Ontwikkeling van mesenchymale stamcelmembraan-omhulde nanovesikels voor verbeterde genlevering

Samenvatting

Dit protocol heeft als doel een methode te introduceren om mesenchymale stamcel (MSC)-afgeleide extracellulaire vesikelbiomimetica te produceren en te zuiveren voor gentherapie. De nanovesikel is ingesloten met MSC-afgeleide lipide-dubbellagen en kapselt recombinante AAV's die het gen van belang dragen in het lumen. Deze nanovesikel biedt een verbeterde vector voor in vivo genlevering.

Samenvatting

Mesenchymale stamcellen (MSC)-afgeleide extracellulaire blaasjes (EV's) bieden grote veelbelovende mogelijkheden voor therapeutische toepassingen en regeneratieve geneeskunde. EV's zijn nanoschaalblaasjes die door alle bekende celtypen worden uitgescheiden en diverse ladingen dragen, waaronder membraanverankerde eiwitten, oplosbare factoren, meerdere RNA-soorten en metabolieten die de fysiologie en het gedrag van ontvangende cellen reguleren. Hoewel MSC-afgeleide of gemodificeerde EV's therapeutische eiwitten en RNA's kunnen leveren, blijft EV-gemedieerde DNA-levering een uitdaging vanwege het gebrek aan efficiënte mechanismen voor het sorteren van DNA-sequenties in blaasjes. Eerder werk van onze groep en anderen toonde aan dat adeno-geassocieerde virussen (AAV)-bevattende EV's gerichte nucleaire levering en duurzame genexpressie in vitro en in vivo mogelijk maken. Hun productie en isolatie zijn echter beperkt door lage opbrengst en tijdrovende procedures. Hier rapporteren we de ontwikkeling van MSC-membraanomhulde nanovesikels die worden gegenereerd door een grootte-gedefinieerde extrusiemethode voor efficiënte genlevering. Deze blaasjes, ongeveer 200 nm in diameter, bootsen de eigenschappen van natuurlijke EV's na terwijl ze recombinante AAV-vectoren met therapeutische gensequenties inkapselen. In vergelijking met conventionele AAV's verbeterden de gemodificeerde MSC-vesikels de genafgifte-efficiëntie en behaalden ze aanzienlijk hogere opbrengsten met minder tijd en kosten ten opzichte van natuurlijk afgescheiden EV-AAV's. Samenvattend presenteren we een nieuw MSC-gebaseerd membraan nanovesikelplatform dat de voordelen van EV-nabootsende structuren combineert met AAV-gemedieerde gentransfer. Deze aanpak verbetert de efficiëntie van levering en de schaalbaarheid van de productie, en biedt een veelbelovende strategie om gentherapie richting klinische translatie te bevorderen.

Inleiding

Gentherapie vertegenwoordigt een transformerende benadering voor de behandeling van genetische en verworven ziekten door specifieke genen in te brengen, te vervangen of te neutraliseren om de normale cellulaire functie te herstellen. In de afgelopen twee decennia hebben vooruitgangen in vectorengineering en toedieningsstrategieën het therapeutische landschap van gentherapie aanzienlijk uitgebreid. Onder de verschillende ontwikkelde vectorsystemen is adeno-geassocieerd virus (AAV) uitgegroeid tot een van de meest succesvolle en breed gebruikte platforms dankzij het gunstige veiligheidsprofiel, efficiënte transductie en langdurige genexpressie in zowel delende als niet-delende cellen ^1,2. Tot nu toe hebben meerdere AAV-gebaseerde therapieën goedkeuring gekregen voor klinisch gebruik, waaronder behandelingen voor spinale spieratrofie, retinale dystrofieën en hemofilie, wat belangrijke mijlpalen in de translationele geneeskunde^{markeert 3}. Het brede tropisme en de lage immunogeniciteit van AAV-vectoren hebben ook hun toepassing op diverse weefsels mogelijk gemaakt, waaronder de lever, spieren, het centrale zenuwstelsel en het^oog. Als gevolg daarvan is AAV uitgegroeid tot een toonaangevend platform voor in vivo genlevering, waarbij lopende preklinische en klinische studies worden ondersteund gericht op metabole, neurologische en cardiovasculaire aandoeningen.

Ondanks het opmerkelijke klinische succes staat AAV-gebaseerde gentherapie voor verschillende intrinsieke uitdagingen die de bredere toepassing blijven beperken. Een belangrijke beperking ligt in de beperkte genoomverpakkingscapaciteit van het AAV-capsid (~4,7 kb), wat het gebruik voor het afleveren van grote of meerdere therapeutische genen^{beperkt 5,6}. Daarnaast worden de biodistributie en cellulaire tropisme van AAV-vectoren grotendeels bepaald door hun serotypen, die elk een eigen affiniteit vertonen voor specifieke weefsels. Hoewel uitgebreide capside-engineering en peptide-presentatiestrategieën zijn toegepast om de efficiëntie van weefseltargeting en transductie te verbeteren, blijft het bereiken van precieze en voorspelbare tropisme in diverse biologische contexten een belangrijke drempel⁷. Een andere cruciale beperking is de prevalentie van reeds bestaande neutraliserende antilichamen (NAbs) tegen natuurlijke AAV-serotypen in de menselijke populatie. Zelfs lage titers van NAbs kunnen de efficiëntie van vectortransductie aanzienlijk verminderen, waardoor de geschiktheid van patiënten beperkt wordt en herhaalde dosering^wordt bemoeilijkt^. Verschillende strategieën, zoals rationele capside-herontwerp, immunosuppressieve regimes en tijdelijke plasma-uitwisseling, zijn onderzocht om antilichaam-gemedieerde neutralisatie^{te verminderen, maar} deze benaderingen bieden slechts gedeeltelijke of tijdelijke verlichting. Gezamenlijk verminderen deze beperkingen de algehele therapeutische effectiviteit en reproduceerbaarheid van AAV-gemedieerde genlevering in klinische omgevingen.

In de afgelopen jaren is extracellulaire vesikelomhulde AAV (EV-AAV) onderzocht als een alternatieve vector met het potentieel om verschillende belangrijke beperkingen van conventionele AAV's^{12, 13, 14, 15} te overwinnen. Tijdens het verpakken van vectoren kan een deel van de AAV-deeltjes via vesiculaire transportroutes worden afgescheiden en worden opgesloten in extracellulaire blaasjes. Men denkt dat dit proces AAV-gecodeerd membraan-geassocieerd accessoire eiwit (MAAP) omvat, dat het virale uitscheid faciliteert en membraanassociatie bevordert^16,17. De resulterende EV-AAV-deeltjes vertonen een verbeterde transductie-efficiëntie en verbeterde weerstand tegen neutraliserende antilichamen ten opzichte van conventionele AAV, voornamelijk dankzij het vesiculaire membraan dat de cellulaire opname bevordert en gedeeltelijke afscherming biedt tegen antistofherkenning¹⁸. Ondanks deze voordelen blijft de productie van EV-AAV inefficiënt. Typisch wordt slechts een klein deel van de vectorgenomen (ongeveer 0,5%-12%) in het kweekmedium afgescheiden als EV-geassocieerde AAV's, terwijl de meerderheid intracellulair blijft of bestaat als vrije AAV's^12,13. Daarom is grootschalige productie nodig om voldoende vectoropbrengst te verkrijgen. Bovendien is EV-AAV-generatie voornamelijk aangetoond met behulp van HEK293T producerende cellen, waarvan EV's mogelijk snelle leverclearance, korte circulatiehalveringstijd en mogelijke bioveiligheidszorgen kunnen vertonen. Deze beperkingen benadrukken de noodzaak van een efficiëntere en aanpasbaardere membraanomhullingsstrategie, wat de ontwikkeling van het celmembraanomhulde AAV (CME-AAV) platform in deze studie motiveert.

Mesenchymale stamcellen (MSC's) en hun EV's zijn uitgebreid bestudeerd vanwege hun regeneratieve potentieel en immuunontwijkende eigenschappen. Naast therapieën gebaseerd op cellen of natuurlijk gesecreteerde EV's, hebben recente studies een alternatieve benadering aangetoond voor verbeterde geneesmiddelafgifte met nanodeeltjes gecafleerd met MSC-membranen 19,20,21. De MSC-membraancoating geeft actieve targetingcapaciteit, vermindert de immuunzuivering en verlengt de circulatietijd, waarvan de effecten waarschijnlijk worden toegeschreven aan de intrinsieke moleculaire samenstelling van MSC-afgeleide membranen^22,23. Voortbouwend op dit concept gebruikten we MSC-afgeleid membraanmateriaal om een celmembraanomhulde AAV (CME-AAV) nanovesikel te construeren voor genlevering. Om dit te bereiken werden gezuiverde MSC-membraanfragmenten gemengd met recombinante AAV-deeltjes en onderworpen aan een gecontroleerd extrusieproces, een techniek die oorspronkelijk was vastgesteld voor liposoomfabricage^24,25. Door grootte-gedefinieerde extrusie assembleren de membraancomponenten spontaan tot nanoschaalblaasjes die AAV-deeltjes omsluiten. De resulterende CME-AAV's werden verder gezuiverd van vrije, niet-ingekapselde AAV's met behulp van dichtheidsgradiëntgebaseerde centrifugatie. Deze strategie maakt efficiënte en reproduceerbare voorbereiding van membraanomhulde AAV-vectoren mogelijk, die een duidelijk verbeterde transductie-efficiëntie vertonen ten opzichte van conventionele AAV's en vergelijkbare resistentie behouden tegen neutraliserende antilichamen als EV-AAV's. Door verschillende transgenen te vervangen, biedt het CME-AAV-platform een breed potentieel voor de behandeling van diverse genetische en verworven ziekten.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en gebruik van de Beijing Normal University in Zhuhai, China. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding en vorming van CME-AAV via poriëngrootte-gedefinieerde extrusie

1. Productie van recombinante AAV-vectoren
   OPMERKING: Het AAV-productieprotocol volgt eerder gepubliceerde en veelgebruikte procedures. Gedetailleerde optimalisatiestappen en variaties zijn beschreven in eerdere studies^12,26.
   1. Kweek HEK293T cellen in een volledig groeimedium en houd ze op 70%-80% confluentie op de dag van transfectie.
   2. Bereid drie plasmiden voor die coderen: (i) de AAV-overdrachtsvector met het transgen van interesse, (ii) de AAV-rep/cap-genen die overeenkomen met het gewenste serotype, en (iii) adenovirale hulpfuncties.
   3. Co-transfect HEK293T cellen met de drie plasmiden met behulp van een gevestigde transfectiemethode (bijv. calciumfosfaat- of polymeergebaseerde transfectie), volgens de standaard laboratoriumpraktijk.
   4. Incubeer getransfecteerde cellen gedurende 48-72 uur om AAV-assemblage en accumulatie mogelijk te maken.
   5. Verzamel cellen en kweekmedium, en geef AAV-deeltjes vrij via herhaalde vries-dooicycli of een vergelijkbare cellysemethode.
   6. Centrifugeer het lysaat op lage snelheid om celresten te verwijderen en het supernatant met AAV-deeltjes op te vangen.
   7. Zuiver AAV-deeltjes met behulp van dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie of een andere gevestigde zuiveringsmethode.
   8. Ruil gezuiverde AAV-vectoren uit in steriele fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) en bewaar aliquots bij −80 °C tot gebruik.
2. Bereiding van de MSC-membraanfractie
   OPMERKING: Menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn geïsoleerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen. De cellen werden gekweekt en uitgebreid onder vastgestelde omstandigheden of laboratoriumgemodificeerde protocollen. MSC-identiteit kan worden bevestigd door de expressie van fenotypische markers zoals CD73, CD90 en CD105 te beoordelen met behulp van flowcytometrie. De multipotentie van MSC's wordt bevestigd door hun vermogen om in vitro te differentiëren tot osteoblasten, chondrocyten en adipocyten. Cellen zijn klaar voor verzameling wanneer ze 70%-90% confluentie bereiken. De volgende procedures hoeven niet noodzakelijkerwijs onder steriele omstandigheden te worden uitgevoerd.
   1. Verwijder het kweekmedium en verwijder MSC's van de kweekschotel met een celschraper.
   2. Verzamel losgekoppelde cellen in een conische buis met PBS en centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleten.
   3. Was de cellen twee keer met PBS, centrifugeer telkens op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   4. Susstend de eindcelpellet opnieuw in PBS, aangevuld met een proteaseremmer-cocktail.
   5. Onderwerp de celsuspensie aan drie cycli van vries-dooi om het plasmamembraan te verstoren en een ruwe cellysaat te genereren.
   6. Pipette het lysaat grondig om te homogeniseren, en centrifugeer vervolgens op 1.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C om cellulair afval te verwijderen.
   7. Breng het supernatant over in een nieuwe buis en centrifugeer bij 18.000 × g gedurende 1 uur bij 4 °C om de membraanfractie te pelleten.
   8. Gooi het supernatant weg en suspendeer het resulterende membraanpelletje opnieuw in PBS. Deze suspensie vertegenwoordigt de ruwe MSC-membraanfractie en zal worden gebruikt voor AAV-inkapseling.
   9. Homogeniseer de membraansuspension door deze achtereenvolgens door spuiten te laten lopen die zijn uitgerust met naalden van 20 G tot 27 G.
   10. Bepaal de eiwitconcentratie van de gehomogeniseerde membraansuspension met behulp van een BCA-assay. Aliquot en bewaar de suspensie bij −80 °C, of ga direct door met de volgende stappen. Homogeniseer de membraansuspension opnieuw met een 27 G-spuit na elke dooicyclus.
3. Vorming van CME-AAV via extrusie
   1. Meng de voorbereide membraansuspension met AAV's in een gedefinieerde verhouding van 150 μg membraaneiwit per 1 × 10^{genoomkopieën} (g.c.) AAV. Incubeer het mengsel op 37 °C gedurende 30 minuten met voorzichtig schudden.
   2. Laad het membraan-AAV-mengsel op een mini-extruder uitgerust met een 400 nm polycarbonaat (PC) membraan. Laat het monster 20 keer door de extruder gaan om membraan-AAV-inkapseling te bevorderen.
   3. Vervang het 400 nm PC-membraan door een 200 nm membraan en herhaal het extrusieproces 20 keer om de heterogeniteit van de blaasgrootte verder te verminderen.
   4. Verzamel het bewerkte mengsel. Als een grotere hoeveelheid nodig is, voeg dan meerdere extrusiebatches samen. De resulterende suspensie bevat CME-AAV's, samen met niet-ingekapselde AAV's en lege membraanblaasjes. Ga onmiddellijk naar CME-AAV-zuivering.

2. Zuivering van CME-AAV door dichtheidsgradiëntcentrifugatie

OPMERKING: Deze stap beschrijft de scheiding van pure CME-AAV van niet-ingekapselde AAV's, eiwitaggregaten en restnucleïnezuren met behulp van iodixanol-gebaseerde dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. De gezuiverde CME-AAV die uit deze stap wordt verkregen, is geschikt voor zowel in vitro - als in vivo-studies . Alle ingrepen worden aanbevolen onder een steriele weefselkweekkap uit te voeren.

1. Bereiding van de jodixanolgradiënt
   1. Bereid oplossingen van 40% en 25% jodixanol voor door de voorraadoplossing te verdunnen met 10× PBS en steriel gedeioniseerd water om een uiteindelijke concentratie in 1× PBS te bereiken.
   2. In een 13,2 mL open-top dunnewandige ultraheldere buis wordt zorgvuldig een discontinu dichtheidsgradiënt vastgesteld door 1 mL 40% jodixanol en 3 mL 25% jodixanol van onderen te leggen.
   3. Leg voorzichtig 7 mL van de CME-AAV-houdende ophanging uit stap 1.14 over de bovenkant van het hellingsverhaal. Balanceer de buizen en laad ze in een schandbare emmer ultracentrifugerotor.
2. Ultracentrifugatie en verzameling van CME-AAV-fracties
   1. Centrifugeer de gradiënt op 150.000 × g gedurende 3 uur bij 4 °C met snelle acceleratie en langzame vertraging (respectievelijk niveau 9 en niveau 1).
   2. Verwijder voorzichtig de buizen van de rotor zonder de gradiënt te verstoren. Verzamel 1 mL fracties van boven naar beneden in gelabelde 1,5 mL microcentrifugebuizen (F1-F11). Houd alle fracties op ijs.
   3. Identificeer en combineer de fracties F7 en F8, die de gezuiverde CME-AAV's bevatten, in een nieuwe open-top ultracentrifugebuis. Voeg PBS toe aan een totaalvolume van 11 mL en meng voorzichtig met een pipet van 1 mL.
3. Wassen en terugvinden van CME-AAV
   1. Centrifugeer de samengevoegde fracties opnieuw op 150.000 × g gedurende 3 uur bij 4 °C met snelle versnelling en snelle vertraging (niveau 9 voor beide instellingen).
   2. Verwijder het supernatant zorgvuldig en suspendeer de CME-AAV-pellet opnieuw in 50-200 μL steriele PBS, afhankelijk van de gewenste concentratie.
   3. Aliquot indien nodig en bewaren bij −80 °C tot verder gebruik.

3. Karakterisering van CME-AAV met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

OPMERKING: Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gebruikt om de morfologie, grootte en membraanstructuur van CME-AAV-deeltjes te visualiseren. De procedure volgt een standaard negatief kleuringsprotocol vergelijkbaar met dat van extracellulaire blaasjes. Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.

1. Monstervoorbereiding en fixatie
   1. Verdun de gezuiverde CME-AAV-suspensie verkregen uit stap 2 tot een concentratie van ongeveer 1 × 10^9-1 × 10¹⁰ deeltjes/mL in PBS.
   2. Fixeer het monster door een gelijke hoeveelheid vers bereide 4% paraformaldehyde toe te voegen (eindconcentratie 2%) en 30 minuten te laten incuberen bij kamertemperatuur.
   3. Plaats een Formvar/koolstofgecoate koperen grid (200-mesh) op een vel paraffinefolie, met de koolstofzijde omhoog.
   4. Pipet 10 μL van de vaste CME-AAV-ophanging op het rooster en laat adsorptie van 30 minuten bij kamertemperatuur toe. Vermijd drogen tijdens de adsorptie.
   5. Verwijder voorzichtig overtollig vocht van de rand van het rooster met filterpapier zonder het midden aan te raken.
2. Wassen en na-fixatie
   1. Laat het rooster met de sample side naar beneden op een 50 μL druppel PBS drijven gedurende 2 minuten om te wassen. Herhaal het twee keer.
   2. Breng het rooster over op een 50 μL druppel van 1% glutaraldehyde gedurende 5 minuten om de membraanstructuur te stabiliseren.
   3. Was het rooster vijf keer achter elkaar met druppels gedeïoniseerd water (30 seconden elk) om bufferzouten te verwijderen. Dep voorzichtig na het laatste wasbeurt.
3. Negatief kleuring
   1. Plaats het rooster 1 minuut op een 50 μL druppel van 2% waterig uranylacetat om negatieve kleuring te bereiken.
   2. Verwijder overtollige beits door voorzichtig de rand van het rooster met filterpapier aan te raken en laat het volledig aan de lucht drogen op kamertemperatuur.
4. Beeldvorming
   1. Onderzoek de gekleurde roosters met een transmissie-elektronenmicroscoop die op 200 kV werkt.
   2. Maak representatieve beelden met vergrotingen tussen 30.000 ×en 120.000× om de morfologie en membraanintegriteit van CME-AAV te beoordelen.
   3. Optional kun je deeltjesdiameters meten met behulp van TEM-beeldanalysesoftware om de consistentie van de blaasgrootte met NTA-resultaten te bevestigen.
      OPMERKING: Monsterconcentratie - Pas de CME-AAV-concentratie aan om een matige deeltjesdichtheid te verkrijgen; Te geconcentreerde monsters leiden tot deeltjesoverlap, terwijl te verdunde monsters weinig detecteerbare blaasjes opleveren. Artefacten vermijden - Onvolledig wassen kan zoutkristallen achterlaten die de beeldvorming van deeltjes belemmeren. Zorg ervoor dat roosters tijdens het kleuren gehydrateerd blijven om membraaninstorting te voorkomen. Alternatieve kleurstoffen - Fosfhotungstisch zuur (PTA, 1%-2 %, pH 7,0) kan worden gebruikt als alternatief voor uranylacetaat indien beperkingen op radioactieve behandeling gelden. Opslag - Voorbereide roosters kunnen enkele dagen worden bewaard in een stofvrije container bij kamertemperatuur vóór beeldvorming, hoewel directe observatie wordt aanbevolen voor het beste contrast.

4. Kwantificering van CME-AAV met behulp van qPCR

OPMERKING: Deze stap beschrijft een qPCR-gebaseerde methode voor het kwantificeren van CME-AAV-genoomkopieën (g.c./μL). Het protocol legt de nadruk op CME-AAV-specifieke steekproefvoorbereiding en datarapportage. Alle andere aspecten van qPCR-installatie en -cyclus moeten de standaard laboratoriumpraktijk en de instructies van de fabrikant voor de geselecteerde qPCR-kit volgen.

1. Monster en standaardvoorbereiding
   1. Ontdooi aliquots van gezuiverde CME-AAV op ijs en meng zachtjes door pipetten. Vermijd vortexen.
   2. Bereid de AAV-standaardverdunningen voor van 1 × 10⁶ tot 1 × 10³ g.c./μL door sequentiële 10-voudige verdunningen met nucleasevrij gedeïoniseerd water of TE-buffer. Bereid standaardproducten vers of aliquot voor en bewaar bij −20 °C voor kortdurend gebruik.
   3. Bereid de volgende controles voor: een no-template control (NTC; water), een negatieve control (PBS of blanco matrix) en een positieve control (AAV-monster met bekende concentratie), indien beschikbaar.
   4. Bereid qPCR mastermix op ijs volgens de instructies van de fabrikant voor de gekozen chemie (kleurstof- of probe-basis).
2. qPCR-cyclus en data-analyse
   1. Voer de qPCR uit met de cyclingparameters aanbevolen door de fabrikant van de qPCR-mastermix.
   2. Genereer een standaardkromme door C_t (y-as) te plotten versus log₁₀ (standaardconcentratie in g.c./μL) (x-as). Pas een lineaire regressie aan om helling (m) en y-intercept (b) te verkrijgen.
   3. Bereken de CME-AAV-genoomconcentratie voor elke replicatie met behulp van de regressievergelijking:
      of
      
      waarbij C genoomkopieën per μL zijn.
   4. Gemiddelde technische replica's en rapporteren de uiteindelijke CME-AAV-concentratie als g.c./μL.
      OPMERKING: Omdat warmtedenaturatie tijdens qPCR-bereiding zowel het omhullende membraan als de AAV-capsiden verstoort, is geen aparte DNA-extractie nodig. Voer geen DNase-behandeling uit op monsters vóór hitte-lysis; DNase kan toegang krijgen tot en afbreken van AAV-genomen zodra capsiden/membranen zijn verstoord, maar voordat het monster temperaturen bereikt die DNase inactiveren. Standaarden moeten waar mogelijk worden afgestemd: bereid een standaardcurve op van een goed gekarakteriseerde AAV-standaard. Als je monsters of standaarden verschillen in genoomconfiguratie (enkelstrengs AAV versus zelfcomplementaire/dubbelstrengs AAV), pas dan de gerapporteerde waarden dienovereenkomstig aan. Primer/probe-ontwerp: primers kunnen elke geconserveerde AAV-sequentie targeten; als voorbeeld worden primers die zich richten op de CMV-promotor (stroomopwaarts van het transgen) vaak gebruikt.

5. Kwantificering van CME-AAV-deeltjesprofielen

1. Gebruik Nanoparticle tracking analysis (NTA), afstembare resistieve pulsdetectie (TRPS) of vergelijkbare deeltjesanalysetechnieken om de grootteverdeling en deeltjesconcentratie van CME-AAV-preparaten te bepalen.
2. Ontdooi CME-AAV-monsters op ijs en homogeniseer voorzichtig door pipetten vóór analyse. Voer metingen uit volgens de standaard laboratoriumpraktijk en de instructies van de fabrikant voor het geselecteerde instrument, zoals beschreven in eerder gepubliceerde protocollen 12,27,28,29.

6. In vitro analyse van CME-AAV-gemedieerde genoverdracht

OPMERKING: Deze stap beschrijft de procedure om CME-AAV-gemedieerde genlevering en transgenexpressie in gekweekte cellen te evalueren. De test wordt aangetoond met behulp van HEK293T cellen en CME-AAV9. EGFP, maar kan worden aangepast aan andere celtypen of rapportageconstructies. Conventionele (niet-membraanomhulde) AAV9. EGFP dient als positieve controle, terwijl PBS of lege AAV-deeltjes als negatieve regelaars worden gebruikt.

1. Celvoorbereiding
   1. Kweek HEK293T cellen onder standaardomstandigheden (DMEM met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine) bij 37 °C in 5% CO₂.
   2. Zaad cellen in platen met 48 of 96 putjes om ongeveer 70% confluentie te bereiken op het moment van transductie (meestal 24 uur na het zaaien). Pas de zaaidichtheid aan op basis van de putgrootte (bijv. ~5 × 10⁴ cellen/put voor 48-put plaat of ~1 × 10⁴ cellen/put voor 96-put plaat).
   3. Laat cellen zich 24 uur hechten en in evenwicht brengen voordat je vectoren toevoegt.
2. Vectorapplicatie
   1. Maak CME-AAV9 klaar. EGFP en AAV9. EGFP werkoplossingen in steriele PBS. Typische virale dosis: 5 × 10⁸ g.c. per 48-put (aanpassen op basis van promotorsterkte, doelgen en experimentele doelstellingen).
   2. Voeg voor elke put gelijke genoomkopieën (g.c.) van CME-AAV9 toe. EGFP of AAV9. EGFP direct naar het cultuurmedium.
   3. Neem negatieve controleputten op met een gelijkwaardig volume PBS of lege AAV-deeltjes.
   4. Draai de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verdeling te garanderen en keer hem terug naar de broedmachine.
   5. Blijf incuberen gedurende 24-72 uur, afhankelijk van promotoractiviteit en transgenexpressiekinetiek. Voor CMV-gedreven EGFP in HEK293T cellen wordt sterke fluorescentie typisch binnen 48 uur waargenomen.
3. Beeldvorming en live-cel analyse
   1. Wanneer je klaar bent voor beeldvorming, aspireer voorzichtig het kweekmedium en spoel je cellen twee keer met PBS om losstaande deeltjes te verwijderen. Vermijd het losmaken van cellen.
   2. Kleurcelkernen met Hoechst 33342 (levende-cel compatibel) volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik geen DAPI voor levende cellen.
   3. Voer live-cel fluorescentiebeeldvorming uit met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop uitgerust met geschikte filters (bijv. excitatie 488 nm/emissie 513 nm voor EGFP; excitatie 350 nm/emissie 460 nm voor Hoechst).
   4. Gebruik 10× of 20× objectieven voor kwantificering van transductie-efficiëntie en 63× doel voor hoogresolutie subcellulaire lokalisatie indien nodig.
   5. Verzamel minstens vijf gezichtsvelden per put (bijvoorbeeld vier hoeken en één centrum) met identieke beeldparameters (belichtingstijd, versterking, diafragma, enz.).
   6. Bewaar alle afbeeldingen in raw- en grijswaardenformaten voor kwantitatieve analyse.
4. Kwantitatieve beeldanalyse
   1. Open afbeeldingen in ImageJ (FIJI) of vergelijkbare software.
   2. Meet de gemiddelde fluorescentieintensiteit voor zowel het EGFP- als het Hoechst-kanaal voor elk veld.
   3. Bepaal de achtergrondintensiteit door een gebied zonder fluorescerend signaal te selecteren en pixelwaarden te middelen.
   4. Bereken gecorrigeerde intensiteit voor elk kanaal:
      Ik_{heb gecorrigeerd} = Ik_bedoel - I_achtergrond
   5. Bereken genormaliseerde intensiteit voor elk veld als:
      
   6. Gemiddelde genormaliseerde intensiteiten van ten minste vijf velden per put, en rapporteren het gemiddelde ± SD over drie onafhankelijke biologische replicata.
      OPMERKING: CME-AAV vertoont doorgaans een verhoogde fluorescentieintensiteit ten opzichte van conventionele AAV wanneer gelijke genoomkopieën worden toegepast, wat een verbeterde cellulaire opname en/of bescherming tegen neutraliserende antilichamen weerspiegelt. De optimale transductie-efficiëntie hangt af van de kwaliteit van de CME-AAV-voorbereiding, celtype, promotorsterkte en virale titer. Als er zwakke signalen worden waargenomen, verhoog dan de kopieerinput van het genoom, bevestig de integriteit van de vector met qPCR en controleer de kalibratie van de microscoop. Andere fluorescerende reporters (bijv. mCherry, mNeonGreen, tdTomato) of luciferase-constructies kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de experimentele behoeften. Bij het werken met primaire of niet-hechtende cellen kun je de zaai- en beeldvormingsomstandigheden dienovereenkomstig aanpassen (bijvoorbeeld platen coaten met poly-L-lysine of gebruik maken van kamerglaasjes).

7. Evaluatie van CME-AAV - gemedieerde genlevering in een muismodel

OPMERKING: Deze stap beschrijft de evaluatie van CME-AAV-gemedieerde genlevering in vivo met behulp van een muismodel.

1. Dierlijke bereiding
   1. Gebruik wild-type muizen zoals C57BL/6. Zorg ervoor dat alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en gebruik en uitgevoerd worden in overeenstemming met de relevante regelgeving.
   2. Selecteer muizen van 4-6 weken oud voor optimale consistentie tussen experimenten.
   3. Houd dieren onder standaard huisvestingsomstandigheden met ad libitum toegang tot voedsel en water vóór injectie.
2. Vectorvoorbereiding en -toediening
   1. Kies een AAV-serotype op basis van het doel van het onderzoek en het doelweefsel. In deze studie worden AAV9 en CME-AAV9 gebruikt.
   2. Bereid virale vectoren voor die een luciferase-reportergen coderen (bijv. CME-AAV9.luciferase) voor niet-invasieve beeldvorming.
   3. Verdun de virale vectoren in steriele zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1 × 10¹° genoomkopieën (g.c.) per 50 μL per muis.
   4. Verwarm de staart voorzichtig met een verwarmingskussen of warm water om de ader te verwijden vóór de injectie.
   5. Laad 50 μL virale suspensie in een 31-G insulinespuit en injecteer langzaam in de laterale staartver om lekkage en aderruptuur te minimaliseren.
   6. Na de injectie brengt u de muizen terug in hun kooien en houdt u ze in de gaten totdat ze volledig hersteld zijn.
3. In vivo bioluminescentiebeeldvorming
   1. Twee weken na toediening doof je de muizen met isoflurane (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen) en injecteer je D-luciferine (150 μg/g lichaamsgewicht; Sigma) intraperitoneaal in PBS.
   2. Plaats de verdoofde muizen in een bioluminescentie-beeldvormingssysteem.
   3. Maak elke 2 minuten na de injectie luminescentiebeelden totdat het signaal een plateau bereikt.
   4. Kwantificeer bioluminescentie met de juiste software. Definieer interessegebieden (ROI's) rond luminescente gebieden en bereken de totale fotonenflux (fotonen/s) voor elk dier.
   5. Neem AAV9.luc-behandelde en PBS-geïnjecteerde groepen respectievelijk als positieve en negatieve controles op ter vergelijking.
4. Ex vivo beeldvorming
   OPMERKING: Deze stap is optioneel.
   1. Direct na de in vivo beeldvorming euthanasen de muizen en verzamel je belangrijke organen (lever, hart, milt, nier en hersenen).
   2. Beeld de geïsoleerde organen af onder identieke beeldvormingsparameters met hetzelfde IVIS-systeem om weefselspecifieke luciferase-expressie te bepalen.
      OPMERKING: Alternatieve toedieningsroutes (bijv. intramusculaire, intracerebrale of intraperitoneale injectie) kunnen worden gekozen afhankelijk van de experimentele doelen. De intensiteit van de bioluminescentie weerspiegelt zowel de efficiëntie van genlevering als de biodistributie van het weefsel. CME-AAV-gemedieerde luciferase-expressie vertoont doorgaans een vroegere start en een verhoogde piekexpressie vergeleken met vrije AAV dankzij membraan-gemedieerde endocytose door opnamecellen. Zorg voor consistente luciferinedosering, timing en beeldvormingsinstellingen voor een nauwkeurige vergelijking. De beschreven virale dosis (1 × 10¹° g.c. per muis) geeft doorgaans een detecteerbaar signaal 2-4 weken na injectie, maar optimalisatie kan nodig zijn voor verschillende vectoren of diermodellen.

Resultaten

MSC's die in deze studie werden gebruikt, werden geïsoleerd uit het menselijke navelstrengweefsel volgens protocollen in overeenstemming met relevante ethische richtlijnen. MSC-membraanfracties werden bereid volgens het beschreven protocol. AAV9. EGFP werd intern geproduceerd met behulp van een transient dual-plasmid transfectiesysteem in HEK293T cellen, zoals eerder gerapporteerd^12,26. Voor CME-AAV-fabricage, membraanvoorbereidi...

Discussie

Kritieke stappen van het CME-AAV-protocol

Dit protocol beschrijft een methode voor het genereren van MSC-membraanomhulde AAV's, en verschillende stappen zijn cruciaal voor een succesvolle vorming van CME-AAV. Ten eerste is zorgvuldige voorbewerking van het celmembraan essentieel. Het doel van deze stap is het verkrijgen van membraanfragmenten die geschikt zijn voor extrusie, terwijl besmetting door nucleair DNA, cytosolische eiwitten en subcel...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bioluminescentie beeldvormingssysteem	PerkinElmer	IVIS Spectrum optisch beeldvormingssysteem (Lumina III)
D-Luciferine kaliumzout	Yeasen Biotechnology	40902ES03
Fetaal bovien serum	Yeasen Biotechnology	40130ES76
Fluorescentiemicroscoop	Zeiss	Axio Observer 7
Formvar/koolstof-gecoat koperrooster 200 mesh	Millipore-Sigma	TEM-FCF400CU
Glutaraldehyde	Millipore-Sigma	354400
HBSS	Gibco	C14175500BT
Hieff Unicon qPCR TaqMan Probe Master Mix	Yeasen Biotechnology	11205ES08
High-glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium	Hyclone	SH30243
Hogesnelheidscentrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-E
Hoechst 33342	Beyotime	C1022
NTA-instrument	Malvern Panalytical	NanoSight NS300
Open-top dunne wand ultra-heldere buis voor ultracentrifuge	Beckman Coulter	344059
OptiPrep iodixanol	Millipore-Sigma	D1556
Paraformaldehyde 4%	Beyotime	P0099
PBS	Biosharp	BL302A
Penicilline-streptomycine	Millipore-Sigma	V900929
qPCR-instrument	Applied Biosystems	QS6 real-time PCR-systeem
Rotor voor hogesnelheidscentrifuge	Beckman Coulter	JA-25.50
SW 41 Ti Swing-bucket rotor voor ultracentrifuge	Beckman Coulter	331362
Transmissie-elektronenmicroscoop	JEOL	JEM-2100F
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima XE-100
Uranylacetaat	Electron Microscopy Sciences	NC1375332
Whatman Nuclepore polycarbonaatmembraanfilters (200 nm)	Cytiva	10417004
Whatman Nuclepore polycarbonaatmembraanfilters (400 nm)	Cytiva	10417104