Visualisatie en kwantitatieve analyse van door genotoxine geïnduceerde PARP1/PARP2-activatie in cellen met behulp van een op fluorescent fusie eiwit gebaseerde reporter

Samenvatting

Hier beschrijven we een methode voor celgebaseerde visualisatie, subcellulaire lokalisatie en kwantitatieve analyse van poly(ADP-ribose) (PAR) verrijkte foci in vaste zoogdiercellen. Deze test maakt het mogelijk om plaatsen te kwantificeren van door DNA-schade veroorzaakte PARP-activatie, inclusief die geassocieerd met basenexcisieherstel of enkelstrengbreukreparatie, in de kernen van aan genotoxine blootgestelde cellen.

Samenvatting

Poly(ADP-ribose) (PAR) is een polymeer van ADP-ribose dat wordt gesynthetiseerd door vier leden van de ADP-ribose polymerasefamilie van enzymen—PARP1, PARP2, PARP5a en PARP5b. Echter, alleen PARP1 en PARP2 synthetiseren PAR als reactie op DNA-breuken. PAR wordt gedefinieerd als een eiwit post-translationele modificatie, maar het blijkt ook te bestaan als een DNA- of RNA-modificatie. De niveaus van PAR worden verder gereguleerd door PARG, een PAR-glycohydrolase die, samen met PARP1 en PARP2, het cellulaire niveau van door DNA-schade veroorzaakte PAR moduleert. De dynamische synthese en degradatie van PAR is cruciaal voor de regulerende rol ervan bij DNA-reparatie en de DNA-schaderespons, die op zijn beurt de reorganisatie, replicatie, transcriptie en celdood beïnvloedt. PARP1/PARP2 activatie en de ophoping van PAR kunnen worden beschouwd als plaatsen van voortdurende basisexcisie-reparatie of DNA-enkelstrengbreukreparatie; echter, talrijke PARP1/PARP2-activatoren zijn ook geassocieerd met replicatiestress en andere DNA-metabole processen. Eenmaal gevormd faciliteren PAR-ketens de rekrutering van DNA-reparatie- en DNA-schaderespons (DDR)-factoren op plaatsen van DNA-schade of genomische insult via hun PAR-bindende domeinen (PBD's). Tien verschillende PBD's herkennen verschillende regio's van het PAR-molecuul, waaronder het PAR-bindende motief, PAR-bindende zinkvinger, het WWE-domein en het macrodomein, naast andere PBD's. Om cellulaire analyse van PAR-dynamica te vergemakkelijken, gebruikten we PBD's die zijn gefuseerd met enhanced green fluorescent protein (EGFP) om celgebaseerde kwantificatie van PAR-foci te optimaliseren. We beschrijven een assay die een fragment van RNF146 gebruikt dat codeert voor het PBD/WWE-domein, gekoppeld aan EGFP, om de ophoping van PAR te visualiseren en te kwantificeren op locaties van genomische insult en lopende BER of SSBR. We beschrijven experimentele stappen, waaronder de productie van lentivirale deeltjes, transductie van de doelcellijn, behandeling van zoogdiercellen om genomische DNA-schade te induceren, het verkrijgen van confocale fluorescentiemicrografieën en semi-geautomatiseerde kwantificering van de gegevens.

Inleiding

Dit protocol beschrijft de LivePAR-assay, die visualisatie en kwantitatieve analyse van poly(ADP-ribose) (PAR) op plaatsen van genomische insult mogelijk maakt, voornamelijk geassocieerd met basisexcisieherstel (BER) of enkelstrengbreukreparatie (SSBR), in zoogdiercellen ^1,2,3. BER is een cruciale DNA-reparatieroute die beschadigde of gemodificeerde basen uit DNA verwijdert (voor reviews over BER en PARylatie, zie 4,5,6,7). BER begint met DNA-glycosylasen die gemodificeerde basen⁴ herkennen en verwijderen, waardoor een apurine/apyrimidinische (AP) plaats overblijft, bijvoorbeeld methylpurineglycosylase (MPG), die gemethyleerde basen ^8,9 uitschakelt, of 8-oxoguanineglycosylase (OGG1), die 8-oxoG ^9,10 exciseert. AP-plaatsen worden vervolgens gespleten door AP-endonuclease 1 (APE1)11,12,13, waardoor een snee in de DNA-ruggengraat ontstaat. Een polymerase, namelijk DNA-polymerase β (Polβ)^14,15, past de kloof aan en vult de kloof op met behulp van de onbeschadigde streng als sjabloon, en tenslotte sealen DNA-ligasen de gerepareerde streng^16,17, bijvoorbeeld DNA-ligase I of DNA-ligase III.

Belangrijke spelers in BER en SSBR zijn poly(ADP-ribose) polymerasen 1 en 2 (PARP1/PARP2)18,19,20, enzymen die snel DNA-strengbreuken detecteren tijdens BER of SSBR. Bij het detecteren van deze breuken katalyseert PARP1/PARP2 de toevoeging van ADP-ribosepolymeren aan zichzelf en andere eiwitten — een proces genaamd PARylatie (voor review, zie⁶) — door NAD⁺ te hydrolyseren. Dit creëert een dynamische eiwitsteiger (PAR) die andere DNA-reparatiefactoren naar de beschadigde plaats trekt, waardoor de nauwkeurigheid van DNA-reparatie wordt verbeterd. Om deze dynamische PAR-steiger te beheersen, dragen verschillende eiwitten bij aan de hydrolyse en verwijdering van PAR-ketens, waaronder ADP-ribose-acceptor hydrolase 3 (ARH3), terminale ADP-ribose glycosylhydrolase 1 (TARG1), mono-ADP-ribosylhydrolase 1/2 (MacroD1/2) en poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG)6,21,22,23,24,25,26 . PARG is echter primair verantwoordelijk voor dit proces^21,27 en speelt een cruciale rol in de DNA-schaderespons (DDR)^28,29.

PARG is daarom kritisch verbonden met de functie van PARP1 en PARP2. Terwijl PARP1 en PARP2 de PAR-polymeren creëren, fungeert PARG als een "clean-up" enzym, dat deze polymeren hydrolyseert en PARylatie^30,31 effectief omkeert. Dit proces is essentieel om zowel BER als SSBR te voltooien en om PARP1/PARP2 te laten recyclen om te reageren op nieuwe DNA-schade. Bijgevolg werken PARP1, PARP2, PARylatie en PARG op een gecoördineerde manier, wat zorgt voor efficiënte en omkeerbare DNA-reparatie via BER en SSBR ^4,6.

De mate van PARylatie kan door verschillende factoren worden beïnvloed en speelt een essentiële rol in de algehele DNA-schaderespons³². Deze factoren omvatten blootstelling aan genotoxinen die adducten toevoegen aan DNA-basen, zoals N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), methylmethaansulfonaat (MMS), waterstofperoxide (H2_O2) of tert-butylhydroperoxide (tBuOOH). Verder kan de mate van PARylatie worden beïnvloed door moleculen die het PARylatieproces moduleren, zoals dihydronicotinamide riboside (NRH), een voorloper van NAD⁺, die de activatie van PARP verhoogt door het NAD⁺-niveau te verhogen, of FK866, een remmer van NAMPT, die de NAD^+-niveaus kan verlagen en PARP-activatie³ negatief kan reguleren. Ten slotte kunnen genetische mutaties of kleine molecuulremmen van enzymen zoals PARP1/PARP2, PARG of andere DNA-reparatie-eiwitten (bijv. defecten in BER of homologe recombinatiefactoren zoals BRCA1/BRCA2) de activatie van PARP veranderen 33,34,35,36.

De LivePAR-test maakt gebruik van een fragment van het ringvingereiwit 146 (RNF146) dat codeert voor een WWE-domein (aminozuren 100–182), gekoppeld aan een versterkt groen fluorescentie-eiwit (EGFP)³. Het WWE-domein is een bolvormige domein genoemd naar de geconserveerde residuen tryptofaan (W) en glutamaat (E) in zijn bindingsplaats³⁷. WWE-domeinen binden aan iso-ADP-ribose, de kleinste interne structurele eenheid binnen PAR-ketens^38,39. RNF146 is een E3 ubiquitine-ligase die iso-ADP-ribose^38,40 herkent en waarvan wordt gerapporteerd dat het eiwitten die betrokken zijn bij BER (XRCC1, DNA-ligase III en PARP1) aanpakt voor proteasomale afbraak⁴¹. Door dit WWE-domein aan EGFP te koppelen, kan visualisatie en detectie van door genotoxine geïnduceerde PARylatieplaatsen in zoogdiercellen mogelijk zijn. In dit protocol beschrijven we de generatie van stabiele cellijnen die de LivePAR-reporter tot expressie brengen (Figuur 1A), de inductie van DNA-schade om PARP1/PARP2 te activeren, de productie van PAR en de verwerving en analyse van confocale fluorescentiemicroscopiegegevens (Figuur 1).

Het pMD2.g(VSVG) plasmide levert het virale envelope glycoprotein (VSVG), dat het bereik van cellen dat het virus kan infecteren vergroot ten opzichte van het native lentivirus-envelope-eiwit. Het pRSV-REV-plasmide levert het regulerende element (REV) eiwit, dat een cruciale transactivator is die bindt aan het virale RNA en de transcriptie van de virale genen activeert; Het is essentieel voor efficiënte virale replicatie. Het pMDLg/pRRE-plasmide biedt verschillende belangrijke interne verpakkingscomponenten, namelijk gag, dat codeert voor de matrix (MA), capside (CA) en nucleocapside (NC) eiwitten, pol, dat codeert voor de enzymen die nodig zijn voor virale replicatie en integratie in het genoom van de gastheercel, en het RNA-regulerend element (RRE), een RNA-element dat de efficiëntie van virale RNA-vertaling en genomische RNA-verpakking verbetert. Het pLV-EF1A-LivePAR-Hygro plasmide (Figuur 1A) bevat cDNA dat codeert voor het versterkte groene fluorescentie-eiwit (EGFP) dat is samengevoegd met het C-terminus van het WWE-domein van RNF146 (aminozuren 100–182), een eiwitdomein dat bindt aan poly(ADP-ribose) ketens, en de vector codeert ook voor een hygromycine-resistentiecassette. Het virus wordt geïsoleerd uit de celkweeksupernatant en kan worden opgeslagen bij -80 °C of direct worden gebruikt voor transductie (Figuur 1B).

Protocol

1. Lentivirusproductie

OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van een lentiviraal verpakkingssysteem^{van de derde generatie 42,43} om cellen te genereren die een genetisch gecodeerde PAR-reporter tot expressie brengen. Lentivirale deeltjes worden geproduceerd in cellen van 293 voet met behulp van een vier-plasmidesysteem bestaande uit enveloppen-, regulatie- en verpakkingscomponenten, samen met het pLV-EF1A-LivePAR-Hygro-construct dat codeert voor een EGFP-gelabelde WWE-domein van RNF146, dat poly(ADP-ribose) ketens bindt. Het resulterende virus wordt gebruikt om stabiele cellijnen te genereren voor visualisatie en kwantificering van de PAR-accumulatie.

1. Kweek low passage 293FT cellen in DMEM met 10% FBS en 1% Pen/Strep in een bevochtigde atmosfeer van 37 °C en 5%_CO2. Zorg ervoor dat de cellen van 293 voet niet langer dan 3 weken in cultuur zijn geweest.
   OPMERKING: We gebruiken routinematig cellen van 293 voet met passagenummers tussen 3 en 10. 293FT-cellen werden getransformeerd en vereeuwigd door het SV40 grote T-antigeen. Deze cellen hebben een hoge transfectie-efficiëntie, wat essentieel is voor de productie van recombinante eiwitten en genexpressiestudies. Ze reageren goed op zowel lipide-gebaseerde transfectie- als virale transductiemethoden.
2. Plaat 1,7 × 10⁵ cellen van 293 voet op een 60 mm weefselkweekschotel in een eindvolume van 5,5 mL kweekmedium op dag 1. Breng cellen terug naar de broedmachine voor 24 uur.
3. Op dag 2 (de dag van transfectie) voeg je 375 μL FBS- en Pen/Strep-vrij DMEM-medium toe aan een 1,5 mL steriele microcentrifugatiebuis. Voeg vervolgens 10 μL van een lipide-gebaseerd transfectiereaktia, 4 μg van het pLV-EF1A-LivePAR-Hygro-plasmide, 2 μg van het pMD2.g(VSVG)-plasmide, 2 μg van het pRSV-REV-plasmide en 2 μg van het pMDLg/pRRE-plasmide toe. Tik voorzichtig op de microcentrifugatiebuis om het medium, het transfectie-reagens en plasmide-DNA te mengen (vortexvorming vermijden). Incubeer 15–30 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van DNA/transfectie-reagenscomplexen mogelijk te maken.
4. Voeg het plasmide/transfectie-reagensmengsel toe aan de 60 mm schaal met de 293FT cellen die getransfecteerd moeten worden, zonder het medium druppelgewijs te verwijderen. Breng de cellen 48 uur terug naar de broedmachine.
   OPMERKING: Deze periode maakt de productie en afgifte van lentivirale deeltjes in het groeimedium mogelijk.
5. Op dag 4 verzamel je het kweekmedium van de getransfecteerde 293FT-cellen om de lentivirusdeeltjes te isoleren. Filter door een steriel 0,45 μm filter om celresten van de lentivirale deeltjes te scheiden.
6. Bepaal de lentivirustiter met beschikbare reagentia (optioneel).
   OPMERKING: Deze methode levert doorgaans 10⁵ tot 10⁶ infectieuze eenheden per mL (IFU/mL) op, wat correleert met een benaderende multipliciteit van infectie (MOI) van ~5 wanneer gebruikt zoals beschreven in de transductiestap hieronder.
7. Aliquot het medium met de lentivirusdeeltjes in vier steriele cryovials (1,0 mL per buis) en bewaar bij -80 °C.

2. Transductie

OPMERKING: Deze sectie beschrijft het lentivirale transductieprotocol dat wordt gebruikt om een transgeen in cellijnen te introduceren (Figuur 1B). Het is consequent effectief geweest in ons lab 1,3,33,37,44,45.

1. Kweek een cellijn naar keuze (laag doorgangsgetal) in het juiste medium in een bevochtigde atmosfeer bij 37 °C en 5%_CO2.
   OPMERKING: Begin met een vroege passage van het benodigde celtype. Een nieuw flesje met cellen moet minstens één keer worden ontdooid en doorgevoerd voordat het wordt ingezaaid voor transductie.
2. Op dag 1 zaad 1 × 10⁵–1,5 × 10 5-cellen per put, op elke put van een 6-put plaat in 2 mL groeimedium. Breng de cellen 24 uur terug naar de couveuse.
3. Op dag 2 (de dag van transductie) zorg ervoor dat de cellen tussen 20% en 40% samenvloeien. Voeg 1 ml virus, 1 ml groeimedium en 2 μL polybreen (2 mg/mL voorraad) toe aan een 15 mL conische buis en meng voorzichtig door inversie (vermijd vortexen).
   OPMERKING: Polybreen wordt gebruikt tijdens lentivirustransductie om elektrostatische afstoting tussen de virusdeeltjes en het celmembraan te voorkomen. Omdat polybreen positief geladen is, reageert het met de negatief geladen virale glycoproteïnen en neutraliseert hun lading. Bovendien bindt polybreen aan glycosaminoglycanen in het celkweekmedium, waardoor hun interactie met het virus wordt voorkomen. Polybrene verbetert daarom de transductie-efficiëntie aanzienlijk.
4. Verwijder het groeimedium van de 6-put plaat en voeg het virus/media/polybreen-mengsel toe aan elke put. Plaats de cellen met het transductiemengsel in een broedmachine met een bevochtigde atmosfeer van 32 ^°C en 5%_CO-2 gedurende 16–18 uur.
   OPMERKING: Het incuberen van cellen bij 32 °C 's nachts tijdens lentivirale transductie is een veelvoorkomende, maar niet essentieel, praktijk die de effectiviteit van virale infecties aanzienlijk verhoogt. Het verlagen van de temperatuur vertraagt de cellulaire stofwisseling, waardoor de cellulaire verdediging afneemt en de vatbaarheid voor virale infecties toeneemt.
5. Op dag 3 vervang je het medium van de virustransduceerde cellen door nieuw medium en verplaats je ze naar een incubator van 37 °C. Incubeer 48 uur.
   OPMERKING: Deze 2 dagen zijn voldoende voor de cellen om het RNF146(100–182)-EGFP-transgeen te produceren en resistent te worden tegen hygromycine.
6. Om de resulterende polyklonale stabiele cellijnen te ontwikkelen die het RNF146(100–182)-EGFP-transgen tot expressie brengen, start vervolgens hygromycineselectie na 2 dagen incubatie zoals aangegeven in stap 2.5.
   1. Alternatief breid deze populatie van getransduceerde cellen uit bij afwezigheid van hygromycine en gebruik deze voor PAR-analyse gedurende de volgende 10–14 dagen (transiënte transductie), zoals eerder beschreven¹.
7. Breng de cellen over op een plaat van 100 mm zodra ze groeien in aanwezigheid van hygromycine en zet zoveel uit als nodig is.
8. Bereid cryovoorraden van de getransduceerde cellen voor voor toekomstig gebruik.
9. Valideer de expressie van het RNF146(100–182)-EGFP transgen met confocale microscopie zoals beschreven in sectie 3. Het RNF146(100–182)-EGFP-transgeen zal door de hele cel worden tot expressie gebracht.
10. Valideer de expressie van het RNF146(100–182)-EGFP-transgeen door immunoblotting, zoals elders beschreven ^1,37.

3. Confocale microscopie en analyse

OPMERKING: Dit deel van het protocol beschrijft de voorbereiding van coverslips, het zaaien van de LivePAR-expressieve cellen, blootstelling aan behandelingen (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi en/of NRH), en de voorbereiding van vaste cellen op microscoopglaasjes voor confocale beeldvorming en PAR-foci-analyse (Figuur 1C). Het beschrijft ook het gebruik van ImageJ-software en een aangepaste macro voor de semi-geautomatiseerde kwantificering van PAR-focussen. Dit protocol kan worden gebruikt om de invloed van verschillende factoren (bijv. kleine moleculen, BER-eiwitknockouts) op DNA-schade-afhankelijke PARylatie te onderzoeken en is met succes toegepast in ons laboratorium^34,37.

1. Voorbereiding van de dekmantel
   1. Laat 20 × 20 mm dekfolies 20 minuten weken in diethylether in een glazen container in een afzuigkap.
      OPMERKING: Gebruik een dampafzuigkap bij het werken met diethylether vanwege de brandbaarheid en mogelijke gevaren.
   2. Verwijder de diethylether en was de dekfolies bij afnemende concentraties ethanol [100%, 70%, 50%, dan 0% (ddH₂O)].
   3. Verwijder het water en laat de dekfolies 20 minuten weken in 1 N HCl met zachte roering.
   4. Verwijder de HCl en was de coverslips 3x met ddH₂0.
   5. Bewaar de dekfolies in 70% ethanol bij 4 °C tot gebruik.
2. Plating van cellen
   1. Plaats twee steriele dekfolies van 20 × 20 mm in een 60 mm celkweekschotel naast elkaar. Bereid zoveel gerechten voor als nodig is voor het experiment. Zorg ervoor dat alle ethanol verdampt is voordat je cellen toevoegt aan de schaal met de dekfolie. Spoel eventueel restanten van ethanol weg door steriele PBS aan het gerecht toe te voegen gedurende 10–15 minuten; verwijder PBS voordat je de cellen zaadt.
   2. Zaad 200.000 LivePAR-expressieve cellen per celkweekschotel. Laat de cellen 24–36 uur aan de dekfolies hechten, conditioneer het medium en begin met repliceren (groeien).
3. Inductie van PAR-brandpunten
   1. Blootstel de LivePAR-expressieve cellen aan 100 μM NRH, 10 μM PARGi en 10 μM MNNG of 40 μM tBuOOH. Daarnaast moet je om te testen op PARP1/PARP2-afhankelijke PAR-vorming PARP1/PARP2 remmen door 10 μM PARPi toe te voegen. Voeg verbindingen direct toe aan het medium met de cellen op de dekfolies en draai het medium voorzichtig in de celkweekschalen om de verbindingen te verdelen. Incubeer de 60 mm schalen op 37 °C gedurende 60–90 minuten.
      OPMERKING: NRH wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat er voldoende niveaus cellulair NAD⁺ beschikbaar zijn voor optimale PARP1/PARP2-gemedieerde PARylatie 33,46,47. PARGi wordt gebruikt om te voorkomen dat de PAR-ketens die door PARP1/PARP2 worden gesynthetiseerd, door PARG worden afgebroken. MNNG of tBuOOH wordt gebruikt om DNA-basismodificaties te induceren om BER te initiëren, wat leidt tot de activatie van PARP1/PARP2. PARPi wordt gebruikt om te bevestigen dat het signaal (brandpunten) voortkomt uit de activatie van PARP1/PARP2.
4. Fixatie van cellen en montage van de dekfolies
   1. Verwijder het medium en was met PBS.
      OPMERKING: Een of twee keer wassen met PBS is belangrijk, omdat het medium dat wordt gebruikt om cellen te kweken een hoge concentratie serumeiwitten bevat. Wassen met PBS verwijdert ook eventuele resterende MNNG of tBuOOH die nog in het medium zitten.
   2. Prefixe 4% formaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was cellen 3x met PBS.
   3. Fix het door 3 mL koude (-20 ^°C) methanol: aceton (7:3) aan de cellen toe te voegen. Plaats de gerechten 9 minuten op -20 ^°C.
   4. Verwijder methanol: aceton. Was 3 keer met PBS.
   5. Pipette 15 μL antifade-medium met DAPI op de glazen schuilplaatsen. Bevestig de coverslips voorzichtig op de plek van het montagemedium met de cellen naar binnen gericht, zodat de bubbels worden geminimaliseerd.
   6. Centreer, bevestig en dicht de zijkanten van de dekfolie aan de glazen glijbaan door een kleine hoeveelheid transparante topcoat nagelemaille aan te brengen op de zijkanten van de dekfolie. Leg de dia's in het donker zodat het nagelglazuur van de topcoat kan drogen (~10 min). Bewaar de dia's in het donker op 4 °C tot ze klaar zijn om te fotograferen.
5. Beeldvormende cellen
   1. Beeld alle dia's minstens 10x bij 63× vergroting, met behulp van een confocale microscoop. Detecteer PAR-foci met de 488 nm laser en nucleaire kleuring (DAPI) met de 405 nm laser (zie bijvoorbeeld Figuur 2).
6. Analyse van confocale beelden
   1. Maak een tekstbestand met de volgende tekst en noem het "LivePAR_Macro". Deze macro faciliteert de "automatische" kwantificatie van PAR-foci in de kernen van de LivePAR-expressieve cellen:
      macro "DAPI positieve kleuring [1]" {
      tit=getTitle();
      run("Duplicate...", "title=DAPI duplicate");
      selectWindow("DAPI")
      run("8-bit");
      run("Split Channels")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      close();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run("Gaussian Blur...", "Sigma=3");
      setAutoThreshold("Default");
      run("Make Binary");
      run("Invert")
      run("Vul Gaten")
      run("Watershed")
      run("Analyze Particles...", "size=50.00-Infinity circularity=0.00-1.00 show=Outlines toevoegen, uitsluiten, insluiten in_situ");
      hernoemen("DAPI_"+tit);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      close();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode (waar);
      run("8-bit");
      t=getTitle();
      run("Duplicate...", "title=GB1 duplicate");
      run("Duplicate...", "title=GB20 duplicate");
      selectWindow("GB20")
      run("Gaussian Blur...", "straal=20 stapel");
      selectWindow("GB1");
      run("Gaussian Blur...", "straal=1 stack");
      imageCalculator("Aftrekken create stack", "GB1", "GB20");
      selectWindow("GB1");
      close();
      selectWindow ("GB20");
      close();
      selectWindow ("Resultaat van GB1");
      hernoemen("Blank_GB1-GB20_"+t);
      titel = getTitle();
      run("Split Channels")
      selectWindow("C1-"+titel);
      close();
      selectWindow("C2-"+titel);
      setThreshold(90,255) //de 90-waarde kan worden aangepast om rekening te houden met experimentele variabiliteit
      run("Analyze Particles...", "size=0.00-200 circulariteit=0.00-1.00 show=Maskers vatten samen");
      dicht ("C2-"+titel);
      selectWindow("Mask of C2-"+titel);
      dichtbij ();
      setBatchMode(false);
      }
   2. Download en installeer ImageJ op de computer (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. Open ImageJ en installeer de macro (tekstbestand: LivePAR_Macro) door op Plugins | te klikken Macro's | Installeer.
   4. Open alle confocale bestanden in ImageJ en sla ze op als *.tif-bestanden om de originele bestanden te behouden.
   5. Open een spreadsheetdocument en sla het op als [date]_[Cellijn]_Foci Analyse.
   6. Analyseer één *.tif bestand tegelijk. Druk op 1 om de kernen te vinden; wanneer een venster met de titel ROI Manager opent, selecteer dan alle vermeldingen in het venster en druk op toevoegen om het kerngebied over de originele afbeelding te leggen. Verwijder verkeerd geïdentificeerde kernen. Teken de kern met het vrijhandse selectiegereedschap en druk op 2 om de PAR-foci te kwantificeren.
      OPMERKING: Neem geen kernen mee die niet volledig binnen het kader vallen.
   7. Selecteer elke kern één voor één in de ROI-manager en druk op 2. Er zal een telling verschijnen die het aantal brandpunten binnen de geselecteerde kern aangeeft. Zodra de brandpunten in alle kernen van het bestand zijn gecorsticeerd, kopieer en plak je de informatie in het geopende spreadsheetdocument.
   8. Herhaal stappen 3.6.6 en 3.6.7 met alle *.tif bestanden.
   9. Plot PAR-foci per kern in de software van keuze (zie bijvoorbeeld Figuur 3).

Resultaten

Cellen die de LivePAR-probe tot expressie brengen, kunnen worden gegenereerd door het produceren van een lentivirus dat codeert voor het RNF146(100-182)-EGFP fusie-eiwit (Figuur 1A). Cellen kunnen worden geëvalueerd na tijdelijke expressie tot twee weken na transductie of als stabiele cellijnen na selectie in hygromycine (Figuur 1B)¹. Na de behandeling met genotoxine kunnen door DNA-schade veroorzaakte PA...

Discussie

De LivePAR-assay is ontwikkeld om locaties van nucleaire genomische DNA-schade te detecteren waar PARP1/PARP2 actief PAR-ketens synthetiseert. Om dit te bereiken werd een fragment van RNF146, dat codeert voor het WWE-domein (aminozuren 100–182), gefuseerd met EGFP 1,2,3,37. Extra PAR-probes die we hebben beschreven, coderen EGFP die gefuseerd zijn met aminozuur...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagents, Chemicals, and Peptides
0.45 µm Durapore steriflip filters	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
20 x 20 mm Microscope coverslips	Thermo Fisher Scientific	Cat# 22-170-371
Acetone	Thermo Fisher Scientific	Cat# A18-1
Cell culture dishes, 100 mm	VWR	Cat# 25382-166
Cell culture dishes, 60 mm	Fisher Scientific	Cat# 430166
Cell culture plates, 6-well	VWR	Cat# 62406-161
Cryovials, 2 mL	VWR	Cat# 89499-722
Diethyl ether	Thermo Fisher Scientific	Cat# 60-29-7
Dimethyl sulfoxide	Thermo Fisher Scientific	Cat# BP231-1
Disposable sterile filters, 0.45 µm	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
DMEM	Corning	Cat# 15-017-CV
Ethanol, 200 proof	Decon Labs	Cat# 2701
Glass microscope slides	Thermo Fisher Scientific	Cat# 12-544-4
Heat-inactivated fetal bovine serum	Atlanta Biologics	Cat# S11150
Hydrochloric acid	Thermo Fisher Scientific	Cat# A144-212
Hygromycin	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10687010
Large Kim Wipes	Kimberly-Clark	Cat# 34256
Lenti-X GoStix Plus Kit	Takara	Cat# 631280
Methanol	Thermo Fisher Scientific	Cat# A452SK-4
MNNG	Molport	Cat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihydroxy-5-(hydroxymethyl) tetrahydrofuran-2-yl]-4H-pyridine-3-carboxamide)	Marie Migaud of NuChem Sciences Inc
PARG inhibitor (PDD00017273)	Sigma-Aldrich	Cat# SML1781
PARPi inhibitor (Veliparib, ABT-888)	MedChemExpress	Cat# HY-10129
Penicillin/streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Polybrene	Sigma-Aldrich	Cat# TR-1003-G
tBuOOH	Thermo Fisher Scientific	Cat# 180345000
TransIT-x2 (Transfection reagent)	Mirus	Cat# MIR-6006
Triton-X100	VWR	Cat# 0694
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25200-056
Vectashield (H-1000) anti-fade mounting medium	Thermo Fisher Scientific	Cat# NC1695563
Cell lines
293-FT	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
(derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen)	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
LN428	Generous gift from	N/A
(Human glioblastoma tumor cell line)	Dr. Ian Pollack (University of Pittsburgh)	N/A
RPE-1	ATCC	Cat# CRL-4000
(human hTERT-immortalized retinal pigment epithelial cells)	ATCC	Cat# CRL-4000
U2OS	ATCC	Cat# HTB-96
(Human osteosarcoma cell line)	ATCC	Cat# HTB-96
Recombinant DNA
pMDLg/pRRE	Lab stock# 253	Addgene, Cat# 12251
pRSV-Rev	Lab stock# 254	Addgene, Cat# 12253
pMD2.G	Lab stock# 252	Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR is the WWE domain of RNF146, amino acid residues 100-182, fused to EGFP; contains a Hygromycin resistance cassette)	Lab stock# 1727	Addgene, Cat# 176063
Software and Algorithms
Adobe Illustrator (for preparation of figures)	Adobe Systems	Version 2024
GraphPad Prism	GraphPad	Version 10.5.0 (Mac OS X)
ImageJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html