Onderzoeksartikel
Een robuuste en reproduceerbare methode om 2D-primaire culturen van met zona glomerulosa- en zona-fasciculata-verrijkte cellen te vestigen werd ontwikkeld voor de bijnierschors van de muis. Dit systeem behoudt belangrijke moleculaire en functionele kenmerken van elke zone, waardoor gericht onderzoek mogelijk is naar signaalroutes, hormoonproductie en bijniercorticale celgedrag ex vivo.
De bijnier van de muis is omgeven door een mesenchymale cellaag (capsule) en bevat een onderliggende cortex die is georganiseerd in duidelijke concentrische zones met gespecialiseerde endocriene functies: de zona glomerulosa (zG), die aldosteron produceert, en de zona fasciculata (zF), die corticosteron produceert. De bijniermerg, gelegen in het midden van de klier, produceert catecholaminen. Mechanistische studies van cellen uit elke adrenocorticale zone zijn beperkt door het ontbreken van in vitro modellen die hun zone-specifieke moleculaire, cellulaire en functionele kenmerken behouden. Om deze beperking te overwinnen, werd een fractioneringsmethode ontwikkeld met microdissectie van volwassen bijnieren van muizen. Deze methode scheidt bijniercellen van mannelijke muizen in een zG-verrijkte buitenfractie (OF), met capsule- en zG-cellen, en een zF-verrijkte binnenfractie (IF), die zF- en medullaire cellen bevat. Deze fracties werden gebruikt om tweedimensionale (2D) primaire culturen te genereren die verrijkt waren voor ofwel zG- of zF-cellen. Genexpressie-analyse bevestigde dat de zG-verrijkte culturen hoge niveaus van zG-markers (Cyp11b2, Dab2 en Shh) tot expressie brengen, samen met verhoogde Wnt/β-catenine-routemarkers (Wnt4, Lef1). Daarentegen vertoonden zF-verrijkte culturen een hogere expressie van zF-markers (Cyp11b1 en Akr1b7) en lagere niveaus van Wnt/β-catenine-routemarkers, wat consistent is met een zF-transcriptiesignatur. Expressie van sterosteroogene markers (Nr5a1, Star) bevestigde de bijrenocorticale oorsprong van beide celfracties. Tyrosinehydroxylase wijst op de aanwezigheid van bijniermergcellen in zF-verrijkte culturen. Functioneel produceerden zG-verrijkte culturen aldosteron onder basale omstandigheden en vertoonden ze een verhoogde productie als reactie op angiotensine II, kalium en adrenocorticotroop hormoon (ACTH). Omgekeerd produceerden zF-verrijkte culturen corticosteron bij de beginlijn en vertoonden ze een verhoogde output als reactie op ACTH-stimulatie. Al met al vertegenwoordigt dit protocol een robuust, reproduceerbaar en biologisch relevant in vitro-model voor het bestuderen van de bijniercortexbiologie. Dit systeem maakt zone-specifiek onderzoek mogelijk van signaalpaden, moleculaire mechanismen en fysiologische reacties.
Een dunne mesenchymale capsule omsluit de bijnier van de muis, die bestaat uit twee hoofdcompartimenten: de buitenste cortex en de binnenste medulla. De bijnierschors van de volwassen mannelijke muis is verder onderverdeeld in verschillende zones, de zona glomerulosa (zG) en de zona fasciculata (zF), elk met unieke morfologische en functionele kenmerken 1,2,3,4. De primaire functie van de bijnierschors is de productie van steroïdhormonen, waaronder mineralocorticoïden (aldosteron) en glucocorticoïden (corticosteron bij muizen)5. De zG is het buitenste en meest compacte gebied en bestaat uit ovale cellen die georganiseerd zijn in rozetstructuren die aldosteronsynthase (CYP11B2) tot expressie brengen, waardoor aldosteron 2,3,5,6,7 kan worden geproduceerd. De secretie van aldosteron wordt voornamelijk gereguleerd door het renin-angiotensine-aldosteronsysteem (RAAS), kalium en in mindere mate door ACTH 5,8. De zF bestaat uit grotere cellen die in radiale strengen/fascikels zijn gerangschikt, vormt het grootste deel (~85%) van de cortex en wordt voornamelijk gereguleerd door ACTH 2,3,5,9. Meerdere signaalroutes coördineren de ontwikkeling, het onderhoud en de functie van bijnieren door de dynamica, zonering en sterosterogene activiteit van de voorlopercellen te reguleren. Onder deze factoren is SF-1 (Steroidogenic Factor-1, Nr5a1) een hoofdregulator die essentieel is voor adrenocorticale specificatie, proliferatie en hormoonproductie10. Sonische egel (Shh) signalering, actief in de zG, bevordert de expansie van voorlopercellen en ondersteunt corticale vernieuwing in het zG 11,12,13.
Wnt-signalering, met name via de canonieke β-catenine-route, is cruciaal voor bijnierzonatie en corticale integriteit. Bij de muis worden de normale bijniergrootte en zonering gereguleerd door een gradiënt van WNT-signaalactiviteit die zich uitstrekt van de capsule tot de zF. Deze gradiënt wordt ondersteund door gelokaliseerde expressie van WNT-liganden en potentiatoren, voornamelijk WNT4 in de zG, en WNT2B en R-spondinen (RSPO1 en/of RSPO3) in de capsule 7,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . De bijnierschors wordt in stand gehouden door de centripetale stroom van cellen van proliferatieve voorlopercellen in het subcapsulaire/buitenste zG-gebied, wat leidt tot gedifferentieerde zG-cellen die naar binnen migreren richting de zF. Wanneer cellen overgaan van de zG naar de zF, ondergaan ze veranderingen in genexpressie en functie, bekend als transdifferentiatie. Dit model is sterk ondersteund door afstammingstraceerstudies met behulp van de ASCre/+ transgene muislijn, die specifiek aldosteronproducerende cellen in de zG 23,24,25 target.
Verschillende in vitro benaderingen zijn gebruikt om bijnierbiologie te bestuderen op basis van de dissociatie van de gehele bijnier 26,27,28. Zo beschreef een studie dissociatie van de bijniercortex voor elektrofysiologische en patch-clamp analyses27, en een andere studie gebruikte gedissocieerde bijniercorticale cellen om signaalmechanismen te onderzoeken die verband houden met bijnierfysiologie en bloeddrukregulatie26. Hoewel deze methodologieën belangrijke functionele inzichten hebben opgeleverd, zijn ze afhankelijk van cellen uit hele bijnierpreparaten in plaats van op de scheiding van corticale zones vóór celkweek.
Gezien de complexiteit en histologische diversiteit van de bijnier is het begrijpen van de verschillende rollen van haar cellulaire compartimenten essentieel om de mechanismen achter de bijnierfunctie te verduidelijken. In deze studie werden primaire adrenocorticale muiskweken vastgesteld, verrijkt voor ofwel zG- of zF-cellen. Een groot voordeel van deze methode is de generatie van zG-verrijkte celculturen, waardoor experimentele modulatie van signaalroutes en omgevingsfactoren mogelijk is om de specifieke rol in de biologie van de bijnierschors beter te onderzoeken. Dit omvat de studie van het behoud van voorlopercellen, de mechanismen achter zonale plasticiteit en transdifferentiatie richting de zF, en het modelleren van de samenstelling van extracellulaire matrix. Parallel genereert deze methode sterk verrijkte zF-celculturen, wat een complementair platform biedt voor zone-specifieke functionele en signaalstudies. Samen vormen deze kenmerken een robuust, experimenteel gecontroleerd systeem om het begrip van bijnierbiologie te vergroten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door het Boston Children's Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) onder goedkeuringsnummer 00002611. Een volledige lijst van alle materialen die in dit protocol worden gebruikt, inclusief reagentia, verbruiksartikelen en apparatuur, wordt verstrekt in de Materiaaltabel, samen met de bijbehorende fabrikanten en catalogusnummers om reproduceerbaarheid te waarborgen.
Primaire culturen van muisbijniercellen zona glomerulosa en zona fasciculata-cellen
De methoden die in deze studie werden gebruikt om primaire culturen van volwassen mannelijke muis wildtype (Mus musculus, C57BL/6) adrenocorticale cellen vast te zetten, zijn aangepast van een procedure die oorspronkelijk was ontwikkeld voor Sprague-Dawley ratten28. Om de segregatie en identiteit van zona glomerulosa- en zona fasciculata-celpopulaties te bevestigen, werd een lijntraceermodel gebruikt met Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+ (ook bekend als Cre) muizen 1,2,3,4 en Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J (ook bekend als ROSAmT/mG) muizen29.
Voorbereiding vóór de procedure
Materialen
Twee sets tangen en schaar voor oppervlakkige incisies en een andere set voor incisie van de buikholte (Aanvullende Figuur 1A). Het kweekmedium en PBS (37 °C) verwarmden. Ik heb 2 gerechten (P60) bereid met DMEM/F-12. Bereidde 3 gerechten (P60) met verwarmde PBS om de klieren achter elkaar te wassen (bad 1, 2 en 3) (Aanvullende Figuren 1B, 1–3), en 1 gerecht om de bijnier in oplossing te houden (Aanvullende Figuren 1B, 4). Bereid 2 schalen (P60) met steriel filterpapier op het oppervlak (aanvullende figuren 1C, 1–2). Bereidde 2 P60-gerechten met 500 μL verteringsoplossing en labelde deze voor de glomerulosa (zG) of de fasciculata (zF) (aanvullende figuren 1D, zG, zF). Bereidde 2 buizen, labelde zG en zF, en voegde 4,5 ml verteringsoplossing toe.
Oplossingen
Om de verteringsoplossing te maken, werden collagenase type I (eindconcentratie 4 mg/mL) en DNase I (eindconcentratie 0,04 mg/mL) opgelost in 5 mL puur DMEM/F-12 medium. De oplossing werd gefilterd in een 50 mL buis met een spuit en een 0,22 μM filter. De verteringsoplossing moet elke keer vers worden bereid.
Dieren
Om primaire culturen te verkrijgen die zijn verrijkt voor bijniercellen van de muis zona glomerulosa en zona fasciculata, gebruik je 10–15 jonge volwassen mannelijke muizen, ongeveer 6–7 weken oud. Vrouwtjes hebben iets grotere bijnieren dan mannetjes, en beide geslachten kunnen met dit protocol worden gebruikt. In deze studie werden echter alleen mannetjes gebruikt om mogelijke interferentie van de X-zone bij jonge vrouwtjes te vermijden, waardoor een nauwkeurige zone-scheiding werd gegarandeerd. Muizen werden geëuthanaseerd door CO₂-inhalatie volgens de richtlijnen voor de institutionele dierenzorg. De dood werd bevestigd door het ontbreken van ademhaling en het ontbreken van reflexen. De bijnieren werden onmiddellijk gedissectied, binnen 3–5 minuten na bevestiging van overlijden, om de levensvatbaarheid van het weefsel te behouden.
Positie en blootstelling van het achterlijf
De muis werd in een dorsale decubituspositie geplaatst op een steriel vlak oppervlak (Figuur 1A). De vacht van het dier werd gedesinfecteerd met 70% alcohol. Voor de cutane incisies werden een pincet en schaar gebruikt, en de tweede set voor de incisie in de buikholte. Er werd een initiële incisie in het liesgebied van het achterlijf gemaakt, die zich lateraal richting het borststuk aan beide zijden uitstrekte om het buikvlies bloot te leggen (Figuur 1B). De huid werd voorzichtig teruggetrokken, gevolgd door de buikspieren, om de buikholte bloot te leggen (Figuur 1C). De eerste incisie moet oppervlakkig zijn om schade aan de inwendige organen te voorkomen. Ga voorzichtig naar de spierlaag en leg vervolgens de buikholte bloot. Voorkom het scheuren van bloedvaten, want bloedingen kunnen het moeilijk maken om de bijnieren te lokaliseren en de inzameling vertragen. Vervang chirurgische instrumenten om microbiële besmetting te minimaliseren.
Identificatie en verzameling van de linkerbijnier
De linker bijnier bevindt zich mediaal en boven de linkernier in het retroperitoneum, met een ovale vorm en roze kleur, omgeven door wit vetweefsel (Figuren 1D–G). Terwijl je aangrenzende organen voorzichtig verplaatst met een stompe pincet om de visualisatie te verbeteren, gebruik je een schaar om het grootste deel van het vetweefsel te verwijderen met korte, gecontroleerde sneden, waarmee de bijnier wordt geïsoleerd. Vermijd het direct vastgrijpen van de bijnier om schade aan de capsule te voorkomen. De klier werd direct na isolatie in een P60-kweekschotel geplaatst met 10 mL voorverwarmde DMEM/F-12 bij 37 °C (Figuur 1F).
Identificatie en verzameling van de rechterbijnier
De rechterbijnier bevindt zich lateraal en boven de rechternier in het retroperitoneum, met een ovale vorm en roze kleur (Figuur 1E–H). Het identificeren van deze bijnier kan moeilijker zijn vanwege de nabijheid van andere organen, zoals de lever en de opstijgende colon, evenals nabijgelegen bloedvaten. Terwijl je aangrenzende organen voorzichtig verplaatst met een stompe pincet om de visualisatie te verbeteren, gebruik je een schaar om het grootste deel van het vetweefsel te verwijderen met korte, gecontroleerde sneden, waarbij de bijnier geïsoleerd wordt en erop gelet wordt dat de capsule niet beschadigd raakt. De klier werd direct na isolatie geplaatst in een P60-kweekschotel met 10 mL voorverwarmde DMEM/F-12 bij 37 °C. De bijnieren zijn gecombineerd in hetzelfde schotel (Figuur 1F). Tijdens de procedure is het essentieel om de belangrijkste bloedvaten in het gebied zorgvuldig te behandelen om onbedoelde snijwonden te voorkomen, die bloedingen kunnen veroorzaken en het verzamelproces kunnen bemoeilijken. De belangrijkste vaten waar je op moet letten zijn de nieraders en nierslagaders. Bijnier verzameld met wat hechtend vetweefsel. Dit vergemakkelijkt het hanteren van de klier en beschermt tegen beschadiging en besmetting door de capsule (Figuur 1I).
Werk in een steriele laminaire stromingskap
Voordat de klieren naar de laminaire flowkap werden overgebracht, werd de schotel schoongemaakt met 70% alcohol. De bijnieren werden drie keer met PBS gewassen op kamertemperatuur (25 °C) (in schaal 1, 2 en 3 en verzameld in schaal 4) (Aanvullende figuur 1B). Het filterpapier helpt bij vethechting en zorgt voor betere resultaten. Tijdens de voorbereiding van meerdere klieren moeten de gescheiden weefsels in voorverwarmde DMEM worden bewaard om levensvatbaarheid te behouden. De bijnier werd vastgegrepen door het hechtende vetweefsel (Figuren 1I–J), en het vet werd zorgvuldig op het filterpapier ontleed (Aanvullende Figuur 1C, schaal 1), met fijne tangen en gecontroleerde bewegingen om schade aan de capsule te voorkomen. Het verwachte resultaat is een gladde, intacte klier zonder overtollig vet- en bindweefsel, zoals weergegeven in Figuur 1K. De bijnieren werden zorgvuldig overgebracht op vers filterpapier (Aanvullende figuur 1C, schotel 2) om nauwkeurige microdissectie te vergemakkelijken. De capsule werd voorzichtig vastgeknepen met fijne tangen, en met behulp van het scalpelblad werd een radiale incisie in de klier gemaakt zonder het weefsel volledig te doorsnijden.
De binnenste inhoud van de cortex werd voorzichtig blootgelegd door deze via de incisie naar buiten te stoten met lichte mechanische druk met de tang. De capsule en de zG bleven verbonden met de punt van de tang, terwijl het binnenste uitgestoten kliermateriaal overeenkwam met de zF en medulla. Enzymatische vertering moet pas worden gestart nadat alle klieren zijn verwerkt (Figuur 1L), vanwege mechanische scheiding van de buitenste en binnenste zones.
Spijsvertering
Twee buizen werden gelabeld als OF (Outer Fraction: capsule en zG) of IF (Inner Fraction: zF en medulla) (Figuur 1M). In totaal werd 4,5 mL voorverwarmde verteringsoplossing (37 °C) toegevoegd, en de OF en IF werden overgebracht naar de juiste buizen. De monsters werden 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂, en de buizen werden elke 10 minuten voorzichtig gedraaid door ze handmatig 2–3 keer om te zorgen voor uniforme blootstelling aan de enzymoplossing. De tijd die nodig is voor de spijsvertering kan variëren afhankelijk van de kwaliteit, activiteit en opslagomstandigheden van de collagenase. Na 30 minuten werd het weefsel gedissocieerd door 40 keer op en neer te pipetteren met langzame, gecontroleerde slagen, waarbij een 5 mL serologische pipet werd gebruikt om een eencelige slurry te genereren. Na dissociatie van het weefsel zouden idealiter geen zichtbare fragmenten meer moeten overblijven en moet het medium troebel lijken. Als er nog fragmenten aanwezig zijn, kan een extra vertering van 15 minuten worden overwogen.
Wassen en plateren
Na de vertering werden de cellen gewassen door 45 mL DMEM/F-12 toe te voegen om het resterende enzym te verwijderen (Figuur 1 M). Monsters werden gecentrifugeerd op 150 × g gedurende 12 minuten bij kamertemperatuur (25 °C). Na centrifugatie wordt verwacht dat er een kleine en compacte pellet met een licht roze tot lichtgele uitstraling is, terwijl het supernatant helder en vrij van zichtbare deeltjes moet blijven. Het supernatant werd voorzichtig verwijderd en weggegooid, waarbij men erop lette dat het pelletje niet werd verstoord. De pellet werd opnieuw opgehangen in voorverwarmd (37 °C) kweekmedium afhankelijk van het uiteindelijke volume dat nodig was voor het plateren (zie hieronder). Een optimale platingdichtheid van ongeveer 70% werd gehandhaafd om de kweeklevensvatbaarheid en vitaliteit te waarborgen. Het celaantal werd geschat met behulp van een Neubauer-telkamer voorafgaand aan het beplaten, en het aantal gezaaide cellen werd aangepast aan de kweekschaal om de gewenste confluentie te bereiken. Plat de zG-verrijkte buitenste fractie (OF) cellen met een dichtheid van ongeveer één dier per put (meestal ~1,5–2,5 × 104 cellen) en de zF-verrijkte binnenste fractie (IF) cellen met ~0,63 dieren per put (meestal ~2,5–4,0 × 104 cellen) in een plaat met 48 putten.
Behoud van celcultuur
Cellen werden gekweekt in het hierboven beschreven kweekmedium en onder standaardomstandigheden onderhouden in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO₂. Na 24 uur kweek werd het medium vervangen om vuil en eventuele resterende bloedcellen te verwijderen. Deze stap bevordert optimale groei. Het bord werd zorgvuldig aangezogen en er werd vers voorverwarmd medium (37 °C) toegevoegd. Wacht minstens 48 uur voordat je de cellen in functionele experimenten beoordeelt. Het wordt aanbevolen om drie dagen te wachten voordat je functionele experimenten uitvoert, zodat de culturen goed gevestigd zijn. Langdurige kweek na deze periode kan trypsinisatie en doorgang vereisen, wat kan leiden tot celselectie en verlies van primaire kweekkenmerken.
Data-analyse en ondersteunende procedures
Bereiding van primaire bijniercelculturen
Primaire culturen van hele bijnieren werden vastgesteld volgens dezelfde procedures voor weefselverzameling, vertering, wassen en plateren, en werden gebruikt als standaardcontroles voor moleculaire en functionele assays.
Genexpressie-analyse
Om het totale RNA van OF- en IF-cellen te zuiveren, werden de gekweekte cellen gehomogeniseerd in TRIReagent met behulp van de RNA-kit, volgens het protocol van de fabrikant. De integriteit en concentratie van RNA werden geëvalueerd met behulp van spectrometrie. Verdere verwerking van totaal RNA hield reverse transcriptie in cDNA in gebruik van de high-capacity cDNA reverse transcription kit. Genexpressie-analyse werd uitgevoerd met realtime kwantitatieve PCR (qPCR) met behulp van de thermocycler. Technische duplicaten werden gebruikt om variabiliteit te controleren. De TaqMan Universal PCR Master Mix en de muis TaqMan primers werden gebruikt (Tabel 1). Een cyclusdrempel (CT) waarde werd geselecteerd binnen het lineaire versterkingsbereik voor elke steekproef die in duplicaat werd uitgevoerd. Het werd genormaliseerd door endogene controlegenen β-actine en ribosomaal eiwit 18S (Rps18). De relatieve expressieniveaus werden berekend met behulp van de 2–ΔΔCt-methode 30. De gegevens van drie verschillende experimenten worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). We voerden drie onafhankelijke experimenten uit.
Stimulatie van aldosteron- en corticosteronsecretie in primaire ZG- en ZF-culturen
Primaire culturen van zona glomerulosa (ZG) en zona fasciculata (ZF) cellen werden gevestigd en gehandhaafd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂. Ongeveer 5 × 10 4-cellen werden per put geplateerd in een plaat met 48 putjes met een complete groeimedium. Na vier dagen continue kweek weerspiegelden de metingen van de basale secretie de cumulatieve hormoonproductie over deze periode. Voor stimulatietests werd het medium geaspireerd en werden de cellen eenmaal gewassen met fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS) om restfactoren te verwijderen. Vervolgens werd 200 μL vers medium aan elke put toegevoegd, en de volgende assays vertegenwoordigen acute gestimuleerde secretie binnen een bepaald tijdsvenster. Voor aldosteronstimulatie-assays werd het kweekmedium aangevuld met angiotensine II (Ang II, 10 nM), kalium (K+), als kaliumchloride (KCl, 10 mM) en ACTH (10 nM). Natriumchloride (NaCl, 10 mM) werd gebruikt als voertuigcontrole. Voor corticosteronstimulatietests werden dezelfde procedures gevolgd, maar het medium werd aangevuld met ACTH (10 nM), forskoline (10 μM) of NaCl (10 mM) als voertuigcontrole. Na 6 uur incubatie bij 37 °C en 5% CO₂ werden de kweeksupernatanten verzameld en opgeslagen bij −80 °C voor latere hormoonkwantificatie, zoals eerder beschreven31. De overige hechtende cellen werden gelyseerd voor eiwitextractie en hormoonniveaus werden genormaliseerd tot het totale eiwitgehalte van het bijbehorende lysaat.
Eiwitextractie en normalisatie van aldosteron- en corticosteronmetingen
Eiwitextractie werd uitgevoerd met behulp van RIPA-lyse en extractiebuffer, aangevuld met een 1x stop protease-remmercocktail. Cellen werden opnieuw opgehangen door 15 keer op en neer te pipetteren met een P200-pipettip en vervolgens te soniceren met een sonicator. De eiwitconcentratie werd bepaald met de BCA-proteïnetest volgens de instructies van de fabrikant.
Aldosteronmeting door radio-immunoassay (RIA)
De concentratie aldosteron in celkweeksupernatanten werd bepaald door het protocol van de fabrikant te volgen. Kort gezegd werden 50 μL supernatant en 150 μL 1% BSA in PBS, samen met 500 μL van de aldosteronradioactieve tracer, toegevoegd aan aldosteron-antilichaam-gecoate buisjes. Na het mengen werden de buizen 18 uur op kamertemperatuur (25 °C) geïncubeerd. Vervolgens werd het incubatiemengsel gedecanteerd en werd de radioactiviteit in de buizen geteld met een Cobra II auto-gamma-teller31. Aldosteronniveaus werden genormaliseerd tot het totale eiwit, zoals eerder beschreven.
Corticosteronmeting
De concentraties corticosteron in celcultuursupernatanten werden gemeten met een competitieve enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) kit specifiek voor muis- en rattencorticosteron, volgens het protocol van de fabrikant. De corticosteronniveaus werden genormaliseerd tot het totale eiwit, zoals eerder beschreven32.
Immunokleuring
Immunofluorescentie werd uitgevoerd op zowel paraffine-ingebedde bijniersecties als gekweekte cellen gekweekt op voorbehandelde glazen dekmantels die waren gecoat met Poly-L-lysine. Voor alle monsters werd blokkering uitgevoerd met 5% normaal geitenserum (NGS) in PBS, en werden de kernen tegengekleurd met DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenylindol, 1:1000). Slides en coverslips werden drie keer gewassen gedurende 5 minuten elk met 0,1% Tween-20 in PBS tussen de incubatiestappen. Na het kleuren werden de monsters gemonteerd met Antifade Mountant en in het donker bewaard tot beeldvorming. Weefselsecties: Bijnierparaffine-secties werden gedeparaffiniseerd in xyleen, daarna gespoeld door een gegradueerde ethanolserie (100%, 95%, 70%) en uiteindelijk gespoeld met PBS. Antigeenwinning werd uitgevoerd in een Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 9,0) door 20 minuten te verhitten op 95 °C. Na afkoeling tot kamertemperatuur werden secties gewassen in PBS en 1 uur geblokkeerd met 5% NGS in PBS. Secties werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met de volgende primaire antilichamen verdund 1:100 in 5% NGS in PBS: muizenanti-Dab2, kip anti-GFP en konijn anti-RFP. De volgende secundaire antilichamen werden gebruikt (1:300): Alexa Fluor 594 geitenanti-muis IgG, Alexa Fluor 594 geitenanti-kip IgY, en Alexa Fluor 647 geitenanti-konijn IgG.
Gekweekte cellen: Immunofluorescentie op dekmantels werd vier dagen na het plateren uitgevoerd. De cellen werden vastgezet met voorverwarmde 4% paraformaldehyde (PFA) bij 37 °C gedurende 15 minuten en drie keer gewassen in PBS. Blokkeren werd uitgevoerd met 5% NGS in PBS gedurende 1 uur op kamertemperatuur. Dekdekkers werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met muis anti-Dab2 (1:100 in 5% NGS/PBS), gevolgd door Alexa Fluor 488 geitenanti-muis (1:500).
Beeldverwerving: Brightfield- en fluorescentiebeelden (mGFP en mTomato) van gekweekte cellen werden gemaakt met een microscoopsysteem. De mGFP-fluorescentie werd vastgelegd met een filterset voor groene fluorescentie (excitatie: 470 nM, emissie: 525 nM), en mTomato-fluorescentie werd vastgelegd met een filterset voor rode fluorescentie (excitatie: 585 nM, emissie: 624 nM).
Software en statistische analyse
Visuele samenvattingen, schematische diagrammen en figuren zijn gemaakt met Adobe Illustrator 2023 (Adobe Inc., https://www.adobe.com/products/illustrator.html) en BioRender (https://www.biorender.com), geraadpleegd in mei 2025. De gegevens werden geanalyseerd met GraphPad Prism versie 10.0. Beschikbaar op: https://www.graphpad.com. Alle experimenten werden ten minste driemaal uitgevoerd en onafhankelijk herhaald om reproduceerbaarheid van de resultaten te waarborgen. Voor vergelijkingen tussen twee groepen werd de Student's t-test (gepaard of ongepaard, afhankelijk van het geval) gebruikt. Voor vergelijkingen met drie of meer groepen werd een variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de juiste post hoc test uitgevoerd om significante verschillen tussen groepen te identificeren. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Een p-waarde van minder dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Vestiging en karakterisering van zone-verrijkte primaire bijniercelculturen
Primaire bijnierkweken werden succesvol gevestigd uit de OF, verrijkt voor zG-cellen, en de IF, verrijkt voor zF-cellen. Representatieve afbeeldingen van de gekweekte cellen zijn te zien in Figuur 2A (OF–zG) en Figuur 2B (IF–zF). Om de verrijking van zG-cellen en niet-zG-cellen in deze culturen te beoordelen, werd het ASCre/+
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
In deze studie werd een verfijnd protocol gepresenteerd dat primaire bijnierkweken van de muis genereert, verrijkt voor zG (OF) en zF (IF) cellen, die de zonale identiteit en sterologene functie van elke zone getrouw recapituleren Dit protocol zou een gedetailleerd onderzoek van de cellulaire en moleculaire biologie van de bijnierschors in een zone-specifieke context mogelijk moeten maken, wat de studie van eiwitten, signaalroutes en mechanismen ondersteunt die betrokken zijn bij de ontw...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven aan dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben met betrekking tot deze studie.
Dit werk werd ondersteund door FAPESP (São Paulo Research Foundation, Brazilië), projectnummer 2024/14165–6 (BEPE – JLK), FAPESP: 2020/02988–7 (C.F.P.L), en ondersteuning door 2R01DK123694 (aan DTB) en fondsen van de afdeling Endocrinologie van het Boston Children's Hospital (DTB).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Conical Tube (50 mL ) | Corning (Corning, NY, USA) | 352070 | Steriele |
| 0.22 µm Spuitfilter | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | SLGV033RS | Filtratie van verteringsoplossing |
| 10 mL Wegwerpspuit | BD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA) | 300912 | Steriele |
| 5 mL Serologische Pipet | Corning (Corning, NY, USA) | 4487 | Steriele |
| 10 mL Serologische Pipet | Corning (Corning, NY, USA) | 4488 | Steriele |
| Gefilterde Pipetpunten (P200) | Axygen (Union City, CA, USA) | TF-200-R-S | Steriele |
| Gefilterde Pipetpunten (P1000) | Axygen (Union City, CA, USA) | TF-1000-R-S | Steriele |
| P60 Kweekschaal | Corning (Corning, NY, USA) | 430166 | Behandeld voor weefselcultuur |
| 48-well Plaat | Corning (Corning, NY, USA) | 3527 | Behandeld voor weefselcultuur |
| Steriele Filterpapier | N/A | N/A | Verwijdering van vet en ondersteuning bij dissectie |
| DMEM/F-12 Medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 11320033 | 1:1 formulering |
| Foetaal Rundserum (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 10082147 | Hitte-geïnactiveerd |
| ITS Supplement | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 41400045 | 100X |
| GlutaMAX Supplement | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 35050061 | 100X |
| Penicilline-Streptomycine (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 15140122 | Antibioticum |
| PBS 1X | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 10010023 | pH 7.4 |
| Collagenase Type I | Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 17100-017 | Weefseldijging |
| DNase I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | DN25-1 | Weefseldijging |
| Angiotensine II (Ang II) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | A9525 | Hormoonstimulatie |
| Adrenocorticotroop Hormoon (ACTH) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | A0298 | Hormoonstimulatie |
| Forskolin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | F6886 | cAMP stimulatie |
| Kaliumchloride (KCl) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P9541 | Aldosteronstimulatie |
| Natriumchloride (NaCl) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S7653 | Voertuigcontrole |
| Kleine chirurgische schaar | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 14060-09 | Dissectie |
| Scalpel met wegwerpblad | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 10003-12 | Microdissectie |
| Fijne pincet | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 11252-00 | Dissectie |
| Gebogen pincet | Fine Science Tools (Foster City, CA, USA) | 11251-10 | Dissectie |
| Laminairstroomkap | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | N/A | Steriele weefselverwerking |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | N/A | Celcultuur |
| Centrifuge | Eppendorf (Hamburg, Duitsland) | N/A | Celpelleting |
| Neubauer Tellingkamer | Hausser Scientific (Horsham, PA, USA) | 1490 | Celtelling |
| RIPA Lysis- en extractiebuffer | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 89901 | Eiwitextractie |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 87786 | Eiwitextractie |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | FB120 | Sonicatie |
| RIA Systeem | Tecan (Männedorf, Zwitserland) | MG13051 | Hormoonkwantificering |
| Cobra II Auto-Gamma Teller | Berthold Technologies (Bad Wildbad, Duitsland) | N/A | Radioactiviteitsmeting |
| Corticosterone ELISA Kit (96-well) | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 55-CORMS-E01 | Hormoonmeting |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | P36930 | Monteermiddel |
| Muis anti-Dab2 | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 610464 | Primaire antilichaam |
| Kip anti-GFP | Aves Labs (Tigard, OR, USA) | GFP-1020 | Primaire antilichaam |
| Konijn anti-RFP | Rockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA) | 600-401-379 | Primaire antilichaam |
| Alexa Fluor 594 Geit anti-Muis | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | A-11005 | Secundair antilichaam |
| Alexa Fluor 594 Geit anti-Kip | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | A-11042 | Secundair antilichaam |
| Alexa Fluor 647 Geit anti-Konijn | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | A-21244 | Secundair antilichaam |
| Alexa Fluor 488 Geit anti-Muis | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | A-11001 | Secundair antilichaam |
| EVOS Microscoopsysteem | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | N/A | Beeldvorming |
| TRI Reagent | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T9424 | RNA-extractie |
| Direct-zol RNA Kit | Zymo Research (Irvine, CA, USA) | R2050 | RNA-zuivering |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | ND-1000 | RNA-kwantificering |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Foster City, |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen