Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie gebruikte 16S rRNA-sequencing om darmmicrobiota te vergelijken tussen gezonde controles, onbehandelde PD-patiënten en met piribedil behandelde PD-patiënten, en ontdekte verschillen in microbiële samenstelling die geassocieerd zijn met piribedilbehandeling.
Deze studie had als doel te bepalen of de behandeling van piribedil de darmmicrobiota van patiënten met de ziekte van Parkinson (PD) verandert, en biedt een theoretische referentie voor het begrijpen van veranderingen in de darmmicrobiota veroorzaakt door piribedil en hun mogelijke klinische implicaties. Fecale monsters werden geanalyseerd met 16S ribosomale RNA (16S rRNA) gensequencing. Er werden vergelijkingen gemaakt tussen patiënten met PD die piribedil namen (piribedilgroep), patiënten met PD die geen piribedil namen (PD-groep) en gezonde controles (blanco groep). In vergelijking met de blanke groep was de relatieve abundantie van Staphylococcus, Rhodococcus en andere geslachten hoger in de PD-groep, terwijl de relatieve abundantie van Achromobacter en Delftia lager was. Bovendien was de relatieve abundantie van Achromobacter, Delftia en Stenotrophomonas hoger in de piribedietgroep vergeleken met de PD-groep, terwijl de relatieve abundantie van Staphylococcus, Rhodococcus en andere soorten lager was. In vergelijking met gezonde personen vertoonde de darmmicrobiota van patiënten met PD significante veranderingen. De darmmicrobiota van patiënten die piribedil gebruiken verschilt aanzienlijk van die van onbehandelde patiënten. Deze resultaten suggereren een verband tussen piribedil en veranderde darmmicrobiota bij patiënten met PD.
De incidentie van de ziekte van Parkinson (PD) neemt geleidelijk toe; de etiologie en pathogenese zijn echter nog niet volledig vastgesteld. Meer studies hebben aangetoond dat het darmmicrobioom nauw verbonden is met het ontstaan en de ontwikkeling van PD. Hij et al.1documenteerden dat de samenstelling van de darmmicrobiota bij patiënten met PD afwijkt van die van gezonde mensen, en dat een toename van darmpathogenen geassocieerd kan zijn met het ontstaan van PD. Scheperans et al.2bevestigden dat de relatieve hoeveelheid Prevotella en Bacteroides in de darmen bij patiënten met PD afneemt, en dat deze bacteriële geslachten sterk geassocieerd zijn met de functie van de darmbarrière.
Verschillende studies hebben het verband tussen de darmmicrobiota en PD onderzocht. Onderzoek suggereert dat dysbiose een cruciale rol kan spelen in de pathofysiologie van PD, waarbij motorische en niet-motorische symptomen via meerdere mechanismen worden beïnvloed, waaronder ontsteking en stofwisselingsstoornissen3. Daarnaast is aangetoond dat medicijnbehandelingen voor PD de samenstelling van het darmmicrobioomveranderen 4,5, wat de complexe wisselwerking tussen geneesmiddelen en het darmmicrobioom onderstreept.
Als niet-selectieve dopaminereceptoragonist is piribedil van cruciaal belang bij het beheersen van PD; Het kan motorische symptomen bij patiënten verbeteren door dopaminereceptoren6 te stimuleren. Het klinische gebruik wordt echter vaak beperkt door bijwerkingen, voornamelijk gastro-intestinale klachten zoals misselijkheid, braken en buikpijn7. Het onderliggende mechanisme van deze bijwerkingen blijft onduidelijk, en of ze verband houden met veranderingen in de darmmicrobiota veroorzaakt door piribedil is nog onbekend.
De link tussen de darmmicrobiota en bijwerkingen van geneesmiddelen heeft de afgelopen jaren steeds meer belangstelling gekregen. Hill-Burns et al.8analyseerden de darmmicrobiota bij patiënten met PD en ontdekten dat de diversiteit van darmmicrobiota geassocieerd was met de respons op medicamenteuze therapie. Daarnaast kunnen dopamine-agonisten invloed hebben op de darmmotiliteit en microbiële samenstelling9. Men denkt dat de mechanismen achter deze veranderingen veranderingen in de timing van darmtransport omvatten, wat op zijn beurt de microbiële diversiteit en abundantie beïnvloedt. Bovendien kan de darmmicrobiota de opname en het metabolisme van het medicijnbeïnvloeden, waardoor de effectiviteit en bijwerkingen van deze medicijnen worden beïnvloed. Er is echter nog steeds een gebrek aan systematisch onderzoek naar de vraag of en hoe piribedil, een veelgebruikt agent voor de ziekte van Parkinson, de structuur van het darmmicrobiota moduleert, evenals naar de associatie tussen dergelijke microbiële verschuivingen en de gastro-intestinale bijwerkingen daarvan.
In deze studie hebben we de structuur van het darmmicrobiota vergeleken tussen gezonde controles, onbehandelde PD-patiënten en PD-patiënten die met piribedil werden behandeld. We stelden de hypothese op dat de behandeling van piribedil geassocieerd is met duidelijke veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota bij patiënten met PD en dat deze microbiële veranderingen mogelijk verband houden met piribedil-geassocieerde gastro-intestinale bijwerkingen. We wilden specifieke microbiële veranderingen die met piribedil samenhangen identificeren en hun mogelijke verband met gastro-intestinale bijwerkingen onderzoeken, zodat we een theoretische basis boden voor het begrijpen van het mechanisme van piribedil-gerelateerde bijwerkingen.
De darmmicrobiota is een belangrijke richting voor onderzoek naar de pathogenese van PD11. Door de effecten van piribedil op de darmmicrobiota bij patiënten met PD te observeren, helpt deze studie de klinische betekenis van geneesmiddelgerelateerde veranderingen in darmmicrobiota te verduidelijken en biedt het een referentie voor het optimaliseren van het klinisch gebruik en het veiligheidsbeheer van piribedil.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie werd beoordeeld door de Ethische Commissie van het Eerste Geaffilieerde Ziekenhuis van de Anhui Universiteit voor Chinese Geneeskunde (Ethiek beoordelingsnummer: 2025AH-101, Ethische goedkeuringsdatum: 2025-07-02).
Onderzoeksonderwerpen
Patiënten met PD en gezonde controles in het Eerste Affilieerde Ziekenhuis van de Anhui Universiteit voor Chinese Geneeskunde werden ingeschreven. Verse ontlastingsmonsters werden verzameld voor vervolganalyse. Verse ontlastingsmonsters werden verzameld, in steriele EP-buizen gealiquoteerd, direct ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens opgeslagen op −80 °C voor langdurige conservering. De inclusiecriteria van patiënten met PD waren als volgt: (1) klinisch gediagnosticeerde PD; (2) leeftijd >70 jaar; (3) voor de Piribedil-groep: gestart met piribedil-monotherapie na inschrijving en geen eerdere blootstelling aan dit medicijn; voor de PD-groep: geen behandeling met anti-Parkinsonmedicatie; (4) geen andere ernstige systemische ziekten, zoals ernstige hartziekten, leverziekten, nierziekten of kanker. Voorafgaand aan de inschrijving werd schriftelijke geïnformeerde toestemming van elke deelnemer verkregen. De exclusiecriteria waren als volgt: (1) ernstige complicaties van PD, zoals ernstige motorische disfunctie; (2) recent antibioticabehandeling ontvangen; (3) aanwezigheid van andere gezondheidsproblemen die de onderzoeksresultaten kunnen beïnvloeden, zoals inflammatoire darmziekte, prikkelbare darmsyndroom, enzovoort; (4) allergisch voor piribedil. De gezonde controlepersonen (blanke groep) waren leeftijdsgematchte (leeftijd >70 jaar) zonder voorgeschiedenis van neurologische of grote gastro-intestinale aandoeningen.
Alle deelnemers moesten hun reguliere eetgewoonten aanhouden voordat ze zich inschrijven. Geen van hen had probiotica, prebiotica, voedingsvezelsupplementen of andere voedingssupplementen ontvangen. Daarnaast hadden alle deelnemers minstens drie maanden vóór de monsterafname geen antibioticabehandeling ontvangen. Tijdens de studie werd geen gestandaardiseerde dieetinterventie uitgevoerd, maar alle deelnemers kregen de instructie om een stabiele levensstijl en dieet te hanteren om mogelijke verstorende effecten op de darmmicrobiota te minimaliseren.
Onderzoeksgroep
Deze studiecohort werd verdeeld in drie groepen: PD-groep (n = 10): fecale monsters verzameld van Parkinsonpatiënten die geen anti-Parkinsonmedicatie gebruikten. Piribedil-groep (n=10): fecale monsters verzameld van patiënten met de ziekte van Parkinson na 21 opeenvolgende dagen behandeling met piribedil (50 mg, tweemaal daags). Blanco controlegroep (n=5): ontlastingsmonsters verzameld van gezonde individuen.
16S ribosomale RNA-sequencing
De sequencing werd uitgevoerd op een sequencingplatform, zoals gerapporteerd in andere studies12,13. Kort gezegd werd totaal microbieel DNA geïsoleerd uit fecale monsters met behulp van de natriumdodecylsulfaat (SDS)-methode 14,15,16. De integriteit van het geëxtraheerde DNA werd geverifieerd met 1% agarosegelelektroforese, en DNA-concentratie en zuiverheid werden bepaald met een spectrofotometer. De hypervariabele regio V3-V4 van het bacteriële 16S rRNA-gen werd geampliceerd uit genomisch DNA met behulp van degeneratieve primers 341F (5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3') en 806R (5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3') met Polymerase Chain Reaction (PCR) thermocycler. De amplificatie van het bacteriële 16S rRNA-gen werd uitgevoerd onder de volgende thermische omstandigheden: een initiële pre-denaturatiestap bij 94 °C gedurende 2 minuten, gevolgd door 28 cycli bestaande uit 94 °C denaturatie voor 30 s, 55 °C annealing voor 30 s, en 72 °C verlenging voor 30 s. Een laatste verlenging werd uitgevoerd bij 72 °C gedurende 10 minuten, waarna de reactie op 4 °C werd gehandhaafd. De PCR-mengsels bevatten 2× PCR mastermix 25 μL, forward primer (10 μM) 2 μL, reverse primer (10 μM) 2 μL, template DNA 10 ng, en tenslotte ddH2O tot 50 μL. PCR-reacties werden uitgevoerd in drievoud uitvoering. De PCR-mengsels bevatten 2× PCR mastermix 25 μL, forward primer (10 μM) 2 μL, reverse primer (10 μM) 2 μL, template DNA 10 ng, en tenslotte ddH2Otot 50 μL. PCR-reacties werden uitgevoerd in drievoud uitvoering. Het PCR-product werd geëxtraheerd uit 2% agarosegel en gezuiverd met een gelextractiekit. Universal Plus DNA Library Prep Kit voor MGI V2 werd gebruikt om de bibliotheek op te bouwen: (1) Splinter link; (2) Gebruik magnetische kraalafscherming om de gewrichts-zelfaaneengesloten segmenten te verwijderen; (3) Verrijking van bibliotheektemplates door PCR-versterking; (4) Magnetische kralen om PCR-producten terug te winnen; (5) Cyclisering van PCR-producten. Na de validatie van de bibliotheek werd de sequencing uitgevoerd.
Kwaliteitscontrolepunten: Controlepunt 1 (Monsterverzameling): Monsters werden direct na het verzamelen ingevroren en opgeslagen bij −80°C. Elk monster met zichtbare tekenen van ontdooien of besmetting werd weggegooid. Checkpoint 2 (DNA-extractie): Acceptabele zuiverheid: A260/A280 = 1,8–2,0, A260/A230 ≥1,8; Integriteit wordt bevestigd door een enkele band met een hoog moleculair gewicht op 1% agarosegel. Checkpoint 3 (PCR-versterking): Een enkele band bij ~460bp op 2% agarosegel duidt op succesvolle amplificatie (primers 341F/806R, V3-V4 regio); Als deze ontbreekt of niet specifiek is, pas dan de annealingtemperatuur of sjabloonconcentratie aan. Herstelconcentratie ≥0,5 ng/μl was vereist voor de voorbereiding van de bibliotheek. Checkpoint 4 (Bibliotheekvoorbereiding en sequencing): Uitgevoerd door de sequencingfaciliteit volgens hun standaard gevalideerde protocollen; er werd geen extra interne controlepost (bijv. Bioanalyzer-grootte) toegepast.
Veiligheid en afvalverwerking: Handschoenen en laboratoriumjassen werden gedragen bij alle monsterbehandeling. Werkoppervlakken zijn gereinigd met 70% ethanol. Alle besmette verbruiksmaterialen (tips, tubes, gels) werden geautoclaveerd (121°C, 20 min) voordat ze als biologisch gevaarlijk afval werden verwijderd.
Bio-informatica
Ruwe sequencing-reads van het 16S rRNA-gen werden eerst gedemultiplexeerd, onderworpen aan kwaliteitsfiltering met fastp (versie 0.20.0), en geassembleerd via FLASH (versie 1.2.11) volgens gestandaardiseerde screeningscriteria. Kort samengevat: (i) Raw 300 bp-sequenties werden ingekort toen de gemiddelde kwaliteitsscore onder de 20 zakte binnen een schuifvenster van 50 bp. Lezingen met afgekorte lengtes korter dan 50 bp of met ambigue bases werden verwijderd; (ii) Sequentieassemblage werd alleen uitgevoerd bij overlappingen van meer dan 10 bp, waarbij de maximale mismatchverhouding van het overlappende gebied werd vastgesteld op 0,2. Ongepaarde lezingen die niet werden samengesteld, werden geëlimineerd; (iii) Individuele monsters werden verdeeld op basis van barcode- en primersequenties voor latere oriëntatieaanpassing. Barcodematching werd uitgevoerd met exacte uitlijning, terwijl primermatching maximaal 2 nucleotide mismatches toestond. 16S rRNA-lezingen werden geanalyseerd met behulp van de Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) pijplijn (versie 1.8.0)17. Tagsequenties werden toegevoegd aan gepaarde eindlezingen met behulp van FLASH (versie 1.2.11)18. Trimming werd uitgevoerd met UPARSE (versie 7.0.1090) met een minimale lengte van 200 bp en een gemiddelde kwaliteit van 25, gevolgd door clustering bij een 97% cutoff om operationele taxonomische eenheden (OTU's)19 te genereren. Representatieve OTU-metingen werden taxonomisch geclassificeerd via RDP Classifier 2.2, met een betrouwbaarheidslimiet ≥0,6. Tag- en leesabundanties werden bepaald door vergelijking met USEARCH global20. De identificatie van chimerische sequenties was gebaseerd op vergelijkingen met de Gold-database met behulp van UCHIME (v4.2.40)21. Principal coördinatenanalyse (PCoA) werd vervolgens uitgevoerd op de sparse dataset gebaseerd op de Bray–Curtis-ongelijkheid, waarbij de sequentiegelijkheidsdrempel werd gesteld op 97% voor clustering. Representatieve OTU's en bijbehorende taxonomische profielen werden verder geanalyseerd met R-software (versie 3.1.1). Het algoritme voor de effectgrootte van de lineaire discriminantanalyse (LEfSe), gebaseerd op de effectgrootte van lineaire discriminantanalyse (LDA), werd toegepast om biomarkers met significante differentiële abundantie op OTU-niveau te screenen. Deze methode benadrukt zowel statistische significantie als biologische relevantie door eerst kenmerken met consistente verschillen tussen groepen te identificeren (met behulp van de Kruskal-Wallis-test voor multigroepsvergelijking) en vervolgens de effectgrootte van elk verschillend overvloedig kenmerk te schatten met behulp van LDA. Een LDA-score >2,0 wordt gedefinieerd als een significant verhoogde abundantievan 22.
Statistische methoden
Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS. Normaal verdeelde gegevens werden geanalyseerd met behulp van de eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA). Gegevens die niet aan de normale verdeling voldeden, werden geanalyseerd met behulp van de Wilcoxon rangsomtest. Alle kwantitatieve gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout (SE) voor parameters die voldoen aan een normale verdeling, terwijl niet-normaal verdeelde gegevens werden gepresenteerd als mediaan met interkwartielbereik. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Verschillen in microbiële diversiteit die samenhangen met de behandeling van piribedilen
Kwaliteitscontroleresultaten voor DNA-extractie (concentratiebereik, zuiverheid) worden weergegeven in Aanvullende Tabel 1. Kwaliteitscontrole voor PCR-versterking (bandgrootte, herstel-concentraties) wordt weergegeven in Aanvullende Tabel 2. Kwaliteitscontrolemetrics voor sequencing (leesaantallen, diepte, dekking) worden beschreven in
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De ziekte van Parkinson is wereldwijd de op één na meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening, alleen voorafgegaan door de ziekte van Alzheimer23. Sinds 1970 wordt piribedil, als dopaminereceptoragonist, veel gebruikt bij de behandeling van PD24. In de klinische praktijk kan piribedil echter enkele bijwerkingen veroorzaken, zoals misselijkheid, braken en maag-darmklachten. Groeiend onderzoek toont aan dat de ontwikkeling van de ziekte ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs stellen dat er geen concurrerende belangen zijn.
Dit onderzoek werd ondersteund door het Anhui Province Academic Leader Reserve Candidate Funding Project (nr. 2022H287), het Anhui Province Hygiene and Health Outstanding Talents Project (nr. ahsjhmypygc20230074), het Anhui Provincial Scientific Research Project on Inheritance and Innovation of Traditional Chinese Medicine (2025CCCX017), en het Special Project for Basic-Clinical Integration van de Anhui University of Chinese Medicine (JCLCA2025009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2× reaction buffer (Taq MasterMix) | Kangweii | CW0690 | |
| Agarose | (algemeen) | niet van toepassing | moleculaire biologie kwaliteit |
| AxyPrep DNA Gel Extraction Kit | Axygen Biosciences | (niet geleverd) | |
| Benchtop high-speed vriescentrifuge | Hunan Kosei | GTR116C | |
| DNA extractiereagentia (SDS, fenol, chloroform, ethanol) | (algemeen) | niet van toepassing | |
| DNBSEQ-G99 PE300 sequencing platform | MGI Tech Co., Ltd | DNBSEQ-G99 | |
| Gel elektroforese apparaat | Beijing Liuyi | DYY-8C | |
| Gel beeldvormingssysteem | Shanghai Jiapeng | JP-2880 | |
| LEfSe software | (open source) | online versie | |
| NanoDrop spectrofotometer | Hangzhou Haipe | Aurora-900 | |
| PCR machine | Hangzhou Langji | A200 | |
| Piribedil | Servier | 6094078 | |
| Primers: 341F en 806R (gesynthetiseerd) | (op maat synthese) | niet van toepassing | |
| QIIME software | (open source) | http://qiime.org | versie 1.8.0 |
| Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
| Qubit 4.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| SDS (natriumdodecylsulfaat) | (algemeen) | niet van toepassing | |
| UPARSE software | (open source) | http://drive5.com/uparse | versie 7.0.1090 |
| VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit voor MGI V2 | Vazyme | NDM627-01 |