Methodenartikel

Een geoptimaliseerd protocol voor Candida albicans-infectie in Schmidtea mediterranea om schimmelpathogenese en gastheerverdediging te bestuderen

DOI:

10.3791/70500

⸱

17 april 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Health Sciences Research Institute, University of California, Merced, 4Center for Cellular and Biomolecular Machines, University of California, Merced

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde, gedetailleerde gids voor het gebruik van de planarian Schmidtea mediterranea als modelsysteem om gastheer-pathogeen interacties tijdens schimmelinfecties te bestuderen. De methode bouwt voort op de vorige procedure voor het infecteren van planarians met de menselijke schimmelziekteverwekker Candida albicans, en biedt gedetailleerde richtlijnen om de reproduceerbaarheid en experimentele consistentie te verbeteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans is een veelvoorkomend opportunistisch schimmelpathogeen dat asymptomatisch de meeste mensen koloniseert. Hoewel het meestal een goedaardige commensale is, kan dysbiose veroorzaakt door antibioticagebruik, immuunstoornissen of verstoring van de epitheelbarrière schimmelovergroei en infectie veroorzaken, variërend van oppervlakkige mucosale aandoeningen tot levensbedreigende systemische candidiasis. Nieuwe preklinische infectiemodellen zijn nodig om de pathogenese van C. albicans in vivo te dissecten over verschillende infectiestadia en met verschillende meetbare gastheeruitkomsten. De planarian Schmidtea mediterranea was eerder vastgesteld als een gastheer van ongewervelden voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties tijdens C. albicans-infectie . S. mediterranea is volledig afhankelijk van geconserveerde aangeboren immuunmechanismen die in staat zijn infecties met pathogene micro-organismen, waaronder bacteriën en schimmels, te overwinnen. De opmerkelijke regeneratieve capaciteit van planarianen en toegankelijke stamcelpopulaties maken dit organisme tot een hanteerbaar model om vroege immuunreacties, weefselherstel en het verwijderen van ziekteverwekkers in vivo te analyseren. Dit model ondersteunt gelijktijdige analyse van schimmelvirulentie en transcriptieresponsen van de gastheer en biedt waardevolle inzichten in infectiedynamiek. Hier is een bijgewerkt protocol gepresenteerd met gedetailleerde aanpassingen, gestandaardiseerde procedures en geoptimaliseerde stappen voor het infecteren van S. mediterranea met C. albicans , ontworpen om de reproduceerbaarheid te verbeteren en systematische studies van schimmelpathogenese en gastheerverdediging mogelijk te maken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans is een veelvoorkomend opportunistisch schimmelpathogeen dat asymptomatisch 50-70% van de mensen koloniseert 1,2,3. Typisch kan een onschuldige commensal, C. albicans, overgroeien onder omstandigheden zoals microbiota-disbalans, antibioticagebruik, immunosuppressie, verstoornis van de epitheelbarrière of de aanwezigheid van medische hulpmiddelen, wat kan leiden tot ziekten variërend van oppervlakkige mucosale infecties tot levensbedreigende systemische candidiasis 4,5. Bij immuungecompromitteerde personen – waaronder mensen met HIV/AIDS, patiënten die chemotherapie of immunosuppressieve therapieën ondergaan, personen met chronische ziekten of patiënten op intensive care – kan de sterftecijfers boven de 70% uitkomen, wat de aanzienlijke volksgezondheidslast van invasieve candidiasis 6,7,8 benadrukt. Wereldwijd treffen invasieve schimmelinfecties jaarlijks meer dan 6,5 miljoen mensen, waarbij de directe zorgkosten in de Verenigde Staten alleen al meer dan 8 miljard dollar per jaar bedragen voor Candida-gerelateerde infecties 9,10. Ondanks beschikbare antischimmelbehandelingen zijn de morbiditeit- en sterftecijfers die samenhangen met C. albicans-infecties decennialang grotendeels onveranderd gebleven, wat de dringende noodzaak benadrukt om de interacties tussen gastheer en pathogeen bij schimmelziekten beter te begrijpen.

C. albicans maakt gebruik van een divers repertoire aan virulentiefactoren die kolonisatie, persistentie en pathogenese ondersteunen in diverse gastheeromgevingen. Deze omvatten adhesie aan gastheerweefsels, immuunontwijking, celwandremodelering, secretie van hydrolytische enzymen, morfologische plasticiteit en biofilmvorming 11,12,13,14,15,16. Gezamenlijk stellen deze eigenschappen C. albicans in staat zich aan te passen aan diverse gastniches, immuunresponsen te moduleren en resistente therapieën te weerstaan 16,17,18,19,20,21. Het verduidelijken hoe deze processen infectieuitkomsten beïnvloeden – waaronder morbiditeit van de gastheer, sterfte en het verwijderen van ziekteverwekkers – is essentieel voor het ontwikkelen van effectievere preventieve en therapeutische strategieën.

Om deze gastheer-pathogeen dynamiek te onderzoeken, hebben we een modelsysteem opgesteld met de planaire Schmidtea mediterranea als gastheer 22,23,24. Dit model dient als een veelzijdig platform voor het bestuderen van de multisysteemgastheerrespons op schimmelinfecties, waarbij een op inwekking gebaseerde infectiemethode wordt gebruikt die gelijktijdige blootstelling van dieren aan C. albicans mogelijk maakt. De volgende sectie presenteert bijgewerkte stapsgewijze procedures die dit protocol verfijnen, reproduceerbaarheid verbeteren en consistente implementatie in laboratoria faciliteren.

Planarians zijn vrijlevende ongewervelden met een uitzonderlijk regeneratievermogen, in staat om snel weefsels te vervangen die verloren zijn gegaan door letsel of infectie25. Ze missen een adaptief immuunsysteem en vertrouwen volledig op geconserveerde aangeboren verdedigingen – waaronder patroonherkenningsreceptoren, antimicrobiële peptiden, slijmafscheiding en fagocytaire cellen – om bacteriële en schimmelpathogenen binnen dagen 26,27,28,29 te verwijderen. Omdat aangeboren immuniteit de eerste verdedigingslinie vormt bij eukaryoten en buiten zoogdiersystemen nog onderbelichtis, bieden planarianen de mogelijkheid om deze processen in vivo te onderzoeken met cellulaire en moleculaire resolutie. Hun regeneratieve vermogen wordt aangedreven door volwassen pluripotente stamcellen, bekend als neoblasten, die ongeveer 30% van de volwassen cellen uitmaken en bijdragen aan herstel na infectie23,30. Deze kenmerken maken S. mediterranea tot een krachtig model om ziekteverwekkersvirulentie en gastheerverdediging te analyseren op genetische, cellulaire, weefsel- en organismale schaal, waardoor we vragen kunnen beantwoorden die vaak moeilijk te bestuderen zijn met traditionele zoogdiersystemen.

Bovendien ondersteunen de kleine omvang van planarianen (meestal enkele millimeters lang), lage kosten en onderhoudsgemakgrootschalige experimenten terwijl ze de financiële, ethische en regelgevende beperkingen die inherent zijn aan gewervelde modellen vermijden. Net als C. albicans is S. mediterranea genomisch hanteerbaar, met een volledig gesequenced en geannoteerd genoom, en ondersteunt het geavanceerde moleculaire en cellulaire technieken – waaronder transcriptieprofilering, hoogresolutie immunohistochemie en histologie, en robuuste RNA-interferentie (RNAi)32,33,34,35,36,37,38. Deze tools maken parallelle analyse van gastheer- en pathogeenreacties tijdens infectie mogelijk.

Verschillende alternatieve preklinische modellen zijn gebruikt om schimmelinfecties te bestuderen. Ongewervelde gastheren zoals Galleria mellonella (wasmot), Caenorhabditis elegans (rondworm) en Drosophila melanogaster (fruitvlieg), evenals de gewervelde Danio rerio (zebravis), bieden elk duidelijke experimentele voordelen maar hebben ook opmerkelijke beperkingen. Deze systemen zijn vaak afhankelijk van overleving als primaire eindpunt, omdat infecties snel de dood van de gastheer veroorzaken, waardoor gedetailleerde beoordeling van morbiditeit, herstel en multisysteemreacties wordt verhinderd – kenmerken die het planarianmodel gemakkelijk vastlegt.

Zoogdiermodellen zoals Mus musculus (muis), Rattus norvegicus (rat), Oryctolagus cuniculus (konijn) en Cavia porcellus (cavia) recapituleren de menselijke fysiologie nauwkeuriger, maar worden beperkt door hoge kosten, kleine cohortgroottes, ethische en regelgevende eisen, en de uitdaging om aangeboren van adaptieve immuunresponsen te onderscheiden. Bovendien hebben decennia van schimmelpathogenese onderzoek bij muizen zich voornamelijk gericht op een systemische infectie in een laat stadium 39,40,41,42,43, waarbij vaak vroege gebeurtenissen zoals verstoring van de epitheliale barrière en overgroei van het slijmvlies – de meest voorkomende wegen van het ontstaan van schimmelziekten bij mensen – over het hoofd worden gezien.

Het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties is daarom essentieel om de biologische processen te begrijpen die ten grondslag liggen aan schimmelvirulentie, gastheerverdediging en ziekteprogressie. Invasieve schimmelinfecties vormen een toenemende wereldwijde bedreiging, waarbij meerdere soorten nu resistentie vertonen tegen alle belangrijke antischimmelgeneesmiddelklassen. Er wordt geschat dat meer dan 1 miljard mensen getroffen zijn door schimmelinfecties, en factoren zoals klimaatverandering, wijdverbreid gebruik van antimicrobiële middelen en het toenemende aantal immuungecompromitteerde personen versnellen de opkomst van antischimmelresistente ziekteverwekkers 47,48,49,50. Begrijpen hoe pathogene schimmels hun gastheren koloniseren en ermee interageren is cruciaal voor het ontwikkelen van nieuwe preventieve en therapeutische strategieën.

Het volgende beschrijft een herzien en gestandaardiseerd systeem infectieprotocol voor interacties tussen S. mediterranea en C. albicans, ontworpen om reproduceerbaarheid te bevorderen en systematisch onderzoek naar schimmelpathogenese en gastheerverdedigingsmechanismen mogelijk te maken. Het oorspronkelijke protocol werd gevolgd in eerdere publicaties 22,23,24. Tabel 1 vat de belangrijkste updates samen die in deze herziene versie zijn opgenomen, waaronder verbeteringen in schimmelinoculatieprocedures, verminderde putvolumes, gedefinieerde dierinclusiecriteria, bepaling van infectieuze en dodelijke doses, en bijgewerkte aanbevelingen voor veeteelt. Deze workflow biedt gedetailleerde richtlijnen voor het kweken van C. albicans, het infecteren van planarians door blootstelling aan het weken, en het beoordelen van schimmelvirulentie en gastheerresponsen met behulp van kwalitatieve en kwantitatieve uitlezingen onder symptomatische en dodelijke doseringsomstandigheden (Figuur 1). De hier geoptimaliseerde procedures bevatten variabelen die empirisch zijn geïdentificeerd als belangrijke bepalende factoren van infectiedynamiek en gastheeruitkomsten, waardoor de reproduceerbaarheid verbetert en systematische beoordeling van gastheer-pathogeen interacties mogelijk is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol bouwt voort op de eerdere methoden22, 23, 24 en stelt duidelijke, gestandaardiseerde procedures vast om de reproduceerbaarheid te verbeteren en systematisch onderzoek naar schimmelpathogenese en gastheerresponsen in Zuid-Middellandse Zee mogelijk te maken. De belangrijkste protocolverfijningen omvatten vooraf gespecificeerde dieropname- en exclusiecriteria, gestandaardiseerde microbiële voorbereiding en een uitgebreide beoordeling van gasteindpunten.

Alle procedures moeten worden uitgevoerd met passende steriele en aseptische bioveiligheidstechnieken van niveau 2. Standaard persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), waaronder handschoenen, een labjas en gesloten schoenen, moeten altijd gedragen worden. Procedures met de planaire S. mediterranea werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen voor het ethisch gebruik van ongewervelden.

Alle protocolverfijningen worden samengevat in Tabel 1. Alle reagentia, kritieke apparatuur en media, buffers en immunokleuringsrecepten worden vermeld in de Materiaaltabel en Tabel 2.
OPMERKING: Alle procedures waarbij het ongewervelde diermodel S. mediterranea betrokken is, moeten worden uitgevoerd om de hoogste normen voor dierenwelzijn te waarborgen. S. mediterranea moet worden gehuisvest onder geoptimaliseerde omstandigheden die natuurlijke habitats simuleren. Experimenten moeten zo worden ontworpen dat mogelijke pijn of stress wordt geminimaliseerd om ethische behandeling gedurende het hele onderzoek te waarborgen.

1. Schimmelkweek

  1. Informatie over de C. albicans-stam
    1. De standaard C. albicans labstam SN25051 werd gebruikt als wildtype-stam voor alle experimenten en is openbaar beschikbaar bij het Fungal Genetics Stock Center (http://www.fgsc.net/). SN250 is afgeleid van het klinisch isolaat SC5314, oorspronkelijk verzameld uit een bloedkweek van een patiënt met gedissemineerde candidiasis52.
    2. C. albicans-stammen worden gehouden als 25% glycerolvoorraden bij −80°C.
  2. Het kweken van C. albicans-stammen voor infectie
    1. Strepen van cryogene voorraad
      1. Met een steriele applicator streelt u de gewenste stam van −80°C hout op gist peptone extract (YPD) (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose; pH 6,8) agarplaten.
      2. Incubeer statisch bij 30°C gedurende 72 uur.
  3. Bereiding van overnachtingsculturen
    1. Inoculeer een enkele kolonie in 4 mL vloeibare YPD in steriele borosilicaatglaskweekbuizen (18 mm × 150 mm) met een steriele applicatorstick.
    2. Voeg een negatieve controlebuis toe met niet-geïnënteerde YPD onder identieke omstandigheden.
    3. Sluit de buizen losjes af om beluchting mogelijk te maken en incubeer 's nachts (16 uur) bij 30 °C met schudden bij 220 rpm (orbitaal) in een schudbare broedmachine.
      OPMERKING: Als microbiële groei plaatsvindt in de negatieve controle, stop dan het experiment en begin opnieuw met een nieuw medium en een steriele techniek.
  4. Oogst- en wascellen
    1. Met behulp van aseptische techniek worden culturen overgebracht naar gelabelde 15 mL centrifugebuizen.
    2. Centrifugekweek 5 minuten op ~3.000 × g om de cellen te pelleten.
    3. Verwijder voorzichtig het YPD-supernatant zonder de pellet te verstoren.
    4. Suspendeer de pellet opnieuw in planair water (zie Tabel 2 voor samenstelling) in een volume gelijk aan dat van de gebruikte YPD.
    5. Meng grondig door te vortexen.
    6. Herhaal stappen 1.4.2-1.4.4 nog twee keer om het groeimedium volledig te verwijderen.
    7. Na de laatste wasbeurt suspendeer je de celpellet opnieuw in zoet planair water door te vortexen.
  5. Kwantificering van C. albicans-celconcentratie
    1. Verdunning voor OD-meting
      1. Bereid drie steriele 1,7 mL microcentrifugebuizen voor met een verdunningsverhouding van 1:20 (50 μL cultuur + 950 μL planair water) of een alternatief gekozen verdunningsfactor. Meng grondig.
      2. Bereid een blanco buis voor met 1000 μL planair water.
    2. Spectrofotometrie
      1. Stel de spectrofotometer zo in dat hij de optische dichtheid meet bij 600 nm (OD600).
      2. Blank de spectrofotometer met planair water.
      3. Meet OD600 voor elke verdunde steekproef en recordwaarde.
      4. Gemiddeld de drie metingen en vermenigvuldig met de verdunningsfactor om de OD600 van de veekweek te bepalen. Zet OD600 om naar celconcentratie.
        OPMERKING: De optische dichtheidsconversiefactor moet empirisch worden bepaald voor elke spectrofotometer. Op basis van de gebruikte specifieke instrumentatie komt een OD600 van 1 overeen met ongeveer 2 ×107 C. albicans-cellen /mL53.
  6. Bepaling van experimentele inoculumconcentraties
    1. Bereid de gewenste inoculumconcentratie voor elke experimentele conditie voor.
      OPMERKING: Voer ten minste drie biologische replicaties uit om de effectieve dosis voor de planariaanse kolonie te bepalen, met name voor infectieuze of dodelijke eindpunten. Een representatieve berekening voor het voorbereiden van infectieuze en dodelijke inoculumconcentraties is opgenomen in Aanvullend Dossier 1.

2. Planaire soorten en onderhoud

  1. Planaire soorten en onderhoud
    1. Gebruik de CIW4 aseksuele klonale lijn van de planaire S. mediterranea voor alle experimenten.
    2. Onderhoud planaire kolonies in doorzichtige voedselveilige plastic containers met 1.500–2.000 mL 1× planair water.
    3. Houd containers in het donker op 20 °C met de deksels losjes gesloten om gasuitwisseling mogelijk te maken.
    4. Behandel planarians niet met antibiotica.
  2. Kolonieonderhoud en voeding
    1. Geef kolonies één keer per week verse gefilterde runderleverpuree.
    2. Maak containers twee keer per week schoon.
    3. Houd een planaire dichtheid van 200–400 dieren per container. Eerder werk toont gedetailleerde procedures voor kolonievoorbereiding en langdurig onderhoud31.
  3. Pre-experimentele conditionering
    1. Voor de experimentele infectie moet je planarians 7–12 dagen uithongeren om de metabole en groottecondities te standaardiseren.
    2. Gebruik groepen van 5–10 dieren per put voor elke experimentele conditie. Zorg voor gelijke aantallen dieren onder alle omstandigheden, inclusief positieve en negatieve controles.
  4. Keuze van diergrootte
    1. Selecteer planarians van ongeveer 5 mm lengte, wat overeenkomt met ~5 × 105 gastcellen perdier 54.
    2. Vermijd het gebruik van planarians kleiner dan 5 mm, omdat dieren van deze grootte ook exemplaren kunnen bevatten met blastemas of onvolledige ontwikkeling die inconsistente resultaten kan opleveren.
    3. Vermijd het gebruik van planarians groter dan 5 mm, omdat grotere dieren minder geschikt zijn voor fluorescentie-immunokleuring.
    4. Gebruik planarians van ongeveer 5 mm lang bij het vaststellen van infectieuze dosis (ID50) en dodelijke dosis (LD50).
      OPMERKING: Om een consistente maatkeuze te vergemakkelijken, print je een referentierooster van 5 mm × 5 mm en plaats je dit in een plastic binderhoes onder de transparante planarium. Zorg ervoor dat planarians volledig zijn uitgestrekt voordat je de lengte meet.
  5. Gezondheid en inclusiecriteria
    1. KRITISCHE STAP: Controleer alle planarianen onder een stereomicroscoop vóór gebruik.
    2. Sluit dieren met zichtbare schade of letsel uit, inclusief de volgende aandoeningen:
      1. Aanwezigheid van blastemas (weefsel zonder pigmentatie) of onvolledige pigmentatieontwikkeling.
      2. Abnormale pigmentatie, zoals aanzienlijk donkerdere gebieden.
      3. Ontbrekend of beschadigd weefsel.
      4. Laesies of littekens.
      5. Open wonden.
      6. Morfologische afwijkingen of misvormingen.
      7. Elke chronische of niet-genezende aandoening.
    3. Sluit dieren met ontwikkelingsafwijkingen uit.
      1. Gesplitste of gedupliceerde hoofd- of staartregio's.
      2. Misvormde of asymmetrische lichaamsmorfologie.
      3. Onjuist aantal fotoreceptoren (slechts één bilateral paar is acceptabel).
      4. Abnormaal geplaatste farynx.
      5. Defecte ciliatie die leidt tot verminderde beweeglijkheid of onregelmatig glijgedrag.
    4. Neem alleen dieren mee die ongeveer 5 mm lang zijn, volledig ontwikkeld en vrij van zichtbare verwondingen of afwijkingen.
  6. Bordvoorbereiding
    1. Gezonde planarians die aan alle inclusiecriteria voldoen, overbrengen naar 2 ml vers planariaanwater per put in een niet-gekweekte 6-put polystyreenplaat.
      OPMERKING: Plaats dieren één dag voor infectie over om zich te laten wennen aan de nieuwe omgeving en populatiedichtheid.
    2. Wijs putten toe voor de volgende experimentele voorwaarden:
      1. Negatieve controles: niet-geïnfecteerde of nepbehandelde dieren.
      2. Positieve controles: dieren geïnfecteerd met wildtype C. albicans.
    3. Verwijder al het water en vervang het door 2 ml vers planariaanwater om uniformiteit tussen putten te waarborgen.

3. Infectie opzetten

  1. Bereid de inoculatie voor (zie Aanvullend Dossier 1 voor voorbeeldberekening)
    1. Met behulp van aseptische techniek verwijder je voorzichtig al het water van de 6-well plaat door de plaat naar de gebruiker toe te kantelen.
    2. Tel het berekende volume planarisch water bij elke put op.
      OPMERKING: Ga één put tegelijk te werk om te voorkomen dat dieren uitdrogen.
    3. Voeg het berekende volume van C. albicans-cultuur toe aan elke put.
      OPMERKING: Vermijd langdurige blootstelling aan dieren aan de lucht, omdat drogen stress kan veroorzaken en de uitkomst van infecties kan beïnvloeden.
  2. Experimentele plaatincubatiecondities
    1. Plaats de geïnënte 6-well plaat op een donkere, statische plek bij kamertemperatuur.
    2. Houd experimentele platen apart van niet-geïnfecteerde planariankolonies om kruisbesmetting te voorkomen.
    3. Noteer de datum en tijd van de inenting (aangeduid als tijd 0 uur).
      OPMERKING: Vermijd drukbezocht of trillingsgevoelige gebieden (bijv. lades, instrumentenoppervlakken of drukke werkbanken), want beweging kan dieren stressen en de resultaten verstoren.
    4. Incubeer planarians met C. albicans tot 72 uur, afhankelijk van het gewenste eindpunt.
  3. Resuspendie van schimmelcellen
    1. Op elk tijdstip worden de bezette C. albicans-cellen voorzichtig opnieuw opgehangen zonder de planariancellen te verstoren.
      OPMERKING: Tijd (uren [h] of dagen [d] na infectie) verwijst naar de verstreken tijd sinds de eerste blootstelling (tijd 0).
    2. 24 uur na infectie (hpi)
      1. Met een steriele 3 mL transferpipet, kantelt u de plaat iets naar de gebruiker toe.
      2. Aspiraat het planaire water en doe het voorzichtig in een gebied van de put dat vrij is van dieren om de bezette schimmellaag te mengen.
      3. Herhaal deze stap 5–10 keer per put om de bezonken schimmellaag te breken en direct contact met planarianen te vermijden.
      4. Bekijk schimmelnezing tegen een donkere achtergrond voor het beste zicht voor en na de herophangende trappen.
      5. Skort niet-geïnfecteerde controleputten opnieuw onder identieke omstandigheden.
    3. Op 48 hpi
      1. Herhaal de hierboven beschreven procedure voor heropsuspensie.
      2. Voer alle ophangingsstappen uit binnen ± 1 uur van het aangegeven tijdstip.
  4. Einde van de belichting (72 hpi)
    1. Bij 72 hpi breng je planarianen voorzichtig over naar een nieuwe 6-wellplaat met 2 mL vers planariaans water per put.
    2. Minimaliseer de overdracht van schimmelkweek door het gebruik van het kleinst mogelijke volume vloeistof.
    3. Zodra de dieren zijn overgeplaatst, verwijder je al het water en vervang je het door vers planariaans water.
      OPMERKING: Behandel dieren en eventuele weefselfragmenten voorzichtig om mechanische verwondingen of extra stress te voorkomen.

4. Beoordeling van het eindpunt van de gastheer

  1. Uitkomsten van de gastheer vastleggen
    1. Begin met het beoordelen van de uitkomsten van de gastheer 1 dag na infectie (dpi) en ga dagelijks door tot het gewenste experimentele eindpunt.
    2. Kwantificeer gastheerschade met behulp van het gestandaardiseerde 0–3 scoresysteem (Figuur 2).
      Score 0: Geen verandering ten opzichte van niet-geïnfecteerde controles (gezond, asymptomatisch).
      Score 1: Milde symptoom(en).
      Score 2: Ernstige symptoom(en).
      Score 3: Dood.
  2. Criteria voor evaluatie van gastheersymptoom
    1. Score 0 (Asymptomatisch):
      1. Identificeer dieren die normale morfologie, pigmentatie, gedrag en responsiviteit vertonen zonder waarneembare veranderingen ten opzichte van niet-geïnfecteerde controles.
    2. Score 1 (Mild):
      Ken een milde score toe wanneer ten minste één van de volgende symptomen wordt waargenomen ten opzichte van asymptomatische controles.
      1. Verminderde bewegingssnelheid of abnormaal glijgedrag.
      2. Gedeeltelijk of volledig verlies van fototactische respons.
      3. Aanhoudende of herhaalde lichaamscontracties.
      4. Abnormale of niet-uniforme pigmentatie (lichtere of donkerdere gebieden).
      5. Regressie van het hoofd- of staartweefsel.
    3. Score 2 (Streng):
      Ken een ernstige score toe wanneer een of meer van de volgende symptomen aanwezig zijn terwijl dieren nog leven.
      1. Oogfilm of verlies van één of beide ogen.
      2. Volledig hoofdverlies of opvallende schade aan het voorste weefsel.
      3. Groot weefselverlies in het pre-faryngeale gebied.
      4. Fragmentatie in meerdere lichaamsdelen (hoofdlichaam, faryngeale of achterste segmenten).
      5. Open wonden met of zonder slijmafscheiding of interne lekkage.
      6. Gedeeltelijke weefsellyse resulteert in verlies van structurele integriteit.
      7. "C-vormige" lichaamshouding, verlamming of ernstige motiliteitsstoornis.
    4. Score 3 (Overlijden):
      Identificeer overlijden op basis van een of meer van de volgende criteria.
      1. Volledig weefsel of hele dierlijke lyse.
      2. Volledig verlies van respons op prikkels.
      3. Niet herstellen of regenereren.
        OPMERKING: Figuur 2 geeft representatieve afbeeldingen en definiërende kenmerken voor elke score om een consistente classificatie van het fenotype van de gastheer te waarborgen.

5. Het bepalen van de overleving van de gastheer na blootstelling aan schimmel

  1. Bij 3 dpi breng je planarians voorzichtig over naar een nieuwe 6-well plaat met 2 ml vers planarian water per put, zodat de overdracht van resterende schimmelcultuur wordt voorkomen.
  2. Observeer dieren met lichtmicroscopie (≥ 10x objectief).
  3. Registreer hostuitkomsten met behulp van het gestandaardiseerde scoreblad dat in Supplementair Bestand 2 is verstrekt.
  4. Levende dieren bepalen
    1. Identificeer levende dieren op basis van een of meer van de volgende criteria.
      1. Negatieve fototaxi's.
      2. Reactie op zachte overdrachtspipet-verstoring.
      3. Intacte lichaamsstructuur.
      4. Stabiele bevestiging aan de plaat.
  5. Bepalen van dode dieren
    1. Identificeer dode dieren op basis van een of meer van de volgende criteria.
      1. Volledige lysis of desintegratie (alleen restafval).
      2. Transparant of opengesneden lichaam.
      3. Afwezigheid van beweging of reactie op prikkels.
      4. Niet regenereren (afwezigheid van blastema-vorming).
  6. Verwijdering van dode dieren
    1. Verwijder dode dieren en afval pas nadat je de niet-levensvatbaarheid onder microscopie hebt bevestigd.
    2. KRITIEKE STAP: verwijder dode dieren onmiddellijk om kruisbesmetting of veranderde overlevingsmetingen te voorkomen.
    3. Als er afval of schimmel achterblijft, breng dan overlevende dieren opnieuw over naar een verse plaat met schoon planariaanwater om herzaaiing of vorming van biofilms van C. albicans te voorkomen.
      OPMERKING: Plaats 6-wellplaten op een donkere achtergrond tijdens visuele inspectie om het contrast te verbeteren en de fenotypebeoordeling te vergemakkelijken.

6. Beoordeling van de schimmellast

  1. Kwantificatie van kolonievormende eenheid (CFU)
    1. Verzamel planarians op de gewenste infectietijden (5–10 dieren per aandoening per dag). Voeg gematchte niet-geïnfecteerde/mock controles en wild-type geïnfecteerde controles op.
    2. Spoel de putten voorzichtig twee keer af met 2 ml vers planariaanwater om achtergrondcellen van C. albicans te verwijderen.
    3. Breng planarians over in steriele en gelabelde 1,7 mL of 5,0 mL microcentrifugebuizen en verwijder al het resterende water.
    4. Voeg 300 μL vers planariaanwater toe aan elke buis.
    5. Homogeniseer dieren met een steriele stamper totdat er geen grote fragmenten meer overblijven (ongeveer 30–45 seconden).
    6. Voer seriële verdunningen van het homogenaat uit (bijv. 1:10, 1:100, 1:1000).
    7. Plaat 100–200 μL van elke verdunning op YPD-agarplaten, aangevuld met 50 μg/mL elk van ampicilline, rifampicine, streptomycine en neomycine. Verspreid het gelijkmatig met steriele glaskralen of een steriele celverspreider.
    8. Laat platen 5–10 minuten rechtop op het werkblad blijven staan na het platen om de opname van vloeistof in de agar mogelijk te maken.
    9. Bereid driedubbele platen voor voor elke verdunning en conditie.
    10. Incubeer platen bij 30 °C gedurende 48 uur.
    11. Tel CFU's en vermenigvuldig met de verdunningsfactor.
    12. Normaliseer CFU-waarden naar het aantal planarians om gemiddelde CFU's per planarian per conditie te berekenen. Als bijvoorbeeld 100 kolonies worden waargenomen met een verdunning van 10× door een homogenaat van 5 dieren, is de berekende waarde 200 CFU's per dier.

7. Immunofluorescentie anti-Candida-kleuring

  1. Algemene overwegingen bij het kleuren
    1. Voer alle stappen uit met zachte orbitale schommeling (100–140 rpm) bij kamertemperatuur, tenzij anders vermeld. Zie Supplemental File 1 voor details over antistoffen en bronnen van reagentia.
      VOORZICHTIG: Formaldehyde, natriumdodecylsulfaat (SDS) en waterstofperoxide zijn gevaarlijke chemicaliën en moeten worden behandeld volgens de institutionele veiligheidsvoorschriften. Formaldehyde is giftig en geclassificeerd als kankerverwekkend; SDS is een irritatie; en waterstofperoxide is een sterke oxidator die brandwonden kan veroorzaken. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, nitrilhandschoenen, gesloten schoenen en veiligheidsbril). Voer procedures uit waarbij vluchtige reagentia betrokken zijn in een gecertificeerde chemische dampkap en voer afval af volgens de institutionele richtlijnen voor milieu, gezondheid en veiligheid.
  2. Monsterverzameling
    1. Verzamel dieren uit elke experimentele conditie en tijdstip.
    2. Plaats dieren in gelabelde 20 mL scintillatieflesjes met 2 mL planariaanwater.
    3. Verwijder alle vloeistof, spoel één keer af met 2 ml vers planariaanwater en daarna nog eens alle vloeistof.
  3. Fixatie en permeabilisatie
    1. Offerdieren in 7,5% N-acetylcysteïne (NAC) in 1× PBS gedurende 3 minuten.
    2. Verwijder de oplossing en fixeer de dieren in 4% formaldehyde in 0,3% PBSTx gedurende 15 minuten.
    3. Spoel monsters twee keer af met 1× PBS.
    4. Permeabiliseer monsters in 1% SDS gedurende 15 minuten.
    5. Spoel de monsters drie keer af met 1× PBS.
  4. Bleken
    1. Bleekmiddelmonsters in 6% waterstofperoxide in 1× PBS onder een fel LED-licht gedurende 4–12 uur.
      OPMERKING: Als bleken niet direct kan plaatsvinden, bewaar dan vaste monsters in 1× PBS bij 4 °C tot 1 week of droog monsters in 100% methanol voor langdurige opslag.
  5. Blokkering en antilichaamincubatie
    1. Dieren overbrengen naar 24-wellplaten met 1× PBS.
    2. Blok niet-specifieke binding in 2,5% PBS-TB (PBS met Triton X-100 en runderserumalbumine) gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of 8 uur bij 4 °C.
    3. Incubeer monsters met een primair anti-Candida-antilichaam (1:500 in PBS-TB) gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of 8 uur bij 4 °C.
    4. Verwijder het primaire antilichaam en was monsters acht keer elke 20 minuten met 0,3% PBSTx (totaal ~2,5 uur).
    5. Incubeer monsters met Alexa-568-geconjugeerde antikonijn secundair antilichaam (1:800 in PBS-TB) gedurende 4 uur bij kamertemperatuur of 8 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Bescherm monsters tegen licht om fotobleaching te voorkomen. Antilichaamoplossingen kunnen worden hergebruikt.
    6. Verwijder secundaire antistoffen en was monsters acht keer elke 20 minuten met 0,3% PBSTx.
  6. Optionele schuifbevestiging
    1. Plaats dieren op een microscoopglaasje met alle dieren aan de voorkant naar boven gericht.
    2. Verwijder overtollig water met een transferpipet.
    3. Absorbeer voorzichtig het resterende vocht van de randen met de rand van een keukenpapier.
    4. Voeg 150–175 μL Gelvatol-montagemedium toe (Tabel 2 voor samenstelling) druppelgewijs totdat de dieren volledig bedekt zijn.
    5. Leg voorzichtig een dekmantel over het monster, vermijd luchtbellen.
    6. Laat Gelvatol minstens 2 uur uitharden voordat je beeldvorming neemt.
    7. Winkelglijbanen op een koele, donkere plek voor langdurige behoud.
  7. Beeldvorming
    1. Beeldmonsters met geelgroene excitatie (~578 nm) en observeren oranje-rode emissie (~603 nm).
    2. Gebruik een 2x objectief om kleurenpatronen van het hele dier te visualiseren.

8. Probleemoplossing

  1. Als de infectie-uitkomsten inconsistent zijn, voer dan een dosis-titratiecurve uit met wildtype SN250 of een andere basislijn stam in stappen van 5–10 × 107 cellen/mL.
  2. Voer ten minste drie biologische replicaties uit met 5–10 dieren per groep.
  3. Neem negatieve en positieve controlegroepen op om mogelijke problemen te identificeren zoals kruisbesmetting, falen van aseptische technieken, problemen met de levensvatbaarheid van stammen of een slechte basisgezondheid van dieren.
  4. Na het voltooien van het dosis-titratie-experiment repliceert de pool om de mediane overleving per groep te bepalen.
  5. Analyseer overlevingsverschillen met behulp van Mantel–Cox log-rank paarwijze analyse.
  6. Gebruik Kaplan–Meier survivalanalyse om tijd-tot-sterfteverschillen tussen stammen of behandelingen te evalueren.
  7. Voor sublethale of infectieuze dosisaandoeningen analyseer symptomatische gastheeruitkomsten (bijv. milde of ernstige fenotypes of schimmelkolonisatie) in plaats van overleving.
  8. Vergelijk de responsen van de gastheer tussen dosisgroepen om het juiste infectieuze of dodelijke dosisbereik voor latere experimenten te bepalen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een bijgewerkt protocol voor het infecteren van planarians met C. albicans (Figuur 1) en het systematisch kwantificeren van gastheeruitkomsten (Figuur 2) wordt gepresenteerd. Deze verfijnde workflow ondersteunt een robuuste beoordeling van meerdere infectieparameters, waaronder morbiditeit (symptomatische ziekteernst), overleving (dodelijkheid), schimmellast (CFU's) en ruimtelijk-temporele dynamiek van pathogene kolonis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het variëren van de infectieuze dosis van wildtype C. albicans produceert reproduceerbare, dosisafhankelijke verschillen in morbiditeit in S. mediterranea, wat de gevoeligheid van het model voor kwantitatieve beoordeling van schimmelvirulentie onderstreept. Dit protocol beschrijft strategieën voor het vaststellen van basisdoseringen van infectieuze en dodelijke doses binnen laboratoriumonderhouden planarische kolonies en presenteert criteria voor het bevestigen van succ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.J.N. is medeoprichter van BioSynesis, Inc., een bedrijf dat diagnostiek en therapieën ontwikkelt voor biofilminfecties. Alle andere auteurs geven geen concurrerende belangen aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken alle leden van de Nobile-, Oviedo- en Hernday-labs voor inzichtelijke discussies over het infectiemodel van S. mediterranea-C. albicans en zijn dankbaar voor het laboratoriumbeheer en het planariumonderhoud van Edelweiss Pfister. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) die R35GM156045 en R35GM124594 aan C.J.N. en R35GM158501 en R01GM132753 aan N.J.O. werden toegekend. Dit werk werd ook ondersteund door de familie Kamangar in de vorm van een gefinancierde leerstoel aan C.J.N. N.M.S. werd ondersteund door de Center for Cellular and Biomolecular Machines (CCBM) National Science Foundation (NSF) Center of Research Excellence in Science and Technology (CREST) fellowships onder de prijzen NSF-HRD-1547848 en NSF-EES-2112675.

De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de interpretatie van de gegevens, het schrijven van het manuscript of de beslissing om de resultaten te publiceren. N.M.S. erkent het gebruik van ChatGPT voor hulp bij het redigeren van het manuscript (het controleren van spelling, grammatica, opmaak en zinsstructuur).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.7 mL microcentrifuge tubes VWR/Genemate490004-436-BOXOF500Helder, doos met 500 stuks
20 mL scintillon vialsFisher Scientific12-100-006Heldere glazen flessen voor immunokleuring
24-well non-treated polystyrene platesFisher Scientific08-772-51Immunokleuring
5.0 mL microcentrifuge tubes Eppendorf/Sigma AldrichEP0030119487-200EAHelder, doos met 200 stuks
6-well non-treated polystyrene platesFisher Scientific08-772-49Besmettingstests
AgarVWR89405-066Bacteriologische kwaliteit voor YPD-medium
Applicator sticksThermo Fisher/Puritan22-029-491C. albicans-kweek
BioRenderBioRender Inc.N/ASoftware voor het ontwerpen van figuren, gebruikt om schematische illustraties te genereren
Calcium chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GPlanaria-water/1x Montjuïc-zouten
Candida albicans polyklonaal antilichaam anti-Konijn, IgGThermo FisherPA1-27158Immunokleuring
Centrifuge tubesVWR89039-664C. albicans-oogst
Cultuurbuizen borosilicaatglas 18x150mmVWR47729-583C. albicans-kweek
CuvettesFisher Scientific14-955-127Om de optische dichtheid van culturen te meten
Dextrose (D-glucose)Fisher ScientificD16-3YPD-medium
GlycerolFisher ScientificG33-4Molecuulbiologische kwaliteit om aan te vullen voor cryogeen opslaan van C. albicans 
Graphing and data visualization toolGraphPad/PrismStatistisch software- en visualisatietool. Versie 10.6.1.
Graphing toolRStatistisch software. Versie 4.4.3.
Incubator ShakerEppendorfEPM1282-0004-1EANew Brunswick Innova 44/44R voor C. albicans-kweek
Magnesium chloride (MgCl2)SigmaM8266-100GVoor planaria-water  (1x Montjuïc-zouten)
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-AldrichM7506-500GVoor planaria-water  (1x Montjuïc-zouten)
Microscope SlidesVWR16004-368
Multizoom microscopeNikonNikon AZ100 
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA7250-50GMucolytisch en opofferend reagens  fixatie
Paramaldehyde, 16% oplossing, moleculaire biologie kwaliteitElectron Microscopy Sciences15710Fixeermiddel
Pellet Pestle Cordless MotorFisher Scientific12-141-361Planaria-homogenisatie
Peptone, bacteriologische kwaliteitHIMEDIA/VWR89129-480YPD-medium
PestlesFisher Scientific12-141-368RNase-vrije wegwerp-pellet voor planaria-homogenisatie
Petri Dishes, 100 x 15 mmVWR25384-342
Poly(vinyl alcohol)Sigma-AldrichP-8136 Voor Gelvatol
Potassium chloride (KCl)Sigma Life ScienceP9541-500GPlanaria-medium/water  (1x Montjuïc-zouten)
Secondary Antibody Goat anti-Rabbit, IgG, Alexa Fluor 568Fisher ScientificA-11011Immunokleuring
SN250Fungal Genetics Stock CenterWildtype C. albicans stam (https://www.fgsc.net/)
Sodium AzideFisher ScientificS227-100Voor Gelvatol
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761-1KGPlanaria-medium/water  (1x Montjuïc-zouten)
Sodium chloride (NaCl)Sigma Life ScienceS3014-500GPlanaria-medium/water  (1x Montjuïc-zouten)
SpectrophotometerAgilent26354BioTek Epoch 2 Microplate om de optische dichtheid te meten
Static IncubatorFisher Scientific15-015-2634C. albicans cultiveren
Transfer pipettesFisher Scientific13-711-9CMSteriele wegwerp-gradueerde pijpjes voor het overbrengen van planaria
Tris BaseSigma-Aldrich252859Voor Gelvatol
Yeast extractThermo Fisher212750YPD-medium

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delavy, M., et al. Unveiling Candida albicans intestinal carriage in healthy volunteers: the role of micro- and mycobiota, diet, host genetics and immune response. Gut Microbes. 15 (2), 2287618(2023).
  2. Bays, D. J., Savage, H. P. Candida albicans gastrointestinal colonization resistance: a host-microbiome balancing act. Infect Immun. 93 (9), e0061024(2025).
  3. Nash, A. K., et al. The gut mycobiome of the Human Microbiome Project healthy cohort. Microbiome. 5 (1), 153(2017).
  4. Fróis-Martins, R., Lagler, J., LeibundGut-Landmann, S. Candida albicans virulence traits in commensalism and disease. Curr Clin Microbiol Rep. 11 (4), 231-240 (2024).
  5. Kumamoto, C. A., Gresnigt, M. S., Hube, B. The gut, the bad and the harmless: Candida albicans as a commensal and opportunistic pathogen in the intestine. Curr Opin Microbiol. 56, 7-15 (2020).
  6. Fisher, M. C., et al. Tackling the emerging threat of antifungal resistance to human health. Nat Rev Microbiol. 20 (9), 557-571 (2022).
  7. Gow, N. A. R., et al. The importance of antimicrobial resistance in medical mycology. Nat Commun. 13 (1), 5352(2022).
  8. Lockhart, S. R., Chowdhary, A., Gold, J. A. W. The rapid emergence of antifungal-resistant human-pathogenic fungi. Nat Rev Microbiol. 21 (12), 818-832 (2023).
  9. Denning, D. W. Global incidence and mortality of severe fungal disease. Lancet Infect Dis. 24 (7), e428-e438 (2024).
  10. Benedict, K., Jackson, B. R., Chiller, T., Beer, K. D. Estimation of direct healthcare costs of fungal diseases in the United States. Clin Infect Dis. 68 (11), 1791-1797 (2019).
  11. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
  12. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 71-92 (2015).
  13. Höfs, S., Mogavero, S., Hube, B. Interaction of Candida albicans with host cells: virulence factors, host defense, escape strategies, and the microbiota. J Microbiol. 54 (3), 149-169 (2016).
  14. Talapko, J., et al. Candida albicans—the virulence factors and clinical manifestations of infection. J Fungi. 7 (2), 79(2021).
  15. Lopes, J. P., Lionakis, M. S. Pathogenesis and virulence of Candida albicans. Virulence. 13 (1), 89-121 (2022).
  16. Gaffar, N. R., Valand, N., Venkatraman Girija, U. Candidiasis: insights into virulence factors, complement evasion and antifungal drug resistance. Microorganisms. 13 (2), 272(2025).
  17. Xie, J., et al. White-opaque switching in natural MTLa/α isolates of Candida albicans: evolutionary implications for roles in host adaptation, pathogenesis, and sex. PLoS Biol. 11 (3), e1001525(2013).
  18. Costa-de-Oliveira, S., Rodrigues, A. G. Candida albicans antifungal resistance and tolerance in bloodstream infections: the triad yeast-host-antifungal. Microorganisms. 8 (2), 154(2020).
  19. Whaley, S. G., et al. Azole antifungal resistance in Candida albicans and emerging non-albicans Candida species. Front Microbiol. 7, 2173(2017).
  20. Marichal, P., et al. Contribution of mutations in the cytochrome P450 14α-demethylase to azole resistance in Candida albicans. Microbiology. 145 (10), 2701-2713 (1999).
  21. Lee, Y., Robbins, N., Cowen, L. E. Molecular mechanisms governing antifungal drug resistance. npj Antimicrob Resist. 1 (1), 5(2023).
  22. Maciel, E. I., Jiang, C., Barghouth, P. G., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. The planarian Schmidtea mediterranea is a new model to study host-pathogen interactions during fungal infections. Dev Comp Immunol. 93, 18-27 (2019).
  23. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Ziman, B., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. Epithelial infection with Candida albicans elicits a multi-system response in planarians. Front Microbiol. 11, 629526(2021).
  24. Maciel, E. I., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Oviedo, N. J. A planarian model system to study host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 2680, 231-244 (2023).
  25. Sánchez Alvarado, A. Planarian regeneration: its end is its beginning. Cell. 124 (2), 241-245 (2006).
  26. Sluys, R., Riutort, M. Planarian diversity and phylogeny. Methods Mol Biol. 1774, 1-56 (2018).
  27. Riera Romo, M., Pérez-Martínez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
  28. Peiris, T. H., Hoyer, K. K., Oviedo, N. J. Innate immune system and tissue regeneration in planarians: an area ripe for exploration. Semin Immunol. 26 (4), 295-302 (2014).
  29. Kangale, L. J., Raoult, D., Fournier, P. E., Abnave, P., Ghigo, E. Planarians as an emerging model organism for investigating innate immune mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 11, 619081(2021).
  30. Karami, A., Tebyanian, H., Goodarzi, V., Shiri, S. Planarians: an in vivo model for regenerative medicine. Int J Stem Cells. 8 (2), 128-133 (2015).
  31. Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. Establishing and maintaining a colony of planarians. Cold Spring Harb Protoc. 2008 (10), (2008).
  32. Ivanković, M., et al. A comparative analysis of planarian genomes reveals regulatory conservation in the face of rapid structural divergence. Nat Commun. 15, 8215(2024).
  33. Fincher, C. T., Wurtzel, O., De Hoog, T., Kravarik, K. M., Reddien, P. W. Cell type transcriptome atlas for the planarian Schmidtea mediterranea. Science. 360 (6391), eaaq1736(2018).
  34. Shibata, N., Agata, K. RNA interference in planarians: feeding and injection of synthetic dsRNA. Methods Mol Biol. 1774, 455-466 (2018).
  35. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Dev Dyn. 242 (6), 718-730 (2013).
  36. Winsor, L., Sluys, R. Basic histological techniques for planarians. Methods Mol Biol. 1774, 285-351 (2018).
  37. Lu, J., et al. 3D reconstruction of neuronal allometry and neuromuscular projections in asexual planarians using expansion tiling light sheet microscopy. eLife. 13, e101103(2025).
  38. Rink, J. C., Vu, H. T. K., Alvarado, A. S. The maintenance and regeneration of the planarian excretory system are regulated by EGFR signaling. Development. 138 (17), 3769-3780 (2011).
  39. Fajardo, P., Cuenda, A., Sanz-Ezquerro, J. J. A mouse model of candidiasis. Methods Mol Biol. 2321, 63-74 (2021).
  40. Singh, S., Singh, S., Kumar, A. Systemic Candida albicans infection in mice causes endogenous endophthalmitis via breaching the outer blood-retinal barrier. Microbiol Spectr. 10 (4), e01658-e01722 (2022).
  41. Spellberg, B., Ibrahim, A. S., Edwards, J. E., Filler, S. G. Mice with disseminated candidiasis die of progressive sepsis. J Infect Dis. 192 (2), 336-343 (2005).
  42. Andes, D. Use of an animal model of disseminated candidiasis in the evaluation of antifungal therapy. Methods Mol Biol. 118, 111-128 (2005).
  43. Spellberg, B., et al. Parenchymal organ, and not splenic, immunity correlates with host survival during disseminated candidiasis. Infect Immun. 71 (10), 5756-5764 (2003).
  44. Clinical overview of invasive candidiasis. , Centers for Disease Control and Prevention. Available at: https://www.cdc.gov/candidiasis/hcp/clinical-overview/index.html (2024).
  45. Kobayashi, G. S. Medical microbiology. , NCBI Bookshelf. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8103/ (1996).
  46. Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 18026(2018).
  47. Van Rhijn, N., Rhodes, J. Evolution of antifungal resistance in the environment. Nat Microbiol. 10 (8), 1804-1815 (2025).
  48. Brown, G. D., et al. The pathobiology of human fungal infections. Nat Rev Microbiol. 22 (11), 687-704 (2024).
  49. Osset-Trénor, P., Pascual-Ahuir, A., Proft, M. Fungal drug response and antimicrobial resistance. J Fungi. 9 (5), 565(2023).
  50. Yan, Z. Z., et al. Environmental microbiome, human fungal pathogens, and antimicrobial resistance. Trends Microbiol. 33 (1), 112-129 (2025).
  51. Homann, O. R., Dea, J., Noble, S. M., Johnson, A. D. A phenotypic profile of the Candida albicans regulatory network. PLoS Genet. 5 (12), e1000783(2009).
  52. Noble, S. M., French, S., Kohn, L. A., Chen, V., Johnson, A. D. Systematic screens of a Candida albicans homozygous deletion library decouple morphogenetic switching and pathogenicity. Nat Genet. 42 (7), 590-598 (2010).
  53. Gulati, M., et al. In Vitro Culturing and Screening of Candida albicans Biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).
  54. Takeda, H., Nishimura, K., Agata, K. Planarians Maintain a Constant Ratio of Different Cell Types During Changes in Body Size by Using the Stem Cell System. Zoological Science. 26 (12), 805-813 (2009).
  55. Roberts-Galbraith, R. H. RNAi screening to assess tissue regeneration in planarians. Methods Mol Biol. 2450, 509-527 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Planaria modelaangeboren immuunresponsschimmelkolonisatieimmunokleuringgastheer pathogeeninteractiehigh throughput screening

Gerelateerde artikelen