Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een nieuw serumvrij 2D- en 3D-kweeksysteem bestaande uit twee kleine moleculen voor het cultiveren van de lipklierepitheelcellen van muizen

257 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70438

⸱

10 februari 2026

 ,  , 
1Department of Ophthalmology Optometry Center, China-Japan Union Hospital of Jilin University, 2Eye Institute & Affiliated Xiamen Eye Center, School of Medicine, Xiamen University, 3Huaxia Eye Hospital of Quanzhou, 4Shen Zhen Research Institute of Xiamen University

In dit artikel

Samenvatting

Een nieuw serumvrij kweeksysteem met de kleine molecuulcombinatie 2C (Y27632 en SB431542) wordt geïntroduceerd om de epitheelcellen van de traanklier (LGECs) efficiënt uit te breiden in zowel 2D- als 3D-culturen, waardoor nauwkeurige controle van hun proliferatie en differentiatie mogelijk is.

Samenvatting

Lacrimale klier (LG) disfunctie is een belangrijke oorzaak van watertekort droge oogziekte, en celgebaseerde en weefselengineeringtherapieën tonen aanzienlijk potentieel voor deze aandoening. De beperkte beschikbaarheid van voldoende zaadcellen die onder serumvrije omstandigheden worden gekweekt, heeft echter hun brede toepassing belemmerd. In deze studie ontwikkelden we een nieuw serumvrij kweeksysteem met twee kleine moleculen, Y27632 en SB431542 (2C), om LG-epitheelcellen (LGECs) efficiënt uit te breiden. Voor de 2D-primaire kweek van LGECs werden LG's geïsoleerd uit muizen van 6-8 weken oud en enzymatisch verteerd met Dispase II en Collagenase A. De resulterende celsuspensie werd in kweekschalen gezaaid met een dichtheid van 7.500 cellen/cm² en 12-14 dagen met 2C gekweekt. Toen de celconfluentie 80-90% bereikte, werd de subcultuur gestart in een verhouding van 1:2. Voor 3D-cultuur werden 10.000 P1 LGEC's opnieuw gesuspendeerd in 10 μL 2C en 10 μL matrixgel, waarna ze in het midden van een 24-wellplaat werden gezaaid. Na een stollingsperiode van 30 minuten bij 37 °C werd 600 μL van 2°C toegevoegd voor verdere kweek. Voor differentiatie werden de 3D-sferoïden 7 dagen met 2C gekweekt, gevolgd door verwijdering van 2C en verdere kweek van 7 dagen. LGEC's gekweekt met 2C vertoonden een hoge proliferatie, met verhoogde expressie van stam- en proliferatiemarkers (Ki67, K14, P63, K5, K15 [P = 0,0011, 0,0002, 0,0012, 0,0003, 0,0014, respectievelijk]), en behielden morfologie en proliferatieve capaciteit zelfs na tien passages. Bovendien vormden LGEC's onder 3D-omstandigheden sferoïden met stam/voorloper-eigenschappen, die verder onderscheidden in microklierstructuren met meerdere LG-celtypen (AQP5, K19, α-SMA-positieve) en volwassen secretorische functies na het verwijderen van 2C. Deze aanpak zal naar verwachting een stabiele bron van zaadcellen bieden voor weefselengineering en biedt een nieuw in vitro model om LG-fysiologie te bestuderen.

Inleiding

De traanklier (LG) is essentieel voor de aanmaak van de waterige laag van de traanfilm, die cruciaal is voor het behouden van de homeostase van het oogoppervlak1. Een disfunctie van de LG, veroorzaakt door letsel of ontsteking, leidt tot watertekort-droge ogen (ADDE). Deze aandoening kan leiden tot ernstige ontsteking van het oogoppervlak, chronische hoornvliesziekten en, in ernstige gevallen, permanent verlies van gezichtsvermogen2. Huidige behandelingen voor ADDE behandelen voornamelijk symptomen, zonder de onderliggende klierdisfunctie aan te pakken, die hun langetermijneffectiviteit beperkt1. De ontwikkeling van gerichte therapieën voor LG-disfunctie brengt verschillende uitdagingen met zich mee, waaronder het ontbreken van langetermijn, eenvoudige in vitro modellen, die het begrip van LG-pathofysiologie beperken en de ontwikkeling van effectieve therapieën belemmeren. Hoewel celtransplantatie potentieel heeft getoond in het bevorderen van LG-regeneratie, vormen de beperkte uitbreidingscapaciteit van cellen in vitro en de complexiteit van bestaande kweeksystemen aanzienlijke obstakels voor klinische toepassing 1,3. Daarom is het opzetten van een eenvoudig, langdurig kweeksysteem voor volwassen muis-LG's essentieel voor het bevorderen van het begrip van LG-fysiologie en -pathologie, evenals het bieden van een betrouwbare bron van LG-stam-/voorlopercellen voor LG-letselherstel en -regeneratie.

Bestaande in-vitrokweeksystemen voor LG hebben aanzienlijke vooruitgang geboekt, maar ondervinden nog steeds aanzienlijke beperkingen. Veel van deze methoden maken gebruik van met serum aangevuld media, wat verschillende problemen met zich meebrengt zoals batch-tot-batch variabiliteit, ongedefinieerde componenten en het risico op fibroblast- of mesenchymale celbesmetting 4,5,6,7,8. Bovendien zijn serumgebaseerde systemen ongeschikt voor het bestuderen van de pathogene mechanismen van LG-ziekten en vormen ze uitdagingen voor celtransplantatietherapieën vanwege mogelijke risico's op immuunafstoting9. Als reactie op deze beperkingen zijn er verschillende serumvrije methoden ontwikkeld voor het kweken van LG-epitheelcellen (LGECs) van zowel muizen als mensen. Zo gebruikten Ueda et al. met succes een serumvrije methode om LGEC's te kweken van pasgeboren muizen10. Deze methode werd echter beperkt door het onvermogen om de cellen door subculturen te laten lopen en de noodzaak van een groot aantal neonatale klieren om voldoende LGECs te verkrijgen. Evenzo ontwikkelden Kobayashi et al. een serumvrij kweeksysteem met choleratoxine, maar hadden ze moeite om de cellulaire morfologie tijdens passage11 te behouden. Recente ontwikkelingen omvatten de ontwikkeling van een 3D-kweeksysteem voor LG-stamcellen van muizen en het LG-kweeksysteem van Bannier-Hélaouët et al. voor zowel muizen als mensen 12,13,14,15. Deze systemen zijn echter afhankelijk van complexe mediaformuleringen met meerdere kleine moleculen, groeifactoren en additieven, wat het kweekproces bemoeilijkt en de schaalbaarheid beperkt. Deze uitdagingen benadrukken de noodzaak van een vereenvoudigd, effectief serumvrij kweeksysteem dat de efficiënte uitbreiding van LGECs kan faciliteren, terwijl hun proliferatieve en stam/voorloperkenmerken behouden blijven voor verdere therapeutische toepassingen en onderzoek.

In de afgelopen jaren heeft de snelle ontwikkeling van kleine molecuul-gemedieerde chemische herprogrammering nieuwe strategieën geïntroduceerd om primaire volwassen cellen in vitro16 te behouden en uit te breiden. Door het reguleren van intracellulaire signaalroutes, cel-matrix interacties en celadhesie, verhogen kleine moleculen de celproliferatie en plasticiteit aanzienlijk, wat de efficiëntie van celexpansie en lotscontrole verbetert17. Door hun beheersbare productie, lage immunogeniteit en niet-genomische integratie zijn kleine moleculen ideaal voor het construeren van in vitro systemen voor de uitbreiding van volwassen epitheelcellen16. Combinaties van verschillende kleine moleculen zijn aangetoond effectief de in vitro uitbreiding van verschillende primaire celtypen in stand te houden, waaronder huid-, hoornvlies- en conjunctivale epitheelstamcellen 18,19,20. Daarom toont het ontwikkelen van een op kleine moleculen gebaseerde strategie voor de uitbreiding van LGEC's potentieel voor toekomstige toepassingen in zowel onderzoeks- als therapeutische omgevingen.

In dit protocol werd een eenvoudig en efficiënt serumvrij kweeksysteem ontwikkeld met twee kleine moleculen, Y27632 en SB431542 (2C), ter ondersteuning van de uitbreiding van LGECs. Door de voordelen van deze twee moleculen te combineren, werd een serumvrij systeem opgebouwd voor zowel 2D- als 3D-culturen. LGEC's gekweekt met 2C vertoonden een hoge proliferatieve capaciteit en stam-/voorlopercelkenmerken, waarbij de typische epitheelcelmorfologie behouden bleef na minstens 10 passages in vitro. In de 3D-cultuur behielden LGEC's niet alleen stam-/voorlopercelkenmerken, maar toonden ze ook het vermogen om verder te differentiëren in secretoire structuren na het verwijderen van 2C, waarbij microklierstructuren met secretorische functie ontstonden. Dit serumvrije systeem is geschikt voor in vitro modellen van LG-fysiologie en -pathologie, en biedt ook een aanzienlijke bron van cellen voor LG-weefselengineering en regeneratieve toepassingen. Het huidige protocol biedt echter slechts een voorlopige verkenning van 3D-cultuur. Langdurige 3D-cultuur valt op dit moment buiten het bestek van dit onderzoek. Het is belangrijk op te merken dat deze methode specifiek is ontworpen voor volwassen muis-LGEC's en mogelijk niet toepasbaar is op andere soorten zonder verdere optimalisatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regelgeving van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) en de Ethical Committee voor Experimentele Dieren van de Jilin University en Xiamen University.

OPMERKING: Alle celkweekprocedures werden uitgevoerd in een UV-gesteriliseerde bioveiligheidskast in de celoperatiekamer.

1. Primaire cultuur van LGEC's

  1. Isolatie van LG-weefsel
    1. Euthanaser C57BL/6J muizen (6-8 weken oud) door een cervicale dislocatie en desinfecteer het oorgebied (rond de LG) met 75% ethanol om besmetting te voorkomen.
    2. Maak een incisie van de buitenste canthus naar de huid onder het oor om de LG bloot te leggen. Met steriele, gladde pincetten en schaar, scheid de LG zorgvuldig van het omliggende weefsel (parotisklieren en bindweefsel) onder een dissectiemicroscoop om de LG te verkrijgen.
    3. Plaats de LG in een voorgekoeld weefselverzamelmedium (DMEM met 10% penicilline-streptomycine-amfotericine) in een 1,5 mL microcentrifugebuis, waarbij het weefsel op ijs blijft om degradatie te minimaliseren.
  2. Weefselvoorbereiding
    1. Breng de LG's over in een nieuw koud weefselverzamelmedium in een schaaltje van 3,5 cm.
    2. Verwijder eventuele resterende muizenvacht en pel vervolgens de bindweefselcapsule rond de LG's af. Isoleer het klierweefsel door met gladde tangen het bindweefsel tussen de lobussen te verwijderen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de capsule op het oppervlak van de LG en het bindweefsel tussen de lobules grondig worden verwijderd om de kanalen tussen de lobules bloot te leggen, wat de penetratie van de verteringsoplossing tijdens het volgende verteringsproces zal vergemakkelijken.
    3. Breng het weefsel over in een nieuw verzamelmedium en was het 5-10 minuten om besmetting te voorkomen.
  3. Enzymatische vertering
    1. Plaats de LG's in een 1,5 mL microcentrifugebuis met een verteringsoplossing (serumvrij medium aangevuld met 2 mg/mL Dispase II en 2 mg/mL Collagenase A). (Aanvullende Tabel 1).
      OPMERKING: 1 mL verteringsoplossing is nodig voor 4 LG's.
    2. Snijd het LG-weefsel fijn met een microschaar in kleine stukjes (ongeveer 0,5-1 mm³) binnen de buis.
    3. Incubeer de microcentrifugebuis op 37 °C met 5%CO2 gedurende 2,5-3 uur. Meng elke 30-60 minuten voorzichtig het weefsel in de verteringsoplossing om een grondige enzymatische vertering te garanderen.
  4. Isolatie en oogst van LGEC's
    1. Schud de microcentrifugebuis meerdere keren na voltooiing van de verteringstijd. Pipette de verteringsoplossing meerdere keren om het weefsel op te breken in enkele cellen of kleine celklonten. Observeer onder een microscoop om de spijsverteringsvoortgang te bevestigen.
      OPMERKING: Wanneer er geen zichtbare deeltjes meer in de verteringsoplossing overblijven en grote aantallen enkele cellen, evenals kanaalachtige celaggregaten, onder de microscoop worden waargenomen, stop dan het verteringsproces.
    2. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en gooi daarna het verteringsmedium weg.
    3. Susstrueer de celpellet opnieuw in 1 ml steriele DPBS en centrifugeer opnieuw op 1000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om eventuele resterende spijsverteringsenzymen te verwijderen.
    4. Herhaal stap 1.4.3, verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in 500 μL serumvrij medium.
  5. LGEC's zaaien en primaire cultuur
    1. Bereid het kweekmedium van de LGECs voor door serumvrij medium aan te vullen met 1% penicilline-streptomycine en 2C (10 μM Y27632 en 10 μM SB431542). (Aanvullende Tabel 1)
    2. Zaad de cellen in standaard, onbehandelde 24-put kweekplaten met een dichtheid van 7,5 x 10³ cellen/cm² met serumvrij 2C-medium.
    3. Na het zaaien tik je voorzichtig op de randen van de kweekplaat om een gelijkmatige celverdeling te garanderen. Plaats de plaat in een incubator van 37 °C met 5%CO2.
    4. Verander het kweekmedium voor het eerst 72 uur na het zaaien. Daarna vervang je het medium elke 2-3 dagen.
      OPMERKING: Vermijd het verstoren van de cultuur tijdens de eerste 72 uur. Voor de eerste mediumwissel was je de cellen niet met DPBS. Verwijder simpelweg het oude medium en voeg een nieuw medium toe.

2. Subculturatie van LGEC's

OPMERKING: Subcultuur wanneer de celconfluentie 80-90% bereikt, wat meestal ongeveer 14 dagen na de primaire kweek plaatsvindt.

  1. Verwijder het kweekmedium en was de cellen voorzichtig twee keer met steriele DPBS.
  2. Voeg 250 μL 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 10-15 minuten. Zodra de tight junctions loskomen en de cellen weer afgerond zijn, voeg je een gelijk volume gedefinieerde trypsine-remmeroplossing toe om de vertering te beëindigen.
    OPMERKING: Als er tijdens de primaire kweek platte en grote hechtende cellen worden waargenomen, behandel de kweek dan 5 minuten met 0,25% trypsine-EDTA om deze heterogene cellen te verwijderen. Behandel de kweek vervolgens opnieuw met 0,25% trypsine-EDTA gedurende nog eens 5 minuten om verder te verteren en een zuiverdere populatie LGEC's te verkrijgen voor de volgende behandeling.
  3. Meng de celsuspensie door te pipetten met een pipet van 1 mL, doe het vervolgens over in een centrifugebuis van 1,5 mL en centrifugeer op 1000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg.
  4. Was de cellen met steriele DPBS en centrifugeer opnieuw om de LGEC's te verzamelen.
  5. Suspendeer de LGEC's opnieuw in 2C-kweekmedium en zaad in een verhouding van 1:2 voor subcultuur. Meng de cellen voorzichtig door de kweekplaat te schudden en incubeer bij 37 °C met 5%CO2.
    OPMERKING: Subculturing in een verhouding van 1:2 betekent dat, zodra celconfluentie 80-90% bereikt, de LGEC's worden verteerd van één putplaat en gelijkmatig worden verdeeld over twee nieuwe putplaten.
  6. Verander het medium op dag 3 na het zaaien, en verander het medium elke 2-3 dagen, afhankelijk van de celconditie.
  7. Bekijk de celmorfologie dagelijks onder een inverted phase contrastmicroscoop en documenteer met foto's.

3. Driedimensionale (3D) cultuur van LGEC's

OPMERKING: Het 3D-kweekexperiment gebruikt P1 LGEC's. Wanneer de P1 LGEC's na 7 dagen kweek met 2C 80-90% samenvloeiing bereiken, worden ze gebruikt voor 3D-kweek.

  1. Voorbereidingsstappen
    1. Breng matrixgel (Aanvullende Tabel 1) van de -20 °C vriezer naar een koelkast van 4 °C voor een nacht ontdooien.
    2. Plaats de benodigde pipettoppen in de -20 °C vriezer om een goede voorkoeling te garanderen.
    3. Verwarm de 24-put kweekplaat voor door deze 2 uur in een 37 °C, 5% CO2-broedmachine te plaatsen voordat je met de 3D-kweek begint.
    4. Bereid een koelbox voor en plaats er verschillende 1,5 mL microcentrifugebuizen in voor voorkoeling. Steriliseer de koelbox in een bioveiligheidskast voordat je het gebruikt.
  2. 3D-cultuur van LGEC's
    1. Verkrijg P1 LGECs, zoals beschreven in stappen 2.1 tot 2.4.
    2. Sussief de celpellet opnieuw in een 2C-kweekmedium en pas de celdichtheid aan op 1 × 10⁴ cellen per 10 μL.
    3. Neem de ontdooide matrixgel uit de 4 °C koelkast en de voorgekoelde pipettoppen uit de -20 °C vriezer en plaats ze in de koelkast in de bioveiligheidskast.
    4. Haal de voorverwarmde 24-put kweekplaat uit de broedmachine en plaats deze in de bioveiligheidskast.
    5. Voeg een passend volume van de celsuspensie toe, gemengd met matrixgel in een verhouding van 1:1, met voorgekoelde pipettoppen. Meng voorzichtig om een gelijkmatige verdeling te garanderen.
    6. Pipette 20 μL van het mengsel vanaf stap 3.2.5 voorzichtig in het midden van elke put van de voorverwarmde 24-put plaat.
    7. Keer de plaat om en broei deze in een 37 °C, 5% CO2-broedmachine gedurende 30 minuten om de matrixgel te laten stollen.
    8. Zodra de matrixgel is gestold, voeg je 600 μL 2C-kweekmedium toe aan elke put.
    9. Incubeer de kweekplaat in een broedmachine met 37 °C en 5%CO2 gedurende 14 dagen. Vervang het medium op dag 3 na het zaaien en daarna elke 2-3 dagen, afhankelijk van de celconditie.
    10. Observeer dagelijks de vorming van 3D-sferoïden onder een inverted phase contrastmicroscoop en maak beelden voor documentatie.
  3. Differentiatie van 3D LGEC-sferoïden
    1. Kwek 3D LGEC-sferoïden zoals beschreven in stap 3.2.
    2. Na 7 dagen kweek je het 2C-kweekmedium en was je de cellen voorzichtig twee keer met DPBS om de resterende 2C te verwijderen. Wees voorzichtig dat je de matrixgel niet verstoort.
    3. Voeg serumvrij medium toe zonder 2C (Null) en ga nog eens 7 dagen verder met de kweek om differentiatie te induceren.
    4. Verander het medium elke 2-3 dagen tijdens de kweekperiode.
    5. Observeer dagelijks de morfologische veranderingen van de geïnduceerde 3D-sferoïden onder een inverted phase contrastmicroscoop en maak beelden voor documentatie.

4. Inbedding en bevroren sectie van gedifferentieerde 3D LGEC-sferoïden

OPMERKING: Differentiatie van 3D-sferoïden wordt geïnduceerd zoals beschreven in sectie 3.3. Na 7 dagen differentiatie volgt u de onderstaande stappen voor optimale snijtemperatuur (OCT) inbedding en bevroren sectie van de gedifferentieerde 3D-sferoïden.

  1. Aspireer het kweekmedium langs de randen van de put. Was de gedifferentieerde sferoïden voorzichtig drie keer met steriele DPBS.
  2. Voeg 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe aan de put in een bioveiligheidskast of afzuigkap en fixeer de sferoïden 10 minuten op kamertemperatuur.
  3. Was de sferoïden voorzichtig drie keer met steriele DPBS, elke wasbeurt duurt 10 minuten, om het fixatiemiddel te verwijderen.
  4. Gebruik een spatel om voorzichtig de 3D-sferoïdematrix gel-koepelachtige structuur te schrapen en deze over te brengen in een 5 mL microcentrifugebuis met 20% sucroseoplossing.
  5. Incubeer de buis een nacht op 4 °C totdat de koepelstructuur op de bodem van de buis is neergezet.
  6. Verwijder de koepelstructuur uit de sucroseoplossing, verwijder voorzichtig eventuele achtergebleven sucrose en leg deze in de OCT-verbinding. Vries in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C.
  7. Bereid voor het kleuren 10 μm dikke secties voor met een vriesmicrotoom.

5. Detectie van secretiefunctie van gedifferentieerde 3D LGEC-sferoïden

  1. Monsterverzameling
    1. Induceer differentiatie van 3D-sferoïden zoals beschreven in sectie 3.3.
    2. Na 7 dagen differentiatie verwijder je het kweekmedium en was je de 3D-sferoïden drie keer met DPBS.
    3. Voeg 500 μL serumvrij medium toe zonder 2°C en incubeer bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 2 uur.
    4. Verzamel het kweekmedium en breng het over in een 1,5 mL microcentrifugebuis als basismonster om de lactoferrine (LTF) concentratie te meten vóór pilocarpinestimulatie.
    5. Was de 3D-sferoïden voorzichtig drie keer met steriele DPBS.
    6. Voeg 500 μL serumvrij medium toe met 1 μg/mL pilocarpine en incubeer de 3D-sferoïden bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 24 uur.
    7. Na incubatie wordt het kweekmedium verzameld in een 1,5 mL microcentrifugebuis (voor het meten van de LTF-concentratie na pilocarpinestimulatie).
    8. Centrifugeer de verzamelde kweekmediummonsters bij 4 °C bij 1000 × g gedurende 20 minuten. Verzamel het supernatant en bewaar het bij -80 °C voor later gebruik.
  2. Monsterverdunning
    1. Haal de monsters uit de -80 °C vriezer en laat ze volledig ontdooien bij kamertemperatuur.
    2. Neem 5 μL van het monster en verdun dit met 495 μL monsterverdunningsbuffer uit de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit om een verdunning van 100 keer te maken.
  3. Bereiding van reagens
    1. Breng alle reagentia van de ELISA-kit 20 minuten voor gebruik op kamertemperatuur.
    2. Bereid de wasbuffer voor: Bereken de benodigde hoeveelheid op basis van het aantal monsters en verdun de geconcentreerde wasbuffer met gedestilleerd water (1:24).
    3. Bereid de standaard werkoplossing voor:
      1. Centrifugeer de gelyofilieerde standaard op 10.000 × g gedurende 1 minuut. Voeg 1 ml Reference Standard en Sample Diluent toe, laat het 10 minuten staan en keer het voorzichtig meerdere keren om.
      2. Meng na het volledig oplossen grondig met een pipet. Deze reconstitutie levert een werkende oplossing van 2000 pg/mL op.
    4. Maak seriële verdunningen volgens de instructies van de kit om de volgende standaard concentratiegradiënt te maken: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg/mL.
    5. Bereid de werkoplossing voor biotinyleerde detectie-antilichamen voor:
      1. Bereken het benodigde volume voor de assay (50 μL/put). Centrifugeer het geconcentreerde biotinyleerde detectie-antilichaam bij 800 × g gedurende 1 minuut, en verdun vervolgens het 50× geconcentreerde biotinyleerde detectieantilichaam tot een 1× werkoplossing met behulp van biotinyleerde detectie-antistofverdunningsmiddel.
      2. Bereid de oplossing vlak voor gebruik voor, waarbij je iets meer maakt dan de berekende hoeveelheid, meestal met 100-200 μL meer dan nodig.
    6. Bereid de mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerde werkoplossing:
      1. Bereken het vereiste volume voor het experiment (50 μL/put). Centrifugeer het geconjugeerde HRP-element op 800 × g gedurende 1 minuut, en verdun het vervolgens tot een werkconcentratie van 1x met een HRP-conjugaatverdunningsmiddel.
      2. Bereid de oplossing vlak voor gebruik voor, waarbij je iets meer maakt dan de berekende hoeveelheid, meestal met 100-200 μL meer dan nodig.
  4. ELISA-assayprocedure
    1. Bepaal de putten voor de verdunde standaard, blank en monsters, met 3 replicaten voor elk. Voeg 25 μL van de standaard werkoplossing, blanco of verdunde monsteroplossing toe aan de overeenkomstige wellen. Bedek de plaat met de afdichter die bij de kit zit en incubeer bij 37 °C gedurende 90 minuten.
      OPMERKING: Oplossingen moeten aan de onderkant van de micro ELISA-plaat worden toegevoegd. Vermijd zoveel mogelijk aanraking van de binnenwand en het veroorzaken van schuim.
    2. Giet de vloeistof uit de putjes zonder te wassen. Voeg onmiddellijk 50 μL van de biotinyleerde detectie-antistofwerkoplossing toe aan elke put. Bedek de plaat met een nieuwe sealer en incubeer 60 minuten op 37 °C.
    3. Dekanteer de vloeistof uit de putten en voeg 350 μL voorbereide wasbuffer toe aan elke put. Laat het 1 minuut weken, aspireer of giet daarna de vloeistof uit elke put en dep het droog met schoon, absorberend papier. Herhaal deze wasstap drie keer.
      OPMERKING: Laat de putjes niet drogen tijdens het wasproces.
    4. Voeg 50 μL van de voorbereide HRP-conjugaatwerkoplossing toe aan elke put. Bedek de plaat met een nieuwe sealer en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    5. Dekanteer de vloeistof uit de putten en herhaal het wasproces vijf keer met washbuffer zoals beschreven in stap 5.4.3.
    6. Voeg 50 μL substraatreagens toe aan elke put. Bedek de plaat met een nieuwe sealer en laat het 15 minuten in het donker incuberen bij 37 °C.
    7. Voeg 25 μL stopoplossing toe aan elke put om de reactie te beëindigen. Zorg ervoor dat de stopoplossing in dezelfde volgorde wordt toegevoegd als de substraatoplossing.
    8. Bepaal onmiddellijk de optische dichtheid (OD-waarde) van elke put bij 450 nm met behulp van een microplaatleser.

6. RNA-isolatie

  1. Monsterverzameling
    1. Voor LG-weefsel
      1. Isoleer het extraorbitale LG-weefsel van volwassen muizen zoals beschreven in sectie 1.1.2-1.1.2.
      2. Dompel het vers geïsoleerde LG-weefsel onder in PBS om eventueel bloed af te wassen.
      3. Dep het oppervlaktevocht van de LG met filterpapier en plaats het weefsel in een 1,5 mL microcentrifugebuis met 1 mL RNA-extractiereagens (Aanvullende Tabel 1), waarbij de buis op ijs blijft.
        OPMERKING: Voer maalstappen uit vóór RNA-extractie om volledige lysatie van het weefsel te waarborgen.
      4. Voeg twee schone stalen maalkralen toe aan de microcentrifugebuis en plaats de buis vervolgens in een voorgekoelde hogesnelheidsmolen met lage temperatuur.
      5. Stel de molenparameters in: frequentie 70 Hz, maaltijd 45 seconden, pauzetijd 15 seconden, en herhaal dit 10 cycli. Draai het dophandvat van de molen aan en begin met slijpen.
      6. Plaats de buis op ijs of bewaar hem op -80 °C voor de volgende RNA-extractie zodra het maalproces is voltooid.
    2. Voor LGEC's
      1. Verwijder het kweekmedium en was de cellen drie keer met steriele DPBS wanneer de LGEC's 80-90% samenvloeiing bereiken.
      2. Voeg 600 μL RNA-extractiereagens toe aan elke put (voor een plaat met 24 putten) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
      3. Gebruik een pipet van 1 mL om herhaaldelijk de RNA-extractie-reagensoplossing in elke put te pipetten om volledige cellyse te garanderen.
      4. Breng de oplossing over in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
      5. Plaats de buis op ijs of bewaar hem op -80 °C voor latere RNA-extractie.
    3. Voor 3D LGEC-sferoïden
      1. Verzamel ongedifferentieerde en gedifferentieerde 3D LGEC-sferoïden die gedurende 14 dagen worden gekweekt zoals beschreven in stappen 3.2-3.3. Voeg 1 mL verteringsoplossing (serumvrij medium met 1 mg/mL Dispase II) toe aan elke put, zodat de 3D-sferoïdematrix gelkoepelachtige structuur volledig wordt bedekt. Incubeer bij 37 °C met 5%CO2 gedurende 30 minuten.
      2. Breng de verteringsoplossing met de 3D-sferoïden over in een 1,5 mL microcentrifugebuis met een pipet van 1 mL. Centrifugeer op 1000 × g gedurende 3 minuten om de sferoïde pellet te verzamelen.
      3. Was de pellet met 1 mL DPBS en centrifugeer op 1000 × g gedurende 3 minuten om de pellet weer op te vangen.
      4. Voeg 600 μL RNA-extractie-reagens toe (per 20 μL matrixgel) en incubeer op kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.
      5. Meng grondig met een pipet van 1 mL om volledige lysatie van de 3D-sferoïden te garanderen.
      6. Plaats de buis op ijs of bewaar hem op -80 °C voor latere RNA-extractie.
  2. RNA-extractie
    OPMERKING: Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, handschoenen, mondkapje) en voer alle procedures uit waarbij chloroform en isopropanol betrokken zijn in een dampkap. Voer chemische afvalstromen af in aangewezen containers voor gevaarlijk afval die zijn gelabeld voor de productie van gevaarlijk afval, volgens institutionele afvalverwerkingsprotocollen.
    1. Voeg chloroform (1/5 volume RNA-extractiereagens) toe aan de centrifugebuis met het RNA-monster in RNA-extractiereagens (vanaf stap 6.1).
      OPMERKING: Voer de procedure uit in een dampkap.
    2. Meng grondig met een vortex en incubeer 10 minuten op kamertemperatuur tot fase-scheiding.
    3. Centrifugeer op 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Na centrifugatie zal de vloeistof zich scheiden in drie lagen, waarbij RNA zich in de bovenste transparante waterige fase bevindt.
    4. Bereid een nieuwe 1,5 mL RNase-vrije centrifugebuis voor en voeg isopropanol (1/half van het volume RNA-extractie-reagens) toe aan een dampkap.
    5. Pipetteer voorzichtig de bovenste transparante waterige fase (1/2 van het volume RNA-extractie-reagens) in de nieuwe RNase-vrije buis.
      OPMERKING: Wees voorzichtig om de middelste laag niet te vervuilen bij het pipetten.
    6. Draai de buis meerdere keren om te mengen en laat hem 10 minuten op kamertemperatuur incuberen. Daarna centrifugeer ik opnieuw op 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    7. Gooi het supernatant weg en voeg 500 μL 75% ethanol toe om de pellet te wassen door de buis om te keren. Centrifugeer opnieuw op 14.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    8. Herhaal stap 6.2.7. Gooi het supernatant weg en voer een snelle centrifugatie uit om eventuele resterende vloeistof te verwijderen.
    9. Leg de tube op ijs in de afzuigkap, open het deksel en laat het 10-20 minuten aan de lucht drogen totdat de witte pellet halftransparant wordt.
    10. Voeg 20 μL RNase-vrij water toe om de pellet op te lossen. Meet de RNA-concentratie en zuiverheid met een spectrofotometer.
      OPMERKING: Als de RNA-concentratie te hoog is, verdun dan met een geschikte hoeveelheid RNase-vrij water.
    11. Plaats de RNA-oplossing op ijs of bewaar deze bij -80 °C voor het daaropvolgende reverse transcriptieproces.

7. Kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)

  1. Omgekeerde transcriptie
    1. Voeg de volgende componenten in volgorde toe aan de PCR-reactiebuis volgens de instructies van de fabrikant: 800 ng totaal RNA (bereken het volume op basis van de concentratie), 4 μL 5x All-in-One SuperMix voor q-PCR, 1 μL gDNA-verwijderaar en RNase-vrij water om het totale volume op 20 μL te brengen.
    2. Meng de componenten voorzichtig. Stel de PCR-machine in op de volgende voorwaarden: 55 °C voor 6 minuten, 80 °C voor 1 minuut, en daarna 12 °C voor onbepaalde tijd.
    3. Bewaar het cDNA bij -20 °C of bewaar het op ijs voor het qRT-PCR-proces nadat de omgekeerde transcriptiereactie is voltooid.
  2. qRT-PCR
    1. Bereid de qRT-PCR pre-mix oplossing voor om verschillende genen als volgt te targeten: 5 μL 2x Green qPCR SuperMix, 0,2 μL Forward Primer (10 μM), 0,2 μL Reverse Primer (10 μM) en 3,6 μL nucleasevrij water. Meng voorzichtig en leg het op ijs.
    2. Voeg 9 μL van de qRT-PCR premix (bereid in stap 7.2.1) en 1 μL cDNA (bereid in stap 7.1) toe aan de qRT-PCR-buizen volgens het experimentele ontwerp.
    3. Centrifugeer de buizen op 1000 × g bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.
    4. Plaats de buizen in de fluorescentie-kwantitatieve PCR-machine voor detectie.
      OPMERKING: Gebruik een driestapsmethode met het volgende programma volgens de instructies van de fabrikant van het reagentia: 94 °C voor 30 s, 94 °C voor 5 s, 60 °C voor 15 s, en 72 °C voor 10 s. Begin met fietsen vanaf stap 2 voor 40-45 cycli.
    5. Voer kwantitatieve analyse uit met behulp van de vergelijkende CT-methode (2-ΔΔCt).
      OPMERKING: Elke dataset moet minstens drie onafhankelijke keren worden herhaald om de betrouwbaarheid van de resultaten te waarborgen.

8. Immunofluorescentiekleuring

OPMERKING: Immunofluorescentiekleuring wordt uitgevoerd op LGEC's die zijn gekweekt in 24-wellplaten met confluentiepercentages van 70-80% of op bevroren secties van gedifferentieerde LGEC's 3D-structuren.

  1. Voor LGEC's
    1. Verwijder het kweekmedium uit de putten en was de cellen drie keer met PBS.
    2. Voeg 500 μL 4% PFA toe aan elke put in een bioveiligheidskast of afzuigkap en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te herstellen.
    3. Was de cellen drie keer met PBS, elke was duurt 5 minuten.
    4. Voeg 500 μL van 0,2% Triton X-100 toe om de cellen te bedekken en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur om het celmembraan te permeabiliseren.
    5. Was de cellen drie keer met PBS, elke was duurt 10 minuten.
    6. Verwijder de PBS en gebruik een immunohistochemische marker om een cirkel rond elke put van de 24-wellplaat te tekenen. Voeg 50 μL van 2% BSA toe aan elke put om de cellen te bedekken. Incubeer 1 uur op kamertemperatuur om te blokkeren.
    7. Verwijder de BSA en voeg 50 μL van het verdunde primaire antilichaam toe (Aanvullende Tabel 1) om de LGECs te bedekken. Incubeer bij 4 °C gedurende 16-18 uur.
    8. Verwijder het primaire antilichaam en herhaal stap 8.1.5.
    9. Voeg 50 μL fluorescerende secundair antistof toe aan elke put om de LGECs te bedekken. Incubeer 1 uur op kamertemperatuur in het donker.
    10. Herhaal stap 8.1.5, vermijd blootstelling aan licht.
    11. Voeg 50 μL 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) oplossing toe om de LGEC's te bedekken en observeer de kleuring onder een fluorescentiemicroscoop.
  2. Voor 3D LGEC-sferoïden
    1. Bereid de 3D LGEC-sferoïde bevroren secties voor zoals beschreven in stap 4. Voer de immunofluorescentiekleuring uit zoals beschreven in stappen 8.1.2-8.1.11.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Stel een serumvrij LGEC-kweeksysteem op met behulp van 2C
In dit protocol was het doel om een eenvoudiger, efficiënter kweeksysteem op te zetten voor het uitbreiden van primaire muis-LGECs. Na uitgebreide screening werd een serumvrije 2C-combinatie, uitsluitend bestaande uit Y27632 en SB431542, met succes ontwikkeld, wat langdurige in-vitro uitbreiding van LGECs mogelijk maakte. Na gemengde enzymdigestie begonnen primaire LGEC's te hechten en vormden ze meerd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zoals beschreven in de inleiding zijn er de afgelopen jaren verschillende serumvrije kweeksystemen voor LG-cellen ontwikkeld: 10,11,12,13. Veel van deze methoden hebben echter beperkingen, waaronder slechte celproliferatie en het onvermogen om grootschalige expansie in vitro10,11 te bereiken. B...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82471048, 82271045); het Shenzhen Science and Technology Program (JCYJ20240813145510014); het Speciale Onderzoeksproject Gezondheidsonderzoek van de provincie Jilin (2023SCZ63, 2024SCZ53, 2025SCZ65); en het Wetenschaps- en Technologieontwikkelingsproject van de provincie Jilin (YDZJ202601ZYTS389).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 -20°C Ultra-lage temperatuur koelkastHaier
 -80°C Ultra-lage temperatuur koelkastHaier
0.25% Trypsine-EDTAGibco25200056
1.5 mL microcentrifugebuis KirgenKG2211Rnase-vrij
35mm celcultuurschaalLABSELECT12111
4 °C KoelkastHaier
4% paraformaldehyde (PFA)ServicebioG1101
4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)Yeasen708939ES03Bewaar bij -20 °C, stock op 1 mg/mL, 500x, verdun tot 1x met 1x PBS
5 mL centrifugeerbuis ACMECAC17457
50mL centrifugeerbuis LABSELECTCT-002-50-SS
Anti-alpha gladde spier actine konijnenantilichaamAbcamab5694Verdun met de antilichaamverdunningsbuffer op 1:100 
Anti-AQP5 konijnenantilichaam ABclonalA9927Verdun met de antilichaamverdunningsbuffer op 1:100 
Anti-Cytokeratin 14 konijnenantilichaamAbcamab181595Verdun met de antilichaamverdunningsbuffer op 1:200 
Anti-Cytokeratin 19 konijnenantilichaamAbcamab52625Verdun met de antilichaamverdunningsbuffer op 1:400 
Anti-Ki67 konijnenantilichaamAbcamab16667Verdun met de antilichaamverdunningsbuffer op 1:200 
BioveiligheidskastSterilGARD
Rundvlees serum albumine (BSA) Yeasen36101ES60Bewaar bij 4°C
C57BL/6J muizenLaboratory Animal Center of Xiamen University
CelcultuurplaatLABSELECT1131224-well
Cel incubatorEppendorf
CentrifugeEppendorf
ChloroformHUSHI10006818VOORZICHT, Voer bewerkingen uit in een afzuiging
CO2 constante temperatuur incubatorEppendorf
Collageenase ARoche10103586001Bewaar bij -20 °C, stock op 200 mg/mL, 100x
Gedefinieerde trypsine-remmer oplossing(DTI)GibcoR007100
DermaLife K Keratinocyt Medium Complete Kit (Serum-vrij medium) Life LineLL-0007Bewaar bij 4 °C
D-HanksBiosharpBL559A Gebruikt voor het verdunnen van Dispase II
Dimethylsulfoxide(DMSO)SigmaD4540Gebruikt voor het verdunnen van Y27632 en SB431542
Dispase IISigmaD4693Bewaar bij -20 °C, stock op 200 mg/mL, 100x
DMEM basic (1X)GibcoC11995500BT
Ezel anti-Konijn IgG (H+L) Zeer kruisgeadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Verdun met de antilichaamverdunningsbuffer op 1:300
Dulbecco's Fosfaat-bufferoplossing (DPBS)ServicebioG4200
Absoluut ethanolHUSHI10009218VOORZICHT, Gebruik om andere ethanol verdunningen te bereiden 
VriesmicrotoomLeica
Hogesnelheid lage temperatuur molenServicebio
Omgekeerde fluorescentiemicroscoopLeica
Omgekeerde microscoopOlympus
Isopropanol HUSHI80109270
Laser Scanning Confocal Microscope FV3000OLYMPUS
Laag temperatuur hoge snelheid centrifugeEppendorf
LTF enzym-gekoppeld immunosorptie assay (ELISA) kit ElabscienceE-MSEL-M0047Bewaar bij -20 °C
Matrixgel (Matrigel)82703MogengelPortioneren en bewaren bij -20 °C
MicropipettorEppendorf
MicroplaatlezerThermo Fisher Scientific
Nuclease-vrij waterBiosharpBL510B
OCT compoundScigen4586
PBS,1× (pH7.4)ServicebioG4202
PCR versterkerBIO-RAD
Penicilline-StreptomycineBiosharpBL505A
Penicilline-Streptomycine-AmfotericineBiosharpBL142A
PerfectStart Green qPCR SuperMix kitTransGen BiotechAQ601-01-V2Bewaar bij -20 °C
PerfectStart Uni RT&qPCR KitTransGen BiotechAUQ-01Bewaar bij -20 °C
Pilocarpine AladdinP424663Bewaar bij -20 °C, 2500x
Primer AQP5  sequentie:
Forward:CATGAACCCAGCCCGATC
TT
Reverse:CTTCTGCTCCCATCCCAT
CC		Sangon Biotech
Primer K14  sequentie:
Forward:CCCACCTTTCATCTTCC
CAATT
Reverse: AAGCCTGAGCAGCATGTAGCAG		Sangon Biotech

Referenties

  1. Veernala, I., et al. Lacrimal gland regeneration: the unmet challenges and promise for dry eye therapy. Ocul Surf. 25, 129-141 (2022).
  2. Chen, X., Li, S., Zhang, Y., Ye, L. Progress and prospects in the treatment of lacrimal gland dysfunction diseases: from traditional treatment methods to stem cell and organoid therapies. Stem Cells Int. 2025, 6334284(2025).
  3. Hirayama, M., Kawakita, T., Tsubota, K., Shimmura, S. Challenges and strategies for regenerating the lacrimal gland. Ocul Surf. 14 (2), 135-143 (2016).
  4. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  5. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Transl Med. 6 (1), 88-98 (2017).
  6. Millar, T. J., Herok, G., Koutavas, H., Martin, D. K., Anderton, P. J. Immunohistochemical and histochemical characterisation of epithelial cells of rabbit lacrimal glands in tissue sections and cell cultures. Tissue Cell. 28 (3), 301-312 (1996).
  7. Oliver, C. Isolation and maintenance of differentiated exocrine gland acinar cells in vitro. In Vitro. 16 (4), 297-305 (1980).
  8. Hann, L. E., Tatro, J. B., Sullivan, D. A. Morphology and function of lacrimal gland acinar cells in primary culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (1), 145-158 (1989).
  9. Yoshida, K., et al. Serum-free medium enhances the immunosuppressive and antifibrotic abilities of mesenchymal stem cells utilized in experimental renal fibrosis. Stem Cells Transl Med. 7 (12), 893-905 (2018).
  10. Ueda, Y., et al. Purification and characterization of mouse lacrimal gland epithelial cells and reconstruction of an acinar-like structure in three-dimensional culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 1978-1987 (2009).
  11. Kobayashi, S., et al. Characterization of cultivated murine lacrimal gland epithelial cells. Mol Vis. 18, 1271-1277 (2012).
  12. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 20(2020).
  13. Bannier-Hélaouët, M., et al. Exploring the human lacrimal gland using organoids and single-cell sequencing. Cell Stem Cell. 28 (7), 1221-1232.e7 (2021).
  14. Bannier-Hélaouët, M., et al. Establishment, maintenance, differentiation, genetic manipulation, and transplantation of mouse and human lacrimal gland organoids. J Vis Exp. (192), e65040(2023).
  15. Chen, H., Huang, P., Zhang, Y. Three-dimensional, serum-free culture system for lacrimal gland stem cells. J Vis Exp. (184), e63585(2022).
  16. Wang, J., Sun, S., Deng, H. Chemical reprogramming for cell fate manipulation: methods, applications, and perspectives. Cell Stem Cell. 30 (9), 1130-1147 (2023).
  17. Rehman, A., et al. Role of small molecules as drug candidates for reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells: a comprehensive review. Comput Biol Med. 177, 108661(2024).
  18. Zhang, C., et al. Long-term in vitro expansion of epithelial stem cells enabled by pharmacological inhibition of pak1-rock-myosin II and TGF-β signaling. Cell Rep. 25 (3), 598-610.e5 (2018).
  19. An, X., et al. Novel cell culture paradigm prolongs mouse corneal epithelial cell proliferative activity in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 9, 675998(2021).
  20. Xu, L., et al. A cocktail of small molecules maintains the stemness and differentiation potential of conjunctival epithelial cells. Ocul Surf. 30, 107-118 (2023).
  21. Zeng, B., et al. Distinctive small molecules blend: promotes lacrimal gland epithelial cell proliferation in vitro and accelerates lacrimal gland injury repair in vivo. Ocul Surf. 34, 283-295 (2024).
  22. Zhou, Q., et al. inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Eng Part C Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  23. Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (3), 323-336 (2016).
  24. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of transforming growth factor-β signaling delays cellular senescence and preserves the function of endothelial cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 6 (2), 589-600 (2017).
  25. Natarajan, E., et al. A keratinocyte hypermotility/growth-arrest response involving laminin 5 and p16INK4a activated in wound healing and senescence. Am J Pathol. 168 (6), 1821-1837 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Traankliercellenserumvrije kweek2D celkweek3D celkweekkweek met kleine moleculenexpansie van epitheelcellensfero dvormingstamcelmarkerstissue engineering
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.