13(1):2339.
  12. Palla G, Spitzer H, Klein M, et al. Squidpy: A scalable framework for spatial omics analysis. Nat Methods. 2022;19(2):171-178.
  13. Luecken MD, Büttner M, Chaichoompu K, et al. Benchmarking atlas-level data integration in single-cell genomics. Nat Methods. 2022;19(1):41-50.
  14. Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019 Dec 23;20(1):296.
  15. Cuevas-Diaz Duran R, Wei H, Wu J. Data normalization for addressing the challenges in the analysis of single-cell transcriptomic datasets. BMC Genomics. 2024;25(1):444.
  16. Sun S, Zhu J, Zhou X. Statistical analysis of spatial expression patterns for spatially resolved transcriptomic studies. Nat Methods. 2020;17(2):193-200.
  17. Jin S, Plikus MV, Nie Q. CellChat for systematic analysis of cell–cell communication from single-cell transcriptomics. Nat Protoc. 2025;20(1):180-219.
  18. Zohora FT, Paliwal D, Flores-Figueroa E, et al. CellNEST reveals cell–cell relay networks using attention mechanisms on spatial transcriptomics. Nat Methods. 2025;22(7):1505-1519.
  19. Wang Q, Zhu H, Deng L, et al. Spatial transcriptomics: Biotechnologies, computational tools, and neuroscience applications. Small Methods. 2025;9(5):2401107.
  20. Chen MM, Gao Q, Ning H, et al. Integrated single-cell and spatial transcriptomics uncover distinct cellular subtypes involved in neural invasion in pancreatic cancer. Cancer Cell. 2025;43(9):1656-1676.e10.
  21. Li H, Guan W, Huang J, et al. A complete model of mouse embryogenesis through organogenesis enabled by chemically induced embryo founder cells. Cell. 2025;188(21):5912-5930.e20.
  22. Loh JW, Lee JY, Lim AH, et al. Spatial transcriptomics reveal topological immune landscapes of asian head and neck angiosarcoma. Commun Biol. 2023;6(1):461.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

GenexpressieprofileringweefselarchitectuurdataintegratiekwaliteitscontroleSeurat-workflowruimtelijke deconvolutieSPOTlight-analysecelcommunicatieanalyseinteressegebied
Een praktische workflow voor de analyse van ruimtelijke transcriptomics-gegevens: van gegevensverwerving tot geavanceerde analyses
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.