Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie en eencel-transcriptomische analyse van hepatocellulaire carcinoomorganoïden na medicamenteuze behandeling

495 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70511

⸱

26 mei 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst een gestroomlijnde methode voor het genereren van hepatocellulaire carcinoomorganoïden, het toepassen van medicamenteuze behandeling en het uitvoeren van single-cell RNA-sequencing voor en na de behandeling om therapiegerelateerde transcriptieveranderingen te karakteriseren.

Samenvatting

Hepatocellulair carcinoom is wereldwijd een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfte en wordt gekenmerkt door duidelijke intratumorale heterogeniteit, wat bijdraagt aan wisselende behandelingsreacties, tumorrecidief en ziekteprogressie. Een dieper begrip van hoe tumorcellen veranderen op transcriptieniveau vóór en na medicamenteuze behandeling is daarom essentieel om therapeutische strategieën te verbeteren. Echter, praktische experimentele workflows die organoïde-gebaseerde medicatiebehandeling koppelen aan downstream single-cell transcriptomic profiling blijven beperkt. In deze studie wordt een gestandaardiseerde workflow ontwikkeld voor het genereren van hepatocellulaire carcinoomorganoïden, het toepassen van gedefinieerde medicamenteuze behandeling en het uitvoeren van single-cell RNA-sequencing op monsters die voor en na de behandeling zijn verzameld. Het protocol omvat organoïde revival en -uitbreiding, kwaliteitsbeoordeling vóór de behandeling, blootstelling aan geneesmiddelen, organoïde voorbereiding voor single-cel dissociatie, bibliotheekconstructie en basis vergelijkende analyse van single-cell transcriptomische data. Er worden cruciale technische voorzorgsmaatregelen genomen om reproduceerbaarheid en monsterkwaliteit te verbeteren. Deze workflow maakt het mogelijk om naast elkaar te karakteriseren van cellulaire samenstelling en transcriptieveranderingen die samenhangen met medicamenteuze behandeling in hepatocellulaire carcinoomorganoïden. Het protocol is robuust, schaalbaar en aanpasbaar over verschillende organoïde systemen, en biedt een praktisch platform voor het onderzoeken van behandelingsgeassocieerde genexpressieveranderingen bij enkelcelresolutie.

Inleiding

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de meest voorkomende primaire leverkanker bij volwassenen en een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen wereldwijd 1,2,3. Het slechte klinische resultaat is te wijten aan significante intratumorale heterogeniteit, wat leidt tot therapieresistentie en recidief4. Een recente studie geeft aan dat ontwikkelingsdiversiteit en celtoestandplasticiteit, aangedreven door belangrijke transcriptieprogramma's zoals de FOXM1/CEBPB-as, bijdragen aan therapeutische resistentie in HCC5. Deze bevindingen benadrukken de noodzaak om te begrijpen hoe tumorcelpopulaties zich aanpassen en overgaan tussen toestanden onder langdurige behandeldruk. De meeste preklinische modellen vangen echter niet adequaat de dynamische, continue aard van deze behandelingsgeassocieerde toestandsovergangen, waardoor mechanistisch onderzoek naar tumoradaptatie en therapeutisch falen beperkt wordt.

Patiëntafgeleide organoïden (PDO's) bieden hiervoor een nuttig platform omdat ze belangrijke genomische veranderingen en cellulaire heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor6 behouden. HCC-organoïden kunnen in langdurige kweek worden behouden terwijl ze belangrijke weefselkenmerkenbehouden 7, waardoor ze bijzonder geschikt zijn voor therapie-responsstudies. Daarnaast hebben organoïde-gebaseerde studies aangetoond dat het haalbaar is om leverkankerorganoïden te gebruiken voor drugstesten en het vastleggen van interpatiënt en intratumorale verschillen in therapeutische sensitiviteit, wat hun waarde als preklinische modellen voor behandelingsresponsonderzoekondersteunt 8,9. De meeste organoïde-gebaseerde geneesmiddelstudies vertrouwen echter nog steeds voornamelijk op eindpunt-levensvatbaarheidsmetingen of richten zich vooral op bulkfenotypische responsen, waardoor slechts beperkte informatie wordt gegeven over heterogene cellulaire responsen en therapiegerelateerde transcriptieveranderingen. Tegelijkertijd onderstreept de snelle ontwikkeling van RNA-gebaseerde therapeutische strategieën voor HCC verder de noodzaak van preklinische systemen die behandelingsresponsen nauwkeurig kunnen voorspellen en mechanistisch kunnen ontleden bij single-cell resolutie10.

Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) maakt een hoogresolutiekarakterisering van cellulaire samenstelling en transcriptietoestanden binnen organoïde modellen11 mogelijk. Wanneer toegepast op organoïden die voor en na de behandeling zijn verzameld, kan scRNA-seq veranderingen in genexpressie, verschuivingen in celpopulaties en heterogene responsen onthullen die niet worden vastgelegd door bulkassays. Deze aanpak vormt daarom een praktische en krachtige strategie voor het onderzoeken van therapie-geassocieerde transcriptie-remodellering in HCC-organoïden. Er ontbreekt echter een praktische, reproduceerbare workflow die HCC-organoïdekweek, medicamenteuze behandeling en pre- en post-behandeling single-cell RNA-sequencing integreert. Zo'n workflow is het meest effectief wanneer de integriteit van organoïden wordt behouden tijdens geneesmiddelblootstelling en voldoende levensvatbare cellen worden teruggevonden voor downstream single-cel profilering. Net als bij andere organoïde-gebaseerde benaderingen zijn belangrijke beperkingen onder meer een onvolledige representatie van stromale, vasculaire en immuuncomponenten van de tumormicro-omgeving, evenals mogelijke selectiebias tijdens langdurige in vitro kweek.

Er wordt een geïntegreerde experimentele workflow beschreven voor het genereren van HCC-organoïden, het toepassen van gedefinieerde medicamenteuze behandeling en het verwerken van organoïdemonsters voor en na de behandeling van single-cell RNA-sequencing. Deze workflow omvat organoïde revival en uitbreiding, kwaliteitsbeoordeling vóór de behandeling, gecontroleerde blootstelling aan geneesmiddelen en downstream single-cell RNA-sequencing van gematchte monsters. De benadering biedt een praktisch kader om bij enkelcelresolutie behandelingsgerelateerde veranderingen in cellulaire samenstelling en genexpressieprogramma's in HCC-organoïden te vergelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Studies met menselijke weefsels werden beoordeeld en goedgekeurd door de Committees voor Ethische Beoordeling van Onderzoek van de Guangzhou Medische Universiteit (goedkeuringsnr. GYZL-2024-KY31). Alle procedures waarbij menselijke monsters betrokken zijn, werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor menselijk onderzoek. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle patiënten verkregen voor het gebruik van hun klinische monsters voor medisch onderzoek. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

Deze workflow omvat het herstel en de uitbreiding van cryopreserved hepatocellulaire carcinoomorganoïden, met kleine aanpassingen voor downstream therapeutische verstoring en single-cell RNA-sequencing. Het doel is om organoïde-culturen van voldoende kwaliteit en consistentie te genereren voor latere geneesmiddelenbehandelingsexperimenten12.

1. Vestiging en uitbreiding van organoïden afkomstig van HCC-patiënten

  1. Ontdooien en terugvinden van cryopreserveerde organoïden
    1. Bereiding vóór ontdooien
      1. Verwarm een waterbad vooraf tot 37 °C. Pre-equilibreer een 24-wellplaat in een 37 °C incubator voor minstens 1 uur voordat je wordt geplateerd.
      2. Bereid van tevoren een volledig organoïdekweekmedium voor en bewaar het basale membraanextract (BME) op ijs tot gebruik. De samenstelling van het volledige organoïde cultuurmedium wordt weergegeven in Aanvullende Tabel 1.
    2. Ontdooien van organoïden
      1. Verwijder cryovials met bevroren HCC-organoïden uit de opslag van vloeibare stikstof en plaats ze onmiddellijk in een waterbad van 37 °C.
      2. Beweeg het flesje voorzichtig en stop met ontdooien wanneer er slechts een klein ijskristal overblijft.
    3. Verwijdering van cryoprotectant
      1. Pipetteer de ontdooide suspensie voorzichtig één keer om de inhoud opnieuw op te hangen.
      2. Breng de suspensie over in een 15 mL conische buis met 3–5 mL volledig organoïde kweekmedium.
      3. Centrifugeer op 300 × g gedurende 5 minuten op 4 °C. Aspireer en gooi het supernatant voorzichtig af zonder het pelletje te verstoren.
  2. Inbedding en herplatering van organoïden
    1. Bereiding van een terugwinningsmengsel
      1. Suspendeer de organoïde pellet opnieuw in een volledig organoïde kweekmedium. De samenstelling van het volledige organoïde cultuurmedium wordt weergegeven in Aanvullende Tabel 1.
      2. Meng voorzichtig met een gelijke hoeveelheid ijskoude BME om het platingmengsel te maken.
        OPMERKING: Houd het mengsel op ijs om voortijdige polymerisatie te voorkomen.
    2. Platering van organoïde koepels
      1. Doseer 50 μL van het organoïde-matrixmengsel in elke put van een voorverwarmde 24-put plaat.
      2. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om matrixstolling mogelijk te maken.
      3. Voeg 500 μL volledig organoïde kweekmedium toe, aangevuld met 20 μM Y-27632, aan elke put langs de wand van de put.
        OPMERKING: Beperk het gebruik van Y-27632 tot de eerste 2–3 dagen na ontdooien of passeren. Zorg ervoor dat elke koepel compact blijft en aan de bodem van de put vastzit, zonder zich naar buiten te verspreiden.
  3. Organoïdecultuur en expansie
    1. Herstelcultuurvoorwaarden
      1. Houd organoïden op 37 °C met 5%CO-2.
      2. Gebruik medium met 20 μM Y-27632 gedurende de eerste 2–3 dagen na ontdooien.
    2. Medium vervanging
      1. Vervang het kweekmedium elke 3–4 dagen met een zachte aspiratie.
      2. Voeg vers medium toe langs de wand van elke put om te voorkomen dat matrixkoepels worden verstoord.
      3. Houd hetzelfde vervangingsschema voor het medium aan in alle putten binnen hetzelfde experiment.
    3. Groeimonitoring
      1. Monitor het herstel en de expansie van organoïden met een brightfieldmicroscoop met consistente beeldinstellingen.
      2. Neem representatieve beelden op op bepaalde tijdstippen tijdens herstel en expansie.
      3. Bevestig succesvol herstel wanneer het merendeel van de structuren intact blijft, organoïden ronde tot ovale morfologie vertonen met gladde randen, progressieve vergroting in de loop van de tijd wordt waargenomen en er minimale puin of ingestorte structuren aanwezig zijn.
      4. Sluit putten met minder dan 10 intacte organoïden uit van de kwantitatieve analyse van de downstream analyse.
    4. Criteria voor goedkeuring en uitbreiding
      1. Passageorganoïden na stabiele expansie worden waargenomen.
      2. Bevestig stabiele expansie door reproduceerbare toename van organoïde grootte of totale oppervlakte met behouden morfologie.
      3. Gebruik consistente beeldvormingsintervallen, vergrotings- en inclusiecriteria in alle experimenten.
      4. Genereer representatieve groeicurves op basis van organoïde gebied of tellingen om stabiliteit te bevestigen.
    5. Criteria voor downstream-experimenten
      1. Gebruik organoïdelijnen die stabiele driedimensionale groei vertonen, geen besmetting of uitgebreide instorting vertonen, en voldoende opbrengst bieden voor parallelle experimentele omstandigheden.
      2. Houd de kweek minimaal 7–10 dagen na het ontdooien of tot het herstel en één expansiecyclus is voltooid.
      3. Alleen organoïde lijnen vertonen consistente morfologie over replicate putten.

2. Bereiding van organoïden voor therapeutische verstoring

  1. Kwaliteitsbeoordeling voorafgaand aan de behandeling
    1. Morfologie-gebaseerde beoordeling
      1. Bevestig dat organoïden rond tot ovaal zijn in morfologie.
      2. Controleer of organoïden soepele en goed gedefinieerde randen tonen.
      3. Controleer minimaal celvuil in de koepel.
      4. Sluit culturen met uitgebreide fragmentatie, donkere lumen, grootschalige inzakking of duidelijke besmetting uit.
    2. Expansie-staat beoordeling
      1. Gebruik alleen organoïde-culturen die hersteld zijn en stabiele expansie hebben doorgemaakt.
      2. Bevestig geleidelijke vergroting in de loop van de tijd.
      3. Bevestig consistente morfologie over replicate putten.
  2. Herplatering van organoïden voor medicamenteuze behandeling
    1. Terugwinning van organoïden uit matrix
      1. Los organoïde koepels op ijs op met 1 ml ijskoude cel hersteloplossing per put gedurende 15–20 minuten.
      2. Pipette voorzichtig elke 5 minuten tijdens de incubatie.
      3. Centrifugeer de teruggewonnen suspensie op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      4. Sussen de pellet opnieuw in een volledig organoïde kweekmedium.
    2. Standaardisatie vóór herbeplating
      1. Standaardiseer de startlast van organoïden in putjes vóór medicamenteuze behandeling.
      2. Bepaal het levensvatbare celaantal na gedeeltelijke dissociatie waar mogelijk.
      3. Normaliseer samples naar hetzelfde aantal inputcellen per put.
      4. Plat ongeveer 1.000–5.000 levensvatbare cellen per put in een 24-well-formaat.
      5. Als directe celtelling niet wordt uitgevoerd, normaliseer dan door een vergelijkbaar aantal morfologisch intacte organoïden per put te garanderen en een vergelijkbare grootteverdeling over groepen.
      6. Noteer het aantal initiële organoïden en de basismorfologie van elke put vóór de behandeling.
      7. Gebruik identieke inclusiecriteria en verlagingsstrategie over alle putten binnen hetzelfde experiment.
    3. Herplating voor medicatiebehandeling
      1. Meng teruggewonnen organoïden met ijskoude basale membraanmatrix bij een uiteindelijke concentratie van 30%–50%.
      2. Doseer 50 μL koepels in elke put van een 24-put plaat.
      3. Incubeer op 37 °C gedurende 30 minuten om polymerisatie mogelijk te maken.
      4. Voeg 500 μL complete organoïdecultuur per put toe langs de wand van de put.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat elke koepel compact blijft en aan de bodem van de put vastzit, zonder zich naar buiten te verspreiden. Gebruik identieke koepelvolume en matrixconcentratie over alle putten binnen hetzelfde experiment.
  3. Herstel vóór medicatiebehandeling
    1. Herstel na het opnieuw plateren
      1. Laat organoïden 's nachts herstellen onder standaard kweekomstandigheden.
      2. Begin pas met de behandeling nadat de intacte morfologie is hersteld binnen de opnieuw geplateerde koepels.
    2. Toelatingscriteria voor drugsbehandeling
      1. Start medicatiebehandeling alleen wanneer organoïden intact blijven na het opnieuw plateren, er geen grootschalige inzakking of overmatig vuil aanwezig is, en de organoïde last vergelijkbaar is tussen putten.
      2. Neem baseline brightfield-beelden op voor alle experimentele groepen vóór de behandeling.
      3. Houd dezelfde beginlast van organoïden, hersteltijd na het opnieuw plateren en de starttijd van de behandeling over alle controle- en behandelde putten.
  4. Veiligheidsoverwegingen
    1. Voer alle procedures uit waarbij organoïden afkomstig zijn van mens, met passende persoonlijke beschermingsmiddelen en bioveiligheidspraktijken.
    2. Behandel enzymatische dissociatie-reagentia voorzichtig om blootstelling aan huid of ogen te voorkomen.
    3. Verwijder vloeibaar en vast biologisch afval volgens de institutionele bioveiligheidsvoorschriften.

3. Medicatiebehandeling van HCC-organoïden

  1. Medicatiebereiding en behandeling
    1. Medicijnbereiding
      1. Bereid lenvatinib-bouillonoplossing in DMSO volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Verdun de bouillonoplossing direct voor gebruik in voorverwarmd kweekmedium tot de vooraf vastgestelde werkconcentratie.
      3. Behoud dezelfde uiteindelijke DMSO-concentratie in alle putten (≤ 0,1%).
      4. Bereid voldoende volume voor om een gelijk eindbehandelvolume in elke put te garanderen.
    2. Drugsbehandeling
      1. Voeg lenvatinib-houdend medium (20 μM) toe langs de wand van elke put om matrixkoepels niet te verstoren.
      2. Voeg een voertuigbesturing toe met dezelfde uiteindelijke DMSO-concentratie.
      3. Incubeer organoïden onder standaard kweekomstandigheden gedurende de vooraf bepaalde behandelperiode.
      4. Vervang het medium met geneesmiddelen elke 48–72 uur voor behandelingsduur langer dan 72 uur.
      5. Gebruik hetzelfde vervangingsschema voor medium in alle putten binnen het experiment.
      6. Registreer baseline brightfield-beelden vóór de behandeling.
      7. Maak beelden op vaste intervallen tijdens de behandeling met identieke microscoopinstellingen, vergroting en veldposities.
  2. Beoordeling van de behandelingsrespons
    1. Morfologie-gebaseerde evaluatie
      1. Evalueer de behandelingsrespons met behulp van de volgende beeldgebaseerde metingen: groeicurve van het organoïdegebied, gemiddelde organoïdediameter en overgebleven organoïde-telling.
      2. Gebruik identieke belichtingsinstellingen, vergrotings- en analysedrempels voor alle beelden.
      3. Meet de groeicurve van het organoïdegebied door het totale organoïdeoppervlak per put of veld op elk tijdstip te berekenen en te normaliseren naar de basislijn.
      4. Meet de gemiddelde organoïdediameter door de diameter van individuele intacte organoïden te bepalen en de gemiddelde waarde per put te berekenen.
      5. Bepaal het overgebleven aantal organoïden door morfologisch identificeerbare intacte organoïden te tellen en afval en ingestorte fragmenten uit te sluiten.
    2. Optionele levensvatbaarheidsmeting
      1. Voer een driedimensionale luminescentie-levensvatbaarheidstest uit bij het behandel-eindpunt als aanvullende bulk-levensvatbaarheidsbeoordeling nodig is.
      2. Volg de instructies van de fabrikant voor de uitvoering van de assay.
  3. Data-analyse
    1. Teken de groeicurves van het organoïde gebied in de tijd uit.
    2. Vergelijk de gemiddelde organoïdediameter tussen de door het voertuig behandelde en de met lenvatinib behandelde groepen.
    3. Vergelijk overgebleven organoïdentellingen tussen behandelgroepen.
    4. Pas identieke beeldverwervingsschema's, inclusiecriteria voor organoïden en analyseparameters toe op alle groepen om reproduceerbaarheid te waarborgen.

4. Bereiding van organoïden voor single-cell RNA-sequencing

  1. Selectie en terugwinning van organoïden
    1. Pre-dissociatiebeoordeling
      1. Selecteer organoïde putten die intacte driedimensionale morfologie vertonen zonder wijdverspreide instorting, voldoende materiaal bevatten voor downstream single-cel vangst en geen duidelijke besmetting vertonen.
      2. Verzamel organoïden op overeenkomende experimentele tijdstippen over controle- en behandelde monsters.
      3. Houd dezelfde platingdichtheid, behandelingsschema en mediumvervangingscondities aan over de monsters.
      4. Neem helderveldbeelden van elk geselecteerd op ruim vóór dissociatie met identieke microscoopinstellingen, vergroting en veldselectiecriteria.
    2. Verwijdering van de matrix
      1. Aspiratief kweekmedium volledig uit elke put.
      2. Was elke bron twee keer met ijskoude PBS om restmateriaal en vuil te verwijderen.
      3. Voeg 1 ml ijskoude celhersteloplossing toe aan elke put.
      4. Broed 20–30 minuten op ijs.
      5. Pipette voorzichtig elke 5–7 minuten tijdens de incubatie om de matrixoplossing te vergemakkelijken.
      6. Overbreng opgelost materiaal in voorgekoelde buizen met behulp van een brede of afgeknipte pipettip om schuifspanning te minimaliseren.
      7. Ga pas over tot enzymatische dissociatie nadat de matrix grotendeels is opgelost en er minimaal zichtbaar gelresidu overblijft.
  2. Enzymatische dissociatie en single-cell suspensiebereiding
    1. Enzymatische dissociatie
      1. Centrifugeer de teruggewonnen organoïde suspensie op 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      2. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder het pelletje te verstoren.
      3. Suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL recombinant celdissociatie-enzym.
      4. Broeden 5–10 minuten op 37 °C.
      5. Pipette voorzichtig 8–10 keer elke 2–3 minuten met een brede P1000-tip om dissociatie te bevorderen.
      6. Stop de vertering wanneer de meeste organoïde fragmenten zijn verspreid in enkele cellen en alleen kleine restclusters overblijven.
      7. Voorkom langdurige vertering om verminderde cellevensvatbaarheid, stressgerelateerde transcriptie-artefacten en verhoogde omgevings-RNA-contaminatie te voorkomen.
    2. Afkoelen en filtratie
      1. Voeg 4 ml ijskoude PBS toe met 2% foetaal rundvleesserum om de spijsvertering te stoppen.
      2. Filter de suspensatie door een 40 μm celfilter.
      3. Was één keer met PBS om restenzymen, aggregaten en vuil te verwijderen.
      4. Voer rode bloedcel-lyse uit als er erytrocytenbesmetting aanwezig is, volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Celvoorbereiding en kwaliteitscontrole
      1. Tel cellen met trypan blue exclusion.
      2. Bepaal de levensvatbaarheid van cellen voordat je de bibliotheek voorbereidt.
      3. Gebruik alleen monsters met levensvatbaarheid ≥ 85%.
      4. Pas de eindcelconcentratie aan op 700–1.200 cellen/μL.
      5. Sluit monsters met overmatig afval, overvloedige dode cellen, grote zichtbare aggregaten of onvolledige dissociatie uit.
      6. Herhaal de filtratie vóór het laden als er aggregaten aanwezig zijn.
      7. Procescontrole en behandelde monsters onder identieke omstandigheden, waaronder het dissociatie-enzym, de verteringstijd, de pipetfrequentie, de filtratiemethode, de celconcentratie en de laadstrategie.
  3. Single-cell bibliotheekvoorbereiding en sequencing
    1. Single-cell vangst en bibliotheekvoorbereiding
      1. Laad de voorbereide single-cell suspension op een druppelgebaseerd single-cell capture platform volgens de instructies van de fabrikant.
      2. Voer reverse transcriptie, cDNA-amplificatie en bibliotheekconstructie uit met behulp van de bijbehorende single-cell 3′ workflow.
    2. Sequencingparameters
      1. Sequentiebibliotheken op een diepte van minstens 50.000 lezingen per cel.
      2. Load cells om een herstel van ongeveer 6.000–10.000 cellen per bibliotheek te bereiken.
      3. Noteer de volgordechemie, leesstructuur en instrumentinstellingen.
  4. Kwaliteitscriteria voor downstream-analyse
    1. Zorg ervoor dat de uiteindelijke voorbereiding een hoge cellenlevensvatbaarheid heeft, minimaal afval en een lage aggregate belasting.
    2. Bevestig geschiktheid voor downstream single-cell transcriptomische analyse van cellulaire heterogeniteit en cel-toestandovergangen.

5. Basisverwerking en kwaliteitscontrole van single-cell RNA-sequencinggegevens

  1. Primaire verwerking
    1. Generatie van telmatrix
      1. Verwerk ruwe sequencinggegevens met behulp van de aanbevolen pijplijn voor het geselecteerde platform.
      2. Genereer een gen-per-cel tellingmatrix.
      3. Registreer de softwareversie, referentie-genoombouw en het vrijgeven van transcriptannotatie.
    2. Initiële kwaliteitsbeoordeling op bibliotheekniveau
      1. Vat sequencing-metrics voor elke bibliotheek samen, inclusief het totale aantal reads, geschat aantal teruggevonden cellen, mediane genen per cel, mediaan UMI's per cel en sequencingsaturatie (indien van toepassing).
      2. Gebruik identieke referentiegenoom- en annotatie-instellingen voor alle monsters.
  2. Kwaliteitscontrole op celniveau
    1. Filtering van cellen van lage kwaliteit
      1. Evalueer voor elke cel het aantal gedetecteerde genen, het totale UMI-aantal, het aandeel mitochondriale transcripten en het bewijs van dubbelen of multiplets.
      2. Cellen met extreem lage genentellingen, extreem lage UMI-waarden of abnormaal hoge mitochondriale transcriptfracties uitsluiten.
      3. Definieer filterdrempels op basis van de datasetverdeling.
      4. Pas identieke drempels toe over de gematchte behandelgroepen.
    2. Verwijdering van waarschijnlijke dubbelen
      1. Identificeer waarschijnlijke dubbelen met een geschikte computationele methode.
      2. Verwijder doublets met behulp van een platformcompatibele detectieworkflow.
      3. Pas dezelfde dubbeldetectiestrategie toe op alle monsters.
  3. Normalisatie, clustering en annotatie
    1. Datanormalisatie
      1. Normaliseer de gefilterde telmatrix met behulp van een standaard single-cell RNA-seq workflow.
      2. Pas identieke normalisatieprocedures toe op alle monsters.
    2. Dimensionaliteitsreductie en clustering
      1. Voer dimensionaliteitsreductie uit.
      2. Voer ongecontroleerde clustering uit om belangrijke transcriptiepopulaties te identificeren.
      3. Visualiseer celtoestanden met een laag-dimensionale embeddingmethode zoals UMAP.
    3. Markergenidentificatie
      1. Identificeer markergenen met behulp van differentiële expressieanalyse tussen clusters.
      2. Ken biologische interpretatie toe aan belangrijke epitheelceltoestanden op basis van markerexpressie.
  4. Vergelijkende analyse van behandelingsomstandigheden
    1. Metadata-integratie
      1. Annoteer elke cel met behandelingsconditie, door de patiënt afgeleide organoïdelijn en verwerkingsbatch.
      2. Houd een consistente metadatastructuur bij over alle steekproeven.
    2. Analyse van behandelingsgerelateerde veranderingen
      1. Vergelijk controle- en behandelde monsters.
      2. Identificeer therapie-geassocieerde transcriptionele remodellering.
      3. Identificeer verschuivingen in cel-toestandssamenstelling.
      4. Identificeer kandidaat-celpopulaties die geassocieerd zijn met therapeutische adaptatie.
      5. Interpreteer resultaten samen met morfologie-gebaseerde en levensvatbaarheidsmetingen.
  5. Data-analyse output
    1. Genereer een kwaliteitsgecontroleerde gen-per-cel tellingmatrix.
    2. Genereer laagdimensionale visualisaties van transcriptieel verschillende populaties.
    3. Identificeer markergenen voor grote clusters.
    4. Behoud consistentie over alle monsters in het referentiegenoom, preprocessingworkflow, filtercriteria, clusteringstrategie en annotatiecriteria.
    5. Documenteer eventuele afwijkingen van de standaardworkflow die specifiek op het voorbeeld zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 geeft een schetsing van de generatie en karakterisering van hepatocellulair carcinoom (HCC) organoïden. In Figuur 1A werden patiëntafgeleide tumorweefsels gebruikt om organoïde culturen vast te stellen voor histologische analyse en behandelingsstudies. Figuur 1B toont helderveldbeelden van organoïden op dag 1 en 6 na het herstel, wat overleving en expansie onder standaard driedimensionale k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om reproduceerbaarheid, efficiëntie en hoogwaardige single-cell transcriptomische analyse te waarborgen, vereisen verschillende technische stappen in deze workflow zorgvuldige controle. Consistentie tijdens het herstel en de uitbreiding van door patiënten afgeleide HCC-organoïden is essentieel, omdat variaties in zaaidichtheid, samenstelling van basale membraanmatrix en kweektiming de morfologie, groei en downstream behandelingsresponsen van organoïdenkunnen<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), de Guangdong Foundation voor Basis- en Toegepast Basisonderzoek (2023A1515011416) en de Guangzhou Foundation voor Basis- en Toegepast Basisonderzoek (2024A04J6575). Sommige schematische elementen zijn gemaakt met behulp van Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) en zijn door de auteurs aangepast. Schematische illustraties werden gemaakt met Figdraw (https://www.figdraw.com) en aangepast door de auteurs.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
[Leu15]-gastrin I humanMerckG9145
1.5 mL MicrotubesMerckAXYMCT150LC
1X RBC Lysis BufferThermo Fisher Scientific00-4333-57
2.0ml Internal Thread Cryogenic VialsNest607001
A8301 (TGFb inhibitor)Tocris Bioscience2939
AFP Polyclonal antibodyProteintech14550-1-AP
Anti-Albumin antibody [ALB/2144]abcamab236492
Anti-HNF-4-alpha antibody [EPR16885] - ChIP Gradeabcamab181604
Anti-Prealbumin antibody [EPR3219]abcamab92469
Anti-SOX9 antibody [EPR14335-78]abcamab185966
B27 Supplement (503), minus vitamin AThermo Fisher Scientific12587010
Cell Recovery Solution, 100 mLCorning354253Reagens gebruikt om basement membrane matrix op te lossen en organoïden te herstellen voor herplanten of verwerking in volgende stappen
CellTiter-Glo® 3D Cell Viability AssayPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.110x GenomicsCG000227
Corning Cell Strainer, 40 μm, Blue, S, IND, 1/50Corning431750
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, SterileCorning3473
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Extracellulaire matrix gebruikt om driedimensionale organoïdcultuur en domevorming te ondersteunen
DMSOMerckC6164Oplosmiddel gebruikt om drugsstockoplossingen en voertuigregelingsoplossingen voor te bereiden
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12Thermo Fisher Scientific12634028Geavanceerd DMEM/F-12
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Tyrosinekinaseremmer gebruikt voor organoïdbehandeling en therapeutische verstoring
Fetal Bovine Serum Value FBSGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscience1099
GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific35050061
Hematoxylin and Eosin Staining KitBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Leica DM6 B Fluorescerende gemotoriseerde microscoopLeicaN/A
N2 supplement (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acetylcysteïneMerckA0737-5MG
NicotinamideMerckN0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific339651
Penicillin/streptomycin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Phosphate-Buffered SalineGENOM BIOGNM20012Buffer gebruikt voor het wassen van organoïden en het voorbereiden van monsters voor verwerking in volgende stappen
Recombinant human EGFPeprotechAF-100-15
Recombinant human FGF10Peprotech100-26
Recombinant human HGFPeprotech100-39
Recombinant human NogginPeprotech120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochlorideMerckY0503ROCK-remmer gebruikt om organoïdoverleving na ontdooien of passeren te verbeteren
R-spodin1-geconditioneerd medium(Broutier et al.)N/ASecretie van cellijnen
Trypan Blue Stain, 0,4% membraan gefilterd, bereid in 0,85% zoutoplossingGibco15250061
TrypLE Express Enzyme (1x), geen fenolroodThermo Fisher Scientific12604013Trypsine-substituut
Wnt-3a-geconditioneerd medium(Broutier et al.)N/ASecretie van cellijnen

Referenties

  1. Villanueva, A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 380 (15), 1450-1462 (2019).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Safri, F., et al. Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications. Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).
  5. Zhang, X. F., et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).
  6. Thorel, L., et al. Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology. Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).
  7. Liu, Y., et al. A decade of liver organoids: advances in disease modeling. Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).
  8. Li, L., et al. Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity. JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).
  9. Yang, H., et al. Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).
  10. Xing, L., et al. RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives. Hepatoma Res. 10, 24 (2024).
  11. Aissa, A. F., et al. Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer. Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).
  12. Zhang, C. Y., et al. Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery. J Vis Exp. (198), e65785 (2023).
  13. Wang, Q., et al. Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments. Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).
  14. Yang, C., et al. Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research. Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).
  15. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  16. Yip, S., et al. Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids. Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).
  17. Zhou, C., et al. Standardization of organoid culture in cancer research. Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Single-cell RNA-sequencingrespons op medicijnbehandelingdrugscreening in organoïdendissociatie van organoïdencelviabiliteitsassayanalyse van organoïdemorfologiegenexpressieprofileringtumorheterogeniteitpathway-verrijkingsanalyse
Generatie en eencel-transcriptomische analyse van hepatocellulaire carcinoomorganoïden na medicamenteuze behandeling
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.