Methodenartikel

Een chirurgische methode om een muismodel van knieartrose vast te stellen met een aangepaste Hulth-procedure

148 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70379

⸱

15 mei 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Spine Institute, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of theory and therapy of muscles and bones, Ministry of Education (Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), 4School of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de verfijnde chirurgische stappen van het aangepaste Hulth-model en biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare methode voor het induceren van experimentele artrose.

Samenvatting

Knieartrose (KOA) is een chronische degeneratieve gewrichtsaandoening die wordt gekenmerkt door degeneratie van gewrichtskraakbeen, subchondrale botremodellering, osteofytenvorming en synovitis, wat de meest voorkomende vorm van artrose is.

Dit protocol presenteert een chirurgische methode om een muismodel van knieartrose vast te stellen met behulp van een aangepaste Hulth-procedure. In vergelijking met injectie-geïnduceerde of conventionele chirurgische modellen zoals destabilisatie van de mediale meniscus (DMM) en de doorsnijding van het voorste kruisband (ACLT), veroorzaakt het aangepaste Hulth-model een vroeger begin van de ziekte en ernstigere artritis. Door het doorsnijden van het mediale collaterale ligament, de mediale meniscus en het voorste kruisband, verstoort deze methode de mechanische uitlijning van het kniegewricht, waardoor de progressie van OA wordt bevorderd. Dit model is bijzonder geschikt voor het bestuderen van acute OA-pathologie en het evalueren van potentiële therapeutische interventies. Om de ernst van artritis te beoordelen, gebruikten we echografie van kleine dieren gecombineerd met driedimensionale (3D) reconstructie van de gewrichtsholte om het volume te kwantificeren en de ophoping van synoviaal vocht te beoordelen. Daarnaast werd safranine-O/snelle groene kleuring van histologische secties uitgevoerd voor de Osteoarthritis Research Society International (OARSI) scoring om kraakbeenvernietiging te evalueren.

Inleiding

Knieartrose (OA) is een veelvoorkomende, chronische, degeneratieve gewrichtsaandoening die klinisch wordt gekenmerkt door pijn, stijfheid, beperkte bewegingsvrijheid en spierzwakte rond de knie. De prevalentie ervan is hoger bij vrouwen dan bij mannen. Als OA onvoldoende onder controle is, kan het leiden tot progressief verlies van fysieke capaciteit, slaapstoornissen, chronische vermoeidheid en uiteindelijk een handicap. Naarmate de wereldbevolking ouder wordt, blijft het incident van knieartrose stijgen, wat een aanzienlijke uitdaging vormt voor gezondheidszorgsystemen en economieënwereldwijd 1,2.

Pathofysiologisch gezien vormt kraakbeenverlies het centrale kenmerk van OA, gepaard met structurele en functionele stoornissen van het gehele gewricht en het peri-articulaire weefsel. Om ziektemechanismen te verduidelijken en therapeutische interventies te evalueren, zijn er verschillende diermodellen ontwikkeld die belangrijke aspecten van humane artrose herhalen. Onder deze worden chirurgisch geïnduceerde modellen het vaakst toegepast. Zoals destabilisatie van de mediale meniscus (DMM)3 en een doorsnijding van het voorste kruisband (ACLT)4, verstoort de normale gewrichtsstructuur, wat leidt tot kraakbeendegeneratie en OA-achtige veranderingen. Chemische modellen vertrouwen daarentegen op intra-articulaire injectie van middelen die de extracellulaire matrix afbreken (bijv. collagenase of mononatriumiodoacetaat), wat leidt tot snelle chondrocytdood en kraakbeenerosie 5,6. Waar injectiemodellen doorgaans binnen enkele weken de eindpuntpathologie bereiken, vereisen chirurgische modellen doorgaans een langere tijdsduur.

Onder de beschikbare chirurgische technieken selecteerden en verfijnden we het Hulth-model vanwege de versnelde ontstaan van OA7. Door doorsnijding van de voorste kruisbanden en achterste kruisbanden te combineren met resectie van mediale collaterale ligamenten en totale mediale meniscectomie, induceert dit model betrouwbaar ernstige, snel progressieve kraakbeenschade en subchondrale botveranderingen. De korte periode tot structureel gewrichtsfalen maakt het aangepaste Hulth-model bijzonder geschikt voor acute of subacute OA-studies, en wij stellen voor dat ons geoptimaliseerde protocol een praktisch, reproduceerbaar platform biedt voor toekomstige preklinische onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Mannelijke C57BL/6 muizen van 6-8 weken oud en met een gewicht van ongeveer 20 g werden gekocht bij commerciële leveranciers (zie Materiaaltabel) (ethisch goedkeuringsnummer: PZSHUTCM2312210005).

1. Preoperatieve zorg

  1. Laat muizen minstens 1 week voor de operatie acclimatiseren.
  2. Steriliseer alle chirurgische instrumenten vóór de operatie en desinfecteer de operatieruimte.
  3. Zet de gasanesthesiemachine aan en plaats de muis 5 minuten in een inductiekamer met 2-3% isoflurane om de algehele narcose te starten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de zuurstofstroom tussen 0,5 NL/min en 1 NL/min wordt gehandhaafd.
  4. Na verdoving breng je de muis over naar het operatieplatform en houd je de anesthesie vast met 1-1,5% isofluraan via een anesthesiemasker tot de operatie is afgerond (1-1,5% isofluran).
  5. Plaats de muis in een rugligging met de kniegewrichten naar boven gericht, zodat stabiliteit en goede toegang tot de operatieplaats worden gegarandeerd.
  6. Controleer de diepte van de anesthesie door te controleren op het ontbreken van reflexen, en breng vervolgens ontharingscrème aan om het haar rond het kniegewricht volledig te verwijderen.
  7. Verwijder de resterende crème voorzichtig met gaas of wattenstaafjes, en desinfecteer de blootgestelde huid eerst met 75% ethanol, gevolgd door jodiumtinctuur om aseptische omstandigheden te waarborgen.

2. Chirurgische ingreep (Figuur 1)

  1. Strek het achterbeen van de muis uit en breng grip uit om de huid strakker te maken. Maak een lengtesnede van 0,5-1 cm langs de mediale kant van het rechterkniegewricht met een steriel chirurgisch mesje.
    OPMERKING: Alle hieronder beschreven chirurgische ingrepen zijn uitgevoerd onder een chirurgische microscoop.
  2. Trek de huid terug en voer een stomp dissectie uit van de onderliggende fascia om de gewrichtscapsule volledig bloot te leggen, en visualiseer het patellaire ligament.
  3. Prod en inceer de fascia boven het mediale collaterale ligament (MCL) met behulp van een fijne injectienaald.
  4. Transecteer de MCL met microschaar onder vergroting.
  5. Verplaats het patellaire ligament met een naald om de intraarticulaire ruimte bloot te leggen en de mediale meniscus te identificeren.
  6. Snijd het mediale meniscotibialigament (MMTL) door met een microschaar na het knippen en onderzoek het weefsel voorzichtig met een naald om volledige loslating en mobiliteit van de meniscus te bevestigen.
  7. Identificeer en doorsnijd het voorste kruisband (ACL), waarbij je erop let schade aan het achterste kruisband (PCL) of de laterale meniscus te voorkomen. Dit resulteert meestal in een positief teken van de voorste lade postoperatief, wat gewrichtsinstabiliteit bevestigt.
    OPMERKING: Ladetest: Voorafgaand aan het sluiten van de wond werd het dijbeen met één hand gestabiliseerd, terwijl de enkel met de andere hand werd vastgehouden, waarbij het scheenbeen en dijbeen loodrecht bleven. Relatieve anteroposterieure verplaatsing tussen het scheenbeen en het dijbeen werd handmatig toegepast; Waarneembare translationele beweging wees op een positief ladeteken, wat een kruisbandverstoring bevestigt.
  8. Om ernstigere artrose op te wekken, kunt u als alternatief gelijktijdige doorsnijding uitvoeren van zowel het voorste kruisband (ACL) als het achterste kruisband (PCL) gecombineerd met een mediale meniscectomie (MMT) (zoals in het klassieke Hulth-model).
    OPMERKING: Deze stap is optioneel en kan indien nodig worden uitgevoerd; indien geselecteerd, vormt dit de modelleringsbenadering van het klassieke Hulth-model.

3. Postoperatieve zorg

  1. Sluit de incisie met 4-0 nylon hechtingen en desinfecteer de operatieplaats met jodiumtinctuur.
  2. Plaats de muis op een temperatuurgeregeld verwarmingskussen totdat hij weer bij bewustzijn komt en normale ademhaling en motoriek vertoont. Zodra hij volledig hersteld is en geen tekenen van stress vertoont, zet je hem terug in zijn thuiskooi.
  3. Controleer de hechtingsintegriteit continu gedurende 3-5 dagen na de operatie. Als er hechtingsbreuk wordt waargenomen, doof je de muis opnieuw en voer je opnieuw hechtingen uit
  4. Geef intramusculaire antibiotica tot 3 dagen na de operatie om een postoperatieve infectie te voorkomen.
    OPMERKING: Antibioticatoediening wordt gebruikt ter profylaxe tegen postoperatieve infecties. Postoperatieve analgesie wordt bepaald door experimentele doelstellingen; In artroseonderzoek worden analgetica meestal niet tijdens de acute fase gebruikt om verstorende beoordeling van de therapeutische werkzaamheid te voorkomen.
  5. Controleer dagelijks de operatieplaats op tekenen van zwelling, afscheiding of lokale ontsteking.
  6. Laat de muis inslapen bij het eindpunt van de studie, volgens goedgekeurde protocollen, en dissectieer het kniegewricht voor histologische of beeldvormende analyse.
    OPMERKING: In deze stap hebben we het protocol aangenomen om de proefdieren te euthanaseren door middel van een overdosis anesthesie. Dit werd bereikt door intraperitoneale injectie van pentobarbitale natriumoplossing in een dosering van >100 mg/kg bij muizen.

4. Evaluatie van OA-ontwikkeling

  1. Voor euthanasie wordt de zwelling van het gewricht beoordeeld en wordt er een echo uitgevoerd om structurele veranderingen in het kniegewricht te evalueren. Evalueer de motorische prestaties van de muis door de rotarod-test uit te voeren.
    OPMERKING: Isoflurane-anesthesie is vereist voor een echoscopisch onderzoek bij muizen.
  2. Na euthanasie dissecteert u het kniegewricht en verwijdert u voorzichtig de omliggende spier en fascia, terwijl het scheenbeen, kuitbeen en dijbeen behouden blijven.
    Herstel de gewrichten en decalcificeer ze in een oplossing van 10% ethyleendiamíntetraazijnzuur (EDTA) gedurende minstens 30 dagen, waarbij je de oplossing twee keer per week vervangt om volledige ontkalking te garanderen.
  3. Inbed de gedecalcificeerde kniegewrichten in paraffine en bereid sagittale doorsneden voor op een dikte van 4 μm8.
  4. Begin met het verzamelen van secties zodra de meniscus duidelijk zichtbaar is. Kleur de secties met safranine O en snel groen om kraakbeen en subchondrale botmorfologie te visualiseren. Evalueer de kraakbeenafbraak met behulp van het OARSI 9-scoresysteem.
  5. Safranin O-Fast Green kleuringsprocedure (Commerciële kit gebruikt, zie Materiaaltabel)
    1. Deparaffinisatie en rehydratatie
      1. Deparaffiniseer secties in xyleen gedurende 3 minuten, herhaal dit 3 keer.
      2. Rehydrateer via een gegradueerde ethanolserie (100%, 90%, 80%) om rest-xyleen te verwijderen, elk 2 minuten.
        OPMERKING: Ethanolseries moeten in aflopende volgorde van concentratie worden gebruikt.
      3. Spoel 1 minuut af in gedestilleerd water en laat het kort uitlekken.
    2. Weigerts ijzerhematoxyline-kleuring
      1. Breng Weigert's werkoplossing aan op secties, beits 5 minuten.
      2. Spoel 1 minuut af in gedestilleerd water en laat het kort uitlekken.
    3. Zuurdifferentiatie
      1. Breng de zuurdifferentiërende oplossing 15 seconden aan op secties.
      2. Was 10 minuten in water en laat overtollig water aflopen.
        OPMERKING: Differentiatietijd is cruciaal – langdurige differentiatie voorkomt snelle groene kleuring, terwijl onvoldoende differentiatie leidt tot diepe, snelle groene kleuring met een slechte safranineopname
    4. Snelle groene kleuring
      1. Breng een snelle groene oplossing aan op secties gedurende 5 minuten, laat kort afglippen.
      2. Breng een zwakke zuuroplossing aan om de resterende snelle groene vlek 15 seconden te verwijderen en laat kort aflekken.
    5. Safranin O kleuring
      1. Breng safranine O-oplossing 4,5 minuten aan op secties.
      2. Snel secties overbrengen naar 90% ethanol om overtollige safranine O, 2-3 s, te verwijderen.
        OPMERKING: Deze stap kan passend worden verlengd afhankelijk van de intensiteit van de safraninekleuring.
    6. Uitdroging en opruimen
      1. Dehydrateer secties in 100% ethanol gedurende 1 minuut.
      2. Maak secties in xyleen schoon voor volledige uitdroging, 2 minuten, herhaal 3 keer.
        OPMERKING: Het xyleen dat in deze stap wordt gebruikt, mag niet worden gemengd met dat in Sectie 4.5.1; Kruisbesmetting kan de kwaliteit van de sectie aantasten.
    7. Montage met Neutral Balsam
      1. Plaats secties in een dampkap zodat overtollig xyleen kan verdampen.
      2. Verwijder secties, breng een geschikte hoeveelheid neutrale balsem aan op het monster en bedek zorgvuldig met een dekmantel.
      3. Onderzoek secties onder een lichtmicroscoop op luchtbellen en verwijder zorgvuldig aanwezige aanwezigen.
      4. Bewaar secties in een slidebox en plaats ze 24 uur in een oven van 60 °C om een volledige uitharding van de neutrale balsem te garanderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Longitudinale scans van het kniegewricht werden uitgevoerd met een micro-ultrasoon8-systeem met een scanstap van 4 mm en een axiale resolutie van 0,04 mm. Op postoperatieve dag 7 toonde 3D-reconstructie een duidelijke toename van het gewrichtsholtevolume in de modelgroep vergeleken met de schijngroep (Figuur 2A,B). Rotarod-vermoeidheidstests10,11 bevestigden d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vergelijking met andere chirurgische modelleringsmethoden, zoals de destabilisatie van de mediale meniscus (DMM) en de modellen van de voorste kruisbanddoorsnijding (ACLT), induceert het aangepaste Hulth-model artrose door gecombineerde ligamenteuze en meniscale beschadiging. De specifieke structurele verstoring bepaalt veranderingen in de gewrichtsbiomechanica over verschillende vlakken. ACLT4 ondermijnt de rotatiestabiliteit (interne en externe rotatie) en vermi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gefinancierd door het Science and Technology Innovation Action Plan in Shanghai (23YF1447900 aan CJM), het Chenguang Program van de Shanghai Education Development Foundation en de Shanghai Municipal Education Commission (23CGA53 aan CJM), en de National Natural Science Foundation of China (U24A6013 tot XH).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL injectiespuit//Specificaties: 30 G × 0.13 mm
3D Ultrasound Vevo 3100 beeldvormingssysteemOpticVevo 2100Een hoogfrequent ultrasoon beeldvormingssysteem geïntegreerd met Vevo LAB-software voor gegevensanalyse.
4-0 nylon hechtdraad//
75% ethanolShanghai Titan Scientific Co., Ltd.G73537O
C57BL/6J mannelijke muizen (6-8 weken oud)Shanghai Jiesijie Laboratory Animal Co., Ltd./
OntharingscrèmeVeetLot: C021123001
Jodiumtinctuur//
IsofluraanRWD R650-IE
MicrotangRWD F12013-10
MicroschaarRWD S11035-08
Gemodificeerde Safranine O en Fast Green Stain KitSolarbioG1371
NaaldhouderRWD F21001-12
Chirurgische messen (10#)RWD S31010-01
Chirurgische microscoopOlympusSZ61

Referenties

  1. Sharma, L. Osteoarthritis of the Knee. N Engl J Med. 384 (1), 51-59 (2021).
  2. Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 5, 16044(2017).
  3. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  4. Zhou, X., et al. Antioxidant taurine inhibits chondrocyte ferroptosis through upregulation of OGT/Gpx4 signaling in osteoarthritis induced by anterior cruciate ligament transection. J Adv Res. 77, 551-567 (2025).
  5. Jal Janusz, M., et al. Moderation of iodoacetate-induced experimental osteoarthritis in rats by matrix metalloproteinase inhibitors. Osteoarthritis Cartilage. 9 (8), 751-760 (2001).
  6. Meng, X., et al. An impaired healing model of osteochondral defect in papain-induced arthritis. J Orthop Translat. 26, 101-110 (2021).
  7. Rogart, J. N., Barrach, H. J., Chichester, C. O. Articular collagen degradation in the Hulth-Telhag model of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 7 (6), 539-547 (1999).
  8. Xu, H., et al. Utilization of longitudinal ultrasound to quantify joint soft-tissue changes in a mouse model of posttraumatic osteoarthritis. Bone Res. 5, 17012(2017).
  9. Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 (Suppl 3), S17-S23 (2010).
  10. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the Cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. Int J Mol Sci. 23 (19), 11342(2022).
  11. Piel, M. J., Kroin, J. S., van Wijnen, A. J., Kc, R., Im, H. J. Pain assessment in animal models of osteoarthritis. Gene. 537 (2), 184-188 (2014).
  12. Obeidat, A. M., et al. A standardized approach to evaluation and reporting of synovial histopathology in two surgically induced murine models of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (10), 1273-1282 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gewrichtsdegeneratiekraakbeestdestructietransectie van de mediale meniscusvoorste kruisbandechografie bij kleine dierensynoviaal vochtSafranine O kleuring
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen