Causaal verband tussen ischemische beroerte en vasculaire dementie: een Mendeliaanse randomisatiestudie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een reproduceerbare workflow voor Mendeliaanse randomisatie met twee steekproeven om de potentiële causale associatie tussen ischemische beroerte en vasculaire dementie te evalueren met behulp van publiek beschikbare samenvattende statistieken van genoombrede associatiestudies.

Samenvatting

Ischemische stroke (IS) is een belangrijke oorzaak van invaliditeit en mortaliteit wereldwijd, en vasculaire dementie (VaD) is een veelvoorkomend dementie-subtype dat geassocieerd wordt met cerebrovasculair letsel. Observationele studies hebben een relatie gesuggereerd tussen IS en VaD, maar deze studies zijn gevoelig voor confounding en omgekeerde causaliteit. Dit protocol beschrijft een reproduceerbare two-sample Mendeliaanse randomisatie (MR) workflow voor het evalueren van de potentiële causale associatie tussen IS en VaD met behulp van publiek beschikbare summary statistics van genome-wide association studies (GWAS). Genetische instrumenten geassocieerd met IS werden geëxtraheerd uit een publieke GWAS-dataset, en uitkomstassociaties voor VaD werden verkregen uit een publieke VaD GWAS-dataset. De bijbehorende dataset-ID's worden vermeld in de sectie Protocol. Na uitkomstmatching en allel-harmonisatie werden 51 single-nucleotide polymorfismen (SNP's) behouden voor de uiteindelijke MR-analyse. De workflow omvat selectie van instrumentele variabelen, linkage disequilibrium clumping, allel-harmonisatie, beoordeling van instrumentsterkte, inverse variance weighted (IVW) analyse, weighted median analyse, MR-Egger analyse, heterogeniteitstests, beoordeling van horizontale pleiotropie en leave-one-out sensitiviteitsanalyse. In de representatieve analyse toonde de IVW-methode een positieve associatie aan tussen genetisch voorspelde IS en het risico op VaD, en de weighted median methode leverde een directioneel concordant resultaat op. De MR-Egger schatting was directioneel consistent, maar bereikte geen statistische significantie. Daarom moeten deze bevindingen worden geïnterpreteerd als suggestief bewijs voor een mogelijk causaal effect, in plaats van definitief bewijs van causaliteit. Dit protocol kan onderzoekers helpen bij het toepassen van een transparante en reproduceerbare MR-workflow om uitkomsten gerelateerd aan cerebrovasculaire ziekten te onderzoeken met behulp van publieke GWAS-gegevens.

Inleiding

Ischemische beroerte (IS) is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van ernstige invaliditeit en overlijden¹. Volgens de nieuwste gegevens van de Global Burden of Disease Study is de wereldwijde incidentie van IS gedaald, maar het blijft een aanzienlijke last, vooral in Oost-Europa, Oost-Azië, Centraal-Azië en Sub-Sahara Afrika^2,3. Bovendien stijgt de incidentie van IS in landen met een lage sociaal-demografische index (SDI), en de verwachting is dat dit van 2020 tot 2030 zal blijven toenemen.

Talrijke epidemiologische studies hebben gewezen op een mogelijk verband tussen cerebrovasculaire ziekten en vasculaire dementie (VaD)^4,5. Vooral in China is VaD een van de meest voorkomende vormen van dementie bij ouderen, en de hoge prevalentie van IS is nauw verbonden met het ontstaan van VaD. De meeste bestaande studies zijn echter observationeel, en residuele confounding, omgekeerde causaliteit en verschillen in ziekteyeenmerken kunnen de causale interpretatie beperken. Daarom zijn aanvullende analytische benaderingen nodig om te evalueren of IS mogelijk betrokken is bij de ontwikkeling van VaD.

IS kan het begin van VaD via verschillende mechanismen beïnvloeden. Cerebrovasculaire schade veroorzaakt door IS kan leiden tot onvoldoende cerebrale perfusie en daaropvolgende neurodegeneratieve veranderingen⁶. Daarnaast kan VaD gerelateerd zijn aan chronische cerebrovasculaire letselschade, microvasculaire schade en ontstekingsreacties na IS^7,8. Daarom is het onderzoeken van de relatie tussen IS en VaD belangrijk voor het begrijpen van potentiële ziektekoppelingen en het sturen van toekomstige preventiestrategieën.

Mendeliaanse randomisatie (MR) is een analytische methode die genetische varianten als instrumentele variabelen gebruikt om potentiële causale associaties tussen een blootstelling en een uitkomst te evalueren⁹. In vergelijking met conventionele observationele studies kan MR confounding en bias door reverse causality verminderen, mits voldaan is aan geldige aannames voor de instrumentele variabelen. Vergeleken met gerandomiseerde gecontroleerde studies of experimentele modellen kan MR bestaande samenvattende statistieken uit genome-wide association studies (GWAS) gebruiken om klinisch relevante associaties te evalueren wanneer directe interventiestudies onhaalbaar, onethisch of moeilijk uit te voeren zijn. Recente genetische studies met gebruik van Mendeliaanse randomisatie-benaderingen hebben de associatie tussen IS en VaD onderzocht¹⁰. Gedetailleerde beschrijvingen op protocolniveau van de selectie van blootstellingsinstrumenten, extractie van uitkomstgegevens, harmonisatie van allelen, beoordeling van de sterkte van de instrumenten, heterogeniteitstesten, beoordeling van pleiotropie en sensitiviteitsanalyses blijven echter essentieel voor een reproduceerbare implementatie.

Dit protocol is geschikt wanneer openbare GWAS-samenvattingsstatistieken beschikbaar zijn voor zowel de blootstelling als de uitkomst van belang, wanneer valide genetische instrumenten voor de blootstelling kunnen worden geselecteerd en wanneer de onderzoeksvraag erop is gericht om een potentieel causaal verband te evalueren in plaats van direct biologische mechanismen vast te stellen. Deze studie presenteert daarom een twee-steekproefen MR-protocol voor het evalueren van het potentiële causale verband tussen IS en VaD met behulp van openbare GWAS-samenvattingsstatistieken. Het doel is om een reproduceerbare analytische workflow te bieden in plaats van definitieve biologische mechanismen vast te stellen. Dit protocol beschrijft de selectie van genetische instrumenten, de matching van uitkomsten, allel-harmonisatie, MR-schatting en sensitiviteitsanalyses, waarbij de IS-VaD-associatie als representatief voorbeeld wordt gebruikt.

Protocol

Voor deze studie werden publiekelijk beschikbare GWAS-samenvattende statistieken gebruikt. De oorspronkelijke studies hadden goedkeuring van de institutionele toetsingscommissie en geïnformeerde toestemming van de deelnemers verkregen. Geen aanvullende ethische goedkeuring was vereist voor deze secundaire analyse.

1. Studieontwerp en ethische verklaring

1. Gebruik een twee-steekproefen MR-ontwerp om de potentiële causale associatie tussen IS en VaD te evalueren.
2. Gebruik uitsluitend openbaar beschikbare GWAS-samenvattende statistieken. Omdat alle oorspronkelijke studies in de GWAS-datasets goedkeuring hadden gekregen van de institutionele toetsingscommissie en geïnformeerde toestemming hadden verkregen van de deelnemers, is er geen aanvullende ethische goedkeuring vereist voor deze secundaire analyse.
3. Definieer IS als de blootstelling en VaD als de uitkomst vóór de data-extractie.

2. Softwarevoorbereiding

1. Voer alle analyses uit met de statistische software R.
2. Laad het TwoSampleMR-pakket voor de extractie van instrumenten, extractie van uitkomstgegevens, harmonisatie van allelen, MR-schatting, heterogeniteitstests en sensitiviteitsanalyses. Laad het MRPRESSO-pakket om globale horizontale pleiotropie en potentiële uitschieter-varianten te beoordelen.
3. Gebruik de volgende kernfuncties in de workflow: extract_instruments, extract_outcome_data, harmonise_data, mr, generate_odds_ratios, mr_heterogeneity, mr_pleiotropy_test, mr_singlesnp, mr_leaveoneout, mr_scatter_plot, mr_forest_plot, mr_funnel_plot en mr_leaveoneout_plot. Gebruik MRPRESSO::mr_presso om de MR-PRESSO globale test en, indien van toepassing, de uitschieter- en distortietests uit te voeren.

3. Selectie van de dataset voor blootstelling en screening van instrumentele variabelen

1. Extraheer met IS geassocieerde enkelnucleotidepolymorfismen (SNP's) uit de IEU OpenGWAS-dataset ebi-a-GCST90018864. Deze dataset bevat 11.929 IS-gevallen en 472.192 controles, met een totale steekproefomvang van 484.121 deelnemers.
2. Selecteer kandidaat-SNP's die geassocieerd zijn met IS met een significantiedrempel van p < 5 × 10^-6.
   1. De p < 5 × 10^-6 In dit representatieve protocol wordt deze drempelwaarde gebruikt om een adequaat aantal onafhankelijke instrumenten te behouden voor sensitiviteitsanalyses. Omdat deze drempelwaarde minder streng is dan de conventionele drempelwaarde voor genoombrede significantie, moeten bevindingen op basis van deze instrumenten worden geïnterpreteerd als exploratief en suggestief in plaats van definitief.
3. Voer linkage disequilibrium clumping uit om onafhankelijke SNP's te behouden. Gebruik een r² drempelwaarde van 0,001 en een clumping window van 10.000 kb.
4. Gebruik het volgende R-commando om kandidaat-instrumenten te extraheren:
   extraheer_instrumenten(uitkomsten = "ebi-a-GCST90018864", p1 = 5e-06, clump = TRUE)
5. Bereken de F-statistiek voor elke behouden SNP met behulp van de formule F = (β/SE)², waar β en SE zijn respectievelijk de schatting van het SNP-blootstellingseffect en de standaardfout.
6. Sluit SNP's uit met een F-statistiek < 10 om het risico op zwakke instrumentbias te verminderen. Vat de distributie van de F-statistieken samen met behulp van het minimum, maximum, mediaan en het interkwartielbereik (IQR).

4. Extractie van de uitkomstdataset

1. Extraheer associaties van VaD-uitkomsten uit de FinnGen GWAS-dataset finn-b-F5_VASCDEM. Deze dataset bevat 881 VaD-gevallen en 211.508 controles.
2. Extraheer de uitkomstassociaties voor alle geselecteerde IS-geassocieerde SNP's met behulp van de functie extract_outcome_data.
3. Zoek naar proxy-SNP's wanneer doel-SNP's niet direct beschikbaar zijn in de uitkomstdataset. Behoud proxy-gematchte varianten wanneer geldige proxy-informatie en allelcorrespondentie beschikbaar zijn.
4. Gebruik het volgende R-commando om de uitkomstdataset te extraheren:
   extract_outcome_data(snps = exp_dat$SNP, outcomes = "finn-b-F5_VASCDEM", access_token = NULL)

5. Allelharmonisatie en SNP-retentie

1. Harmoniseer de datasets van de blootstelling en de uitkomst voorafgaand aan de MR-analyse.
2. Lijn het effect-allel en het andere allel uit, zodat de schattingen van het effect van SNP–blootstelling en SNP–uitkomst betrekking hebben op hetzelfde effect-allel.
3. Inspecteer de SNP's tijdens de harmonisatie om allel-mismatches, ontbrekende associaties met de uitkomst en ambigue allel-uitlijningen te identificeren. Behoud de SNP's met beschikbare effect-schattingen voor zowel blootstelling als uitkomst na de harmonisatie.
4. Gebruik het volgende R-commando voor de allel-harmonisatie: harmonise_data(exposure_dat = exp_dat, outcome_dat = out_dat, action = 1)
5. Noteer het aantal SNP's dat aanvankelijk uit de blootstellingsdataset is geëxtraheerd, het aantal SNP's met beschikbare associaties met de uitkomst, het aantal proxy-gematchte varianten en het aantal SNP's dat is behouden voor de uiteindelijke MR-analyse.

6. Primaire MR-analyse en sensitiviteitsanalyses

1. Voer de primaire MR-analyse uit met de inverse variance weighted (IVW)-methode.
2. Voer aanvullende MR-analyses uit met de weighted median- en MR-Egger-methoden om de consistentie van de causale schatting onder verschillende aannames te beoordelen.
3. Genereer odds ratios (OR's) en 95% betrouwbaarheidsintervallen (BI's) op basis van de MR-schattingen.
4. Gebruik de volgende R-commando's om de MR-analyse uit te voeren en de OR's te berekenen:
   res <- mr(dat)
   res <- generate_odds_ratios(res)
5. Omdat er één vooraf gespecificeerde primaire associatie tussen blootstelling en uitkomst wordt geëvalueerd, wordt de Bonferroni-gecorrigeerde drempelwaarde voor de primaire MR-inferentie vastgesteld op 0,05/1 = 0,05. Gebruik een tweezijdige p-waarde < 0,05 als drempelwaarde voor statistische significantie voor de primaire IVW-analyse.
6. Om de statistische precisie van de primaire analyse te contextualiseren, gezien het beperkte aantal VaD-gevallen, wordt een post hoc tweezijdige Wald-test power-berekening uitgevoerd op basis van de waargenomen IVW-schatting en de bijbehorende standaardfout. Bereken de power met behulp van de non-centraliteitsparameter βIVW/SEIVW bij een tweezijdig α-niveau van 0,05. Bereken het minimaal detecteerbare effect dat overeenkomt met een power van 80% als exp[(z0.975 + z0.80) × SE]. Omdat IS een binaire blootstelling is en SNP-blootstellingsassociaties op de log-odds-schaal worden uitgedrukt, wordt deze analyse gerapporteerd als een effect-geconditioneerde beschrijvende beoordeling van de precisie in plaats van als een vooraf gespecificeerde steekproefomvangberekening¹¹.

7. Heterogeniteit, horizontale pleiotropie en leave-one-out analyses

1. Beoordeel de heterogeniteit tussen SNP's met behulp van de Q-statistiek van Cochran.
2. Gebruik het volgende R-commando om de heterogeniteitsstatistieken te berekenen:
   mr_heterogeneity(dat)
3. Beoordeel directionele horizontale pleiotropie met behulp van de MR-Egger-interceptietest.
4. Gebruik het volgende R-commando om de MR-Egger-interceptie te berekenen:
   mr_pleiotropy_test(dat)
5. Beoordeel globale horizontale pleiotropie en potentiële outlier-varianten met MR-PRESSO met 10.000 simulaties, een significantiedrempel van 0,05 en waarbij zowel de outlier- als de distortietests zijn ingeschakeld¹².
6. Gebruik het volgende R-commando voor de MR-PRESSO-analyse:
   set.seed(20260729)
   mr_presso(
   BetaOutcome = "beta.outcome",
   BetaExposure = "beta.exposure",
   SdOutcome = "se.outcome",
   SdExposure = "se.exposure",
   OUTLIERtest = TRUE,
   DISTORTIONtest = TRUE,
   data = dat,
   NbDistribution = 10000,
   SignifThreshold = 0.05
   )
7. Voer een single-SNP-analyse uit om het effect van elke SNP afzonderlijk te schatten.
8. Gebruik het volgende R-commando voor de single-SNP-analyse:
   res_single <- mr_singlesnp(dat)
9. Voer een leave-one-out-analyse uit door sequentieel één SNP per keer te verwijderen en de IVW-analyse te herhalen.
10. Gebruik het volgende R-commando voor de leave-one-out-analyse:
    res_loo <- mr_leaveoneout(dat)

8. Visualisatie en output

1. Genereer een scatterplot om de MR-schattingen voor verschillende methoden weer te geven.
2. Genereer een forest plot om de single-SNP-schattingen en de totale MR-schatting weer te geven.
3. Genereer een funnel plot om de symmetrie van de SNP-specifieke schattingen visueel te beoordelen.
4. Genereer een leave-one-out-plot om te beoordelen of de totale schatting wordt bepaald door een enkele SNP.
5. Gebruik de volgende R-commando's om de plots te genereren:
   mr_scatter_plot(res, dat)
   mr_forest_plot(res_single)
   mr_funnel_plot(res_single)
   mr_leaveoneout_plot(res_loo)
6. Exporteer de MR-resultaten, de tabel met instrumentele variabelen, de tabel met associaties van de uitkomstmaat en de resultaten van de sensitiviteitsanalyse voor rapportage en reproduceerbaarheid.

Resultaten

Figuur 1 vat de algemene workflow van het Mendeliaanse randomisatieprotocol met twee steekproeven samen, van datasetselectie en instrumentscreening tot sensitiviteitsanalyses en visualisatie van de resultaten. Representatieve outputs van elke fase worden hieronder gepresenteerd.

Genetische instrumentele variabelen en kwaliteitscontrole van de harmonisatie

In totaal werden 52 IS-geassocieerde SNP's initi...

Discussie

Deze studie presenteert een twee-steekproeven MR-protocol voor het evalueren van de potentiële causale associatie tussen IS en VaD met behulp van publiek beschikbare GWAS-samenvattingsstatistieken. In de representatieve analyse ondersteunden de IVW- en gewogen mediaanmethoden een positieve associatie tussen genetisch voorspelde IS en het risico op VaD, terwijl de MR-Egger-schatting directioneel consistent was maar geen statistische significantie bereikte. Daarom leveren deze bevindingen suggestieve bewijzen voor een moge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
FinnGen GWAS-dataset	FinnGen	finn-b-F5_VASCDEM	Publieke GWAS-dataset gebruikt als uitkomstbron voor vasculaire dementie
IEU OpenGWAS-database	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	ebi-a-GCST90018864	Publieke GWAS-dataset gebruikt als blootstellingsbron voor ischemisch infarct
R-software	R Foundation for Statistical Computing	Niet van toepassing	Statistische software gebruikt voor MR-analyse
RStudio	Posit Software, PBC	Niet van toepassing	Geïntegreerde ontwikkelomgeving gebruikt voor het uitvoeren van R-scripts
TwoSampleMR-pakket	MRC Integrative Epidemiology Unit, University of Bristol	Niet van toepassing	R-pakket gebruikt voor instrumentextractie, harmonisatie, MR-analyse en sensitiviteitsanalyses
MRPRESSO-pakket	CRAN	Versie 1.0	R-pakket gebruikt om globale horizontale pleiotropie en potentiële uitschieter-instrumenten te beoordelen
writexl-pakket	CRAN	Niet van toepassing	R-pakket gebruikt om resultaatentabellen te exporteren als xlsx-bestanden