Methodenartikel

Validatie van willekeurige transgenintegratie en expressie in Eimeria-parasieten

86 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70509

⸱

5 juni 2026

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Veterinary Public Health Security, Key Laboratory of Animal Epidemiology and Zoonosis of Ministry of Agriculture, National Animal Protozoa Laboratory & College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, 2College of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gestandaardiseerde methode voor het valideren van de integratie en expressie van vreemde genen in transgene Eimeria parasieten. Door het integreren van genomische en eiwitniveau-analyses bevestigt deze workflow stabiele geninsertie en -expressie. Deze aanpak faciliteert de ontwikkeling van transgene Eimeria voor onderzoek en vaccintoepassingen.

Samenvatting

Validatie van transgene Eimeria-parasieten is essentieel voor het bevestigen van stabiele genomische integratie en expressie van exogene genen. Dit protocol beschrijft een uitgebreide workflow voor het verifiëren van transgeninsertie en eiwitexpressie in Eimeria tenella. De procedure begint met genomische DNA-extractie uit gesporuleerde oocysten, gevolgd door PCR-amplificatie om de aanwezigheid van het doelfragment voorlopig te verifiëren. Om genomische integratie verder te bevestigen, wordt een volledige genoomsequencing uitgevoerd om insertieplaatsen te identificeren en de stabiliteit van het geïntegreerde construct in het parasietgenoom te evalueren. Eiwitexpressie wordt vervolgens onderzocht door Western blotting van lysaten bereid uit gezuiverde sporozoïeten, waardoor detectie van het doelrecombinante eiwit mogelijk is. Daarnaast wordt intracellulaire lokalisatie gevisualiseerd door een indirecte immunofluorescentietest (IFA) met geïnfecteerde gastheercellen. Samen bieden deze assays een robuust en reproduceerbaar kader voor het valideren van transgene Eimeria-lijnen . Deze workflow maakt betrouwbare bevestiging van genomische integratie en eiwitexpressie mogelijk, waardoor downstream toepassingen in genetische manipulatie, functionele genomica en vaccinontwikkeling gericht zijn op Eimeria-parasieten .

Inleiding

Coccidiose, veroorzaakt door Eimeria-soorten, is een van de economisch meest significante parasitaire ziekten bij pluimvee, wat leidt tot verminderde gewichtstoename, slechte voeromzetting en wereldwijde financiële verliezen die jaarlijks op miljarden dollarsworden geschat. Genetische manipulatie van Eimeria-parasieten is een krachtig instrument geworden voor zowel fundamenteel onderzoek als vaccinontwikkeling 4,5,6. Stabiele transfectie maakt de integratie en expressie van exogene genen mogelijk, zoals fluorescerende reporters of beschermende antigenen, waardoor de ontwikkeling van parasieten in realtime kan worden gevisualiseerd en de vaccinatiekandidaten gericht geëvalueerd kunnen worden 7,8,9.

Een eerdere publicatie van Duan et al. bood een gestandaardiseerd protocol voor nucleofectie en in vivo voortplanting van transgene Eimeria, waarmee een efficiënte methode werd vastgesteld voor het genereren en verrijken van recombinante parasietlijnen10. Er bestaat echter momenteel geen uniforme workflow om stabiele genomische integratie en functionele expressie van transgenen te bevestigen. Dergelijke validatie is cruciaal om de authenticiteit, stabiliteit en reproduceerbaarheid van transgene lijnen die worden gebruikt voor latere biologische studies of vaccintoepassingen te waarborgen.

Dit artikel presenteert een volledig, stapsgewijs protocol voor het valideren van transgenintegratie en -expressie in Eimeria tenella, met behulp van een transgene E. tenella-lijn die het infectious bursal disease virus (IBDV) VP2-antigeen (Et-VP2) tot expressie brengt als model11. De expressieplasmide p5′AMic2linkerVP2m3′A, met het VP2-gen en een mCherry-reporter, werd getransfecteerd in wilde E. tenella sporozoïeten (Et-WT). Rode fluorescerende oocysten werden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en seriële passage doorgegeven in coccidievrije kippen. Deze workflow demonstreert procedures voor genomische DNA-extractie, PCR-gebaseerde voorlopige integratieanalyse, whole-genome resequencing om insertieplaatsen te identificeren, Western blotting om eiwitexpressie te verifiëren, en indirecte immunofluorescentietest (IFA) om intracellulaire lokalisatie van het recombinante eiwit te visualiseren. Samen bieden deze methoden een reproduceerbaar en uitgebreid kader om de authenticiteit van transgene Eimeria-lijnen te bevestigen, waardoor hun betrouwbare gebruik mogelijk wordt in functioneel genomicaonderzoek en vaccinontwikkeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven met kippen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de China Agricultural University (goedkeuringsnummer: CAU20160628-2). Alle verzorgings- en experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van de China Agricultural University en voldeden aan de Internationale Richtlijnen voor Biomedisch Onderzoek met Dieren. In deze studie werden in deze studie zeven dagen oude mannelijke specifieke pathogen-free (SPF) White Leghorn-kippen gebruikt. De vogels werden onder standaard verzorgingsomstandigheden onderhouden met vrije toegang tot voer en water gedurende de hele experimentele periode. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Extractie van genomisch DNA uit gesporuleerde oocysten van Eimeria spp.

  1. Breng 1 mL oocystususpensie (≥1 × 107/mL) over in een microcentrifugebuis van 1,5 mL. Voeg een gelijke hoeveelheid glaskorrels van 1 mm toe, overeenkomend met de oocystkorrel. Verstoor de oöcysten met een weefselhomogenisator door krachtig kraalkloppen op 60 Hz gedurende 5 minuten totdat de oöcystwanden volledig zijn doorbroken en de inhoud wordt vrijgegeven.
  2. Verzamel het mengsel (exclusief de glazen kralen) in een nieuwe buis en centrifugeer op 12.000 x g gedurende 1 minuut. Verwijder het supernatant, voeg 500 μL CTAB-buffer en 40 μL proteïnase K toe, en incubeer het mengsel bij 60 °C gedurende 30 minuten.
  3. Voeg 500 μL fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) toe, vortex gedurende 10 s, en centrifugeer op 12.000 x g gedurende 5 minuten. Breng de bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis.
    OPMERKING: Sluit de buis met de organische laag goed af en verwijder deze stevig om verontreiniging van het milieu te voorkomen. (Optioneel) Als de eiwitverontreiniging hoog blijft, herhaal dan stap 1.3 1–2 keer extra.
  4. Voeg 500 μL chloroform toe: isoamylalcohol (24:1), vortex gedurende 10 seconden, en centrifugeer op 12.000 x g gedurende 5 minuten. Breng de waterige fase over in een nieuwe buis en voeg een gelijke hoeveelheid isopropanol toe. Meng door inversie totdat DNA-precipititatie verschijnt.
    OPMERKING: Neerslag bij −20 °C gedurende ≥1 uur of 's nachts verhoogt de opbrengst.
  5. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 10 minuten om DNA te pelleten. Was de pellet met 70% ethanol, centrifugeer op 12.000 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg. Verwijder voorzichtig restvloeistof met een vacuümpomp en laat de pellet aan de lucht drogen bij kamertemperatuur of 37 °C.
  6. Los de gedroogde DNA-pellet op in een RDn-ase-bevattende ddH2O- of TE-buffer. Incubeer bij 37 °C gedurende ≥1 uur of bij 4 °C 's nachts om resterende RNA te verwijderen. Bewaar het gezuiverde DNA bij −20 °C.
    OPMERKING: Voor langdurige conservering kunnen onopgeloste DNA-pellets direct worden opgeslagen bij −20 °C of −80 °C. Evalueer de DNA-integriteit en concentratie met agarosegel-elektroforese voordat je later toepassingen krijgt.

2. PCR-verificatie van de aanwezigheid van het Et-VP2-construct in het parasietgenoom

  1. Design primerparen (Tabel 1) om genomische integratie van het Et-VP2-construct te verifiëren.
    OPMERKING: Primersequenties zijn ontworpen met Primer-BLAST, met typische parameters van 18–24 bp primerlengte, een smelttemperatuur van ongeveer 55–60 °C en minimale vorming van secundaire structuur. De specificiteit van elk primerpaar werd verder gecontroleerd aan de hand van het Eimeria tenella-genoom om niet-specifieke amplificatie te voorkomen.
  2. Bereid een 50 μL reactiemengsel voor met 25 μL 2× Taq Master Mix, 21 μL ddH₂O, 1 μL elk van voor- en achteruitprimers, en 2 μL DNA-template.
  3. Voer versterking uit met de volgende thermische cyclusomstandigheden: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 5 minuten; 30 cycli van 95 °C voor 30 seconden, 55 °C voor 30 seconden en 72 °C voor 1 minuut; gevolgd door een laatste verlenging bij 72 °C voor 10 minuten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat alle reagentia grondig zijn gemengd voordat je thermisch wordt gecycleerd. Gebruik vers voorbereide DNA-sjablonen om optimale amplificatie-efficiëntie te bereiken.

3. Hersequencing van de transgene parasietlijn (Et-VP2)

  1. Sample-indiening en bibliotheekconstructie
    1. Dien een oocystususpensie van 1 mL (≥1 × 107/mL) in bij een commerciële sequencing-dienstverlener voor next-generation resequencing-analyse.
    2. Na kwaliteitsbeoordeling van het genomische DNA fragmenteren we het DNA door mechanische verstoring met behulp van echografie. Zuiver het gefragmenteerde DNA, voer uiteindreparatie uit, voeg een adenine (A)-basis toe aan de 3′-uiteinden en ligate-sequencing-adapters.
    3. Selecteer DNA-fragmenten van de gewenste grootte met behulp van agarosegelelektroforese en voer PCR-amplificatie uit om de sequencingbibliotheek samen te stellen.
    4. Onderwerp de gebouwde bibliotheek aan kwaliteitscontrole. Voer paired-end sequencing uit op het Illumina NovaSeq-platform met een leeslengte van 150 bp. Houd een sequencingdiepte van 100× aan om de nauwkeurigheid van de data te waarborgen, waarbij minstens 6 GB ruwe data wordt gegenereerd met een minimale kwaliteitsscore van Q20 >90%.
      OPMERKING: Behandel alle reagentia en DNA-monsters met aseptische technieken om besmetting te voorkomen. Controleer of sequencingparameters voldoen aan de vereiste diepte- en kwaliteitsindicatoren voordat u doorgaat met data-analyse.
  2. Data-analyse
    1. Filter de ruwe sequencinggegevens met Fastp-software (v0.23.2) volgens de volgende criteria:12:
      1. Verwijder de adaptersequenties.
      2. Stel de drempel voor lage kwaliteit in op Q20 en verwijder lezingen waarbij laagwaardige bases meer dan 30% van de totale leeslengte uitmaken.
      3. Verwijder leespunten die korter zijn dan 50 bp.
    2. Lijn de kwaliteitsgecontroleerde leesopdrachten af op het E. tenella referentiegenoom (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_905310635.1) met behulp van de Bowtie2-software (v2.4.5)13. De willekeurigheid van next-generation sequencinggegevens wordt geëvalueerd op basis van de dekkingsdiepte en uniformiteit.
    3. Zorg ervoor dat de sequencing-reads zijn uitgelijnd met de transgene vectorsequentie. Verwijder de reads die het T-DNA-gebied niet in kaart brengen om chimerische reads te verkrijgen, waarbij het ene uiteinde overeenkomt met het T-DNA en het andere uiteinde met het E. tenella-referentiegenoom .
    4. Op basis van de sequenties van de chimerische reads wordt uitlijning uitgevoerd met behulp van ToxoDB (release 64) om de specifieke locatie van potentiële T-DNA-insertieplaatsen te bepalen. Analyseer de sequencingdiepte over homologe regio's tussen de vector en het Eimeria genoom (d.w.z. de 5′ en 3′ regulerende regio's) met behulp van Mosdepth-software (v0.3.3)14.
    5. Identificeer potentiële integratieplaatsen van het transgene plasmide binnen het E. tenella-genoom en verifieer deze met PCR met behulp van het reactiesysteem beschreven in stap 2.1.
      OPMERKING: Zorg voor consistent gebruik van softwareversies en parameterinstellingen gedurende de analyse om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de data te behouden.

4. Westerse blotting van transgene Eimeria-eiwitten

  1. Verzamel een PBS-suspensie met minstens 5 × 10 sporozoieten in een 1,5 mL centrifugebuis en centrifugeer op 2500 x g gedurende 5 minuten. Suspendeer de pellet opnieuw in een 100 μL RIPA-lysisbuffer en incubeer 1 uur op ijs. Voeg 20 μL van 6× eiwitlaadbuffer toe en verhit het mengsel tot 100 °C gedurende 10 minuten.
  2. Bereid SDS-PAGE gels voor met een 1,5 mm glazen plaat. Pas de acrylamideconcentratie aan volgens het molecuulgewicht van het doeleiwit. Tijdens de polymerisatie legt u de scheidingsgel over gedestilleerd water om een gelijkmatig oppervlak te garanderen voordat u de stapelgel toevoegt.
  3. Centrifugeer het lysaat op 10.000 x g gedurende 5 minuten en laad 40 μL supernatant in elke monsterbaan. Laad 10 μL eiwitmarker in een aparte baan en vul de resterende lanes met 40 μL van 1× laadbuffer als controle.
  4. Voer elektroforese uit in 1× lopende buffer op 70 V gedurende 20 minuten, gevolgd door 120 V gedurende 60–90 minuten, totdat de kleurstofvoorkant de onderkant van de gel bereikt.
  5. Verwijder de gel volgens de verwachte eiwitgrootte. Activeer een PVDF-membraan in methanol voor 1 minuut en stel de overdrachtssandwich in de volgende volgorde samen: spons, filterpapier, gel (kathodezijde), PVDF-membraan, filterpapier, spons. Verwijder alle luchtbellen en transfereer eiwitten op 70 V gedurende 3 uur in de transferbuffer.
  6. Was het membraan drie keer met PBST (5 minuten per stuk) en blokkeer met 5% magere melk gedurende 1 uur op kamertemperatuur of 's nachts op 4 °C. Was het membraan twee keer met PBST om de resterende blokkeringsoplossing te verwijderen.
  7. Incubeer het membraan met primaire antilichamen verdund in antilichaambuffer: muis polyklonale anti-Flag (1:2000) en muis monoklonaal anti-GAPDH (1:2000). Incubeer 1 uur op kamertemperatuur of een nacht op 4 °C met zacht schudden. Verzamel de antistofoplossing en was het membraan vijf keer met PBST (elk 5 minuten).
  8. Incubeer het membraan met HRP-geconjugeerde geiten-anti-muis IgG (1:2000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was het membraan vijf keer met PBST (5 minuten per stuk).
  9. Bereid een ECL-substraat voor door gelijke volumes oplossing A en B te mengen. Breng het substraat gelijkmatig aan op het membraan en detecteer eiwitsignalen met behulp van een chemiluminescentiebeeldvormingssysteem.
    OPMERKING: Voer alle stappen uit waarbij eiwitmonsters op ijs liggen, tenzij anders vermeld. Hanteer methanol- en ECL-substraten in een afzuigkap terwijl je handschoenen en beschermende brillen draagt.

5. Intracellulaire Indirecte Immunofluorescentietest (IFA) van transgene Eimeria

  1. Zuivering van sporozoieten met behulp van een chromatografiekolom
    1. Sluit de chromatografiekolom aan op een peristaltische pomp en stel de debiet aan op 50–60 Hz. Was de kolom met gedestilleerd water en glycineoplossing.
    2. Voeg DE-52 cellulose-suspensie toe aan de kolom terwijl je continu glycineoplossing toevoegt totdat het cellulosebed ongeveer 1 cm hoog is.
    3. Laad sporozoieten die met de Percoll-methode zijn gezuiverd op de kolom. Handhaven een debiet van 30–40 Hz met behulp van glycineoplossing en verzamel de doorstroming in een 50 mL centrifugebuis.
    4. Monitor het eluaat door druppels op een glazen preparaat te plaatsen voor microscopische observatie. Als er geen sporozoïeten worden gedetecteerd, stop dan de pomp. Centrifugeer de verzamelde fractie op 2.500 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in PBS.
      OPMERKING: Voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden om microbiële besmetting te voorkomen. Verwijder glycine en Percoll-afval volgens de institutionele bioveiligheidsvoorschriften.
  2. Sporozoietinfectie van HFF-cellen
    1. Zaad 1 × 106 sporozoieten in 24-wellplaten met HFF-celmonolagen. Voeg penicilline-streptomycine toe aan een uiteindelijke concentratie van 1× (100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine), meng voorzichtig en incubeer bij 37 °C gedurende 4–6 uur om invasie mogelijk te maken. Verwijder het medium, was één keer met 1 mL PBS en gooi het supernatant weg.
    2. Verwijder voorzichtig de glazen afdekstukken uit de holen met een steriele pincet en breng ze over op een verse plaat met 24 velen. Bevestig de monsters in 1 mL 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten, was één keer met 1 mL PBS en gooi het supernatant weg.
    3. Permeabiliseer de cellen met 1 mL van 0,25% Triton X-100 gedurende 30 minuten. Was één keer met 1 mL PBS en gooi het supernatant weg.
    4. Blokkeer de monsters met 1 mL 3% BSA gedurende 30 minuten. Was één keer met 1 mL PBS en gooi het supernatant weg.
    5. Verdun muis monoklonaal anti-Flag antilichaam (1:200) in 3% BSA. Plaats druppels van het verdund antilichaam op de afdichtfolie en draai de dekfolies (met de celzijde naar beneden) om op de druppels. Incubeer de dekmantels in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 1 uur. Was drie keer met 1 mL PBS (5 minuten per stuk).
    6. Verdunde FITC-geconjugeerde geiten anti-muis IgG (1:200) en Hoechst 33258 (1:100) in 3% BSA. Breng druppels van het kleurmengsel op de afdichtfolie en draai de dekfolie om op de druppels. Incubeer in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 1 uur, en was daarna vijf keer met 1 mL PBS (5 minuten per stuk).
    7. Monteer de coverslips door 5 μL antifade montagemedium op een glazen slede te plaatsen. Draai de coverslip (celzijde naar beneden) om op de val, vermijd luchtbellen, en sluit de randen af. Bewaar de gemonteerde glaasjes in een bevochtigde kamer bij 4 °C tot de beeldvorming.
      OPMERKING: Hanteer paraformaldehyde en Triton X-100 met een chemische dampkap terwijl je handschoenen en oogbescherming draagt. Reagensformuleringen die in deze procedure worden gebruikt, zijn vermeld in Tabel 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Genomische PCR-analyse bevestigde de aanwezigheid van het doelfragment in de transgene parasieten, terwijl er geen overeenkomstige banden werden gedetecteerd in de wildtypecontrole (Figuur 1A). Whole-genome resequencing toonde verder aan dat het gelineariseerde plasmide stabiel geïntegreerd was in het parasietgenoom, en de voorspelde integratieplaats werd gevalideerd door PCR-amplificatie over het junctiongebied (Figuur 1B).

...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol stelt een uitgebreide workflow vast voor het valideren van genomische integratie, eiwitexpressie en intracellulaire lokalisatie van exogene genen in transgene E. tenella. In plaats van te vertrouwen op één enkele assay, combineert de benadering genomisch en eiwitniveau bewijs, zodat transgeninsertie zowel structureel bevestigd als functioneel tot expressie komt.

Verschillende cruciale stappen in dit protocol hebben een grote invloed op he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program van China (2023YFD1802400).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antifade Mounting MediumMCEHYK1042Fluorescent mounting medium om fotobleken te voorkomen
BSA (3%)BeyotimeST023Blocking buffer en antilichaam verdunningsbuffer voor IFA; blokkeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min
Chloroform:isoamyl alcohol (24:1)SigmaC0549Reagens voor het verwijderen van restfenol tijdens genomische DNA extractie
Coccidia-Free ChickensBoehringer-IngelheimSPFGebruikt voor in vivo passage en amplificatie van transgene stammen; goedgekeurd door de Ethische Commissie (goedkeuringsnummer: CAU20160628-2)
CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide)Merck KGaAH5882Component van genomische DNA extractie buffer; formulering: 3 g CTAB + 12,27 g NaCl + 15 mL 1 mol/L Tris-HCl + 6 mL 0,5 mol/L EDTA, aangepast tot een eindvolume van 150 mL met ddH2O
DE-52 CelluloseSolarbioC8350Ionenuitwisselingschromatografie medium voor sporozoite zuivering; sequentieel behandeld met NaOH, HCl en gedistilleerd water, vervolgens geëquilibreerd met glycineoplossing
ECL Substraat (Oplossing A + Oplossing B)thermofisher32106Chemiluminescent detectiereagens; meng gelijke volumes van Oplossing A en B voor gebruik
FITC-geconjugeerd Goat Anti-Mouse IgGSigmaAP124FFluorescent secundair antilichaam voor IFA, verdunningsverhouding 1:200
GlaskralenSigmaZ250473-1PAK
Glycine oplossingSigma67419Equilibratie- en elutie buffer voor chromatografie kolommen; formulering: 0,75 g glycine + 7,9 g NaCl opgelost in 500 mL gedistilleerd water, pH aangepast naar 7,4-7,6, geautoclaveerd
Hoechst 33258Sigma94403Nucleaire kleuringsreagens, verdunningsverhouding 1:100; gebruikt voor IFA lokalisatie
HRP-geconjugeerd Goat Anti-Mouse IgGSigma12-349Secundair antilichaam voor Western blotting, verdunningsverhouding 1:2000
Illumina NovaSeq Sequencing PlatformPersonalbio Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China)Next-generation sequencing platform; paired-end sequencing (150 bp leeslengte), sequencing diepte 100×, genereert ≥6 GB ruwe data (Q20>90%)
Low Speed CentrifugeBEIJING ERA BEILI CENTRIFUGEDT5-2
Mouse Monoclonal Anti-Flag AntilichaamSigmaF1804Primair antilichaam, verdunningsverhouding 1:200; gebruikt voor IFA detectie van Flag-getagd fusie-eiwit
Mouse Monoclonal Anti-GAPDH AntilichaamSigmaG8795Primair antilichaam, verdunningsverhouding 1:2000; gebruikt als een ladingscontrole voor Western blotting
Nonfat Milk (5%)BeyotimeP0216Blocking buffer voor Western blotting; blokkeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of 4°C overnacht
Paraformaldehyde (4%)Merck KGaA30525Cel fixatie oplossing; fixeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min
PBSSolarbioP1010
Penicillin-Streptomycin (100×)Yeasen60162ES76Antibioticum voor celcultuur; remt microbiële besmetting
Percoll (DG gradiënt stockGE Healthcare17-0891-09
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)Merck KGaA77617Reagens voor eiwitverwijdering tijdens genomische DNA extractie
Protein Loading Buffer (6×)BeyotimeP0015FEiwitelektroforese ladingsbuffer; formulering: 100 mM Tris (pH 6,8), 4% SDS, 2 mM EDTA, 2% glycerol, 6 M ureum; meng met 50 μL 2 M DTT en 50 μL 5% broomfenolblauw voor gebruik
Proteinase KMerck KGaA39450-01-6200 mg opgelost in 10 mL ddH2O, gebruikt voor eiwitvertering tijdens genomische DNA extractie
PVDF Membraanthermofisher88518Eiwitoverdrachtsmembraan; geactiveerd met methanol gedurende 1 min voor gebruik
RIPA Lysis BufferYeasen20101Lysis buffer voor sporozoite eiwit extractie
RNase AMerck KGaA9001-99-425 mg opgelost in 2,5 mL 0,01 mol/L NaAc, verwarmd bij 100°C gedurende 10-15 min, pH aangepast naar 7,4 met 1 mol/L Tris-HCl; gebruikt voor RNA verwijdering uit DNA-monsters
SDS-PAGE Gel Reagents (Acrylamide, Bis-acrylamide, Tris, SDS, APS, TEMED)Bio101Reagentia voor SDS-PAGE gel bereiding; acrylamide concentratie aangepast aan het molecuulgewicht van het doeleiwit
Sodium taurodeoxycholate hydrateSigmaT0875
oplossing)
Taq Master Mix (2×)VazymeP112-01/02/03PCR amplificatie premix met behulp van Taq polymerase, dNTP's, enz.
Triton X-100 (0,25%)Merck KGaA9036Celpermeabilisatie oplossing; incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min
TrypsineSolarbioT8150
Vortex MixerBeijing North TZ-BiotechHQ-60-II
Water Bath ThermostatGrant Instruments (Cambridge)GD120,GM0815010

Referenties

  1. Saeed, M., et al. Feeding the future: A new potential nutritional impact of Lactiplantibacillus plantarum and its promising interventions in future for poultry industry. Poult Sci. 104, 105130 (2025).
  2. Blake, D. P., et al. Re-calculating the cost of coccidiosis in chickens. Vet Res. 51 (1), 115 (2020).
  3. Suo, X., et al. The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China. Vet Parasitol. 142 (1-2), 63-70 (2006).
  4. Qin, M., et al. Transfection of Eimeria mitis with yellow fluorescent protein as reporter and the endogenous development of the transgenic parasite. PLoS One. 9 (12), e114188 (2014).
  5. Hanig, S., et al. Chimeric fluorescent reporter as a tool for generation of transgenic Eimeria (Apicomplexa, Coccidia) strains with stage-specific reporter gene expression. Parasitol Int. 61 (3), 391-398 (2012).
  6. Tang, X. M., et al. Transgenic Eimeria tenella as a vaccine vehicle: Expressing TgSAG1 elicits protective immunity against Toxoplasma gondii infections in chickens and mice. Sci Rep. 6, 29379 (2016).
  7. Clark, J. D., et al. A toolbox facilitating stable transfection of Eimeria species. Mol Biochem Parasitol. 162 (1), 77-86 (2008).
  8. Fatoba, A. J., Adeleke, M. A. Transgenic Eimeria parasite: A potential control strategy for chicken coccidiosis. Acta Trop. 205, 105417 (2020).
  9. Sun, Y. Y., et al. Immunogenicity and protection against infectious bursal disease via a transgenic Eimeria acervulina expressing IBDV VP2-2C3d fusion protein. Vaccine. 64, 127715 (2025).
  10. Duan, C. H., et al. Nucleofection and in vivo propagation of chicken Eimeria parasites. J Vis Exp. (156), e156 (2020).
  11. Liu, Y. H., et al. Construction and identification of transgenic Eimeria tenella expressing IBDV VP2 protein. J Anim Sci Vet Med. 57 (2), 1008-1016 (2026).
  12. Chen, S. F., et al. Fastp: An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
  13. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  14. Pedersen, B. S., Quinlan, A. R. Mosdepth: Quick coverage calculation for genomes and exomes. Bioinformatics. 34 (5), 867-868 (2018).
  15. Sun, Y. Y., et al. Dual-copy VP2 expressed with CTA1-DD in transgenic Eimeria acervulina confers partial protection against infectious bursal disease virus. Poult Sci. 105 (2), 106238 (2026).
  16. Guo, Q. B., et al. Oral delivery of Eimeria acervulina transfected sequentially with two copies of the VP2 gene induces immunity against infectious bursal disease virus in chickens. Front Vet Sci. 11, 1367912 (2024).
  17. Zhang, S. X., et al. Establishment of recombinant Eimeria acervulina expressing multi-copies M2e derived from avian influenza virus H9N2. Vaccines (Basel). 9 (7), 791 (2021).
  18. Li, Y. R., et al. Genetic manipulation for the non-model protozoan Eimeria: Advancements, challenges, and future perspective. iScience. 28 (3), 112060 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Transgene Eimeriagenomische integratieeiwitexpressieEimeria tenellaextractie van genomisch DNAPCR amplificatiewhole genome resequencingWestern blottingimmunofluorescentie assaydetectie van recombinant eiwit

Gerelateerde artikelen