Generatie en eencel-transcriptomische analyse van hepatocellulaire carcinoomorganoïden na medicamenteuze behandeling

Summary

Dit protocol schetst een gestroomlijnde methode voor het genereren van hepatocellulaire carcinoomorganoïden, het toepassen van medicamenteuze behandeling en het uitvoeren van single-cell RNA-sequencing voor en na de behandeling om therapiegerelateerde transcriptieveranderingen te karakteriseren.

Abstract

Hepatocellulair carcinoom is wereldwijd een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfte en wordt gekenmerkt door duidelijke intratumorale heterogeniteit, wat bijdraagt aan wisselende behandelingsreacties, tumorrecidief en ziekteprogressie. Een dieper begrip van hoe tumorcellen veranderen op transcriptieniveau vóór en na medicamenteuze behandeling is daarom essentieel om therapeutische strategieën te verbeteren. Echter, praktische experimentele workflows die organoïde-gebaseerde medicatiebehandeling koppelen aan downstream single-cell transcriptomic profiling blijven beperkt. In deze studie wordt een gestandaardiseerde workflow ontwikkeld voor het genereren van hepatocellulaire carcinoomorganoïden, het toepassen van gedefinieerde medicamenteuze behandeling en het uitvoeren van single-cell RNA-sequencing op monsters die voor en na de behandeling zijn verzameld. Het protocol omvat organoïde revival en -uitbreiding, kwaliteitsbeoordeling vóór de behandeling, blootstelling aan geneesmiddelen, organoïde voorbereiding voor single-cel dissociatie, bibliotheekconstructie en basis vergelijkende analyse van single-cell transcriptomische data. Er worden cruciale technische voorzorgsmaatregelen genomen om reproduceerbaarheid en monsterkwaliteit te verbeteren. Deze workflow maakt het mogelijk om naast elkaar te karakteriseren van cellulaire samenstelling en transcriptieveranderingen die samenhangen met medicamenteuze behandeling in hepatocellulaire carcinoomorganoïden. Het protocol is robuust, schaalbaar en aanpasbaar over verschillende organoïde systemen, en biedt een praktisch platform voor het onderzoeken van behandelingsgeassocieerde genexpressieveranderingen bij enkelcelresolutie.

Introduction

Hepatocellulair carcinoom (HCC) is de meest voorkomende primaire leverkanker bij volwassenen en een belangrijke oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen wereldwijd ^1,2,3. Het slechte klinische resultaat is te wijten aan significante intratumorale heterogeniteit, wat leidt tot therapieresistentie en recidief⁴. Een recente studie geeft aan dat ontwikkelingsdiversiteit en celtoestandplasticiteit, aangedreven door belangrijke transcriptieprogramma's zoals de FOXM1/CEBPB-as, bijdragen aan therapeutische resistentie in H....

Protocol

Studies met menselijke weefsels werden beoordeeld en goedgekeurd door de Committees voor Ethische Beoordeling van Onderzoek van de Guangzhou Medische Universiteit (goedkeuringsnr. GYZL-2024-KY31). Alle procedures waarbij menselijke monsters betrokken zijn, werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor menselijk onderzoek. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd van alle patiënten verkregen voor het gebruik van hun klinische monsters voor medisch onderzoek. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

Deze workflow omvat het hers....

Results

Figuur 1 geeft een schetsing van de generatie en karakterisering van hepatocellulair carcinoom (HCC) organoïden. In Figuur 1A werden patiëntafgeleide tumorweefsels gebruikt om organoïde culturen vast te stellen voor histologische analyse en behandelingsstudies. Figuur 1B toont helderveldbeelden van organoïden op dag 1 en 6 na het herstel, wat overleving en expansie onder standaard driedimensionale k.......

Discussion

Om reproduceerbaarheid, efficiëntie en hoogwaardige single-cell transcriptomische analyse te waarborgen, vereisen verschillende technische stappen in deze workflow zorgvuldige controle. Consistentie tijdens het herstel en de uitbreiding van door patiënten afgeleide HCC-organoïden is essentieel, omdat variaties in zaaidichtheid, samenstelling van basale membraanmatrix en kweektiming de morfologie, groei en downstream behandelingsresponsen van organoïden^{kunnen<.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-gastrin I human	Merck	G9145
1.5 mL Microtubes	Merck	AXYMCT150LC
1X RBC Lysis Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-4333-57
2.0ml Internal Thread Cryogenic Vials	Nest	607001
A8301 (TGFb inhibitor)	Tocris Bioscience	2939
AFP Polyclonal antibody	Proteintech	14550-1-AP
Anti-Albumin antibody [ALB/2144]	abcam	ab236492
Anti-HNF-4-alpha antibody [EPR16885] - ChIP Grade	abcam	ab181604
Anti-Prealbumin antibody [EPR3219]	abcam	ab92469
Anti-SOX9 antibody [EPR14335-78]	abcam	ab185966
B27 Supplement (503), minus vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587010
Cell Recovery Solution, 100 mL	Corning	354253	Reagent used to dissolve basement membrane matrix and recover organoids before replating or downstream processing
CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
CHIR99021	Merck	SML1046
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1	10x Genomics	CG000227
Corning Cell Strainer, 40 μm, Blue, S, IND, 1/50	Corning	431750
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile	Corning	3473
Cultrex Reduced Growth Factor BME, Type 2 PathClear (BME)	Merck	3533-005-02	Extracellular matrix used to support three-dimensional organoid culture and dome formation
DMSO	Merck	C6164	Solvent used to prepare drug stock solutions and vehicle control
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Thermo Fisher Scientific	12634028	Advanced DMEM/F-12
E7080 (Lenvatinib)	Selleck	S1164	Tyrosine kinase inhibitor used for organoid treatment and therapeutic perturbation
Fetal Bovine Serum Value FBS	Gibco	A5256701
Forskolin	Tocris Bioscience	1099
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime	C0105S
HEPES, 1 M	Thermo Fisher Scientific	15630080
Leica DM6 B Fluorescence Motorized Microscope	Leica	N/A
N2 supplement (1003)	Thermo Fisher Scientific	17502048
N-acetylcysteine	Merck	A0737-5MG
Nicotinamide	Merck	N0636
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphate-Buffered Saline	GENOM BIO	GNM20012	Buffer used for washing organoids and preparing samples for downstream processing
Recombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
Recombinant human FGF10	Peprotech	100-26
Recombinant human HGF	Peprotech	100-39
Recombinant human Noggin	Peprotech	120-10C
Rho kinase inhibitor Y-27632 dihydrochloride	Merck	Y0503	ROCK inhibitor used to enhance organoid survival after thawing or passaging
R-spodin1-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines
Trypan Blue Stain, 0.4% membrane filtered Prepared in 0.85% saline	Gibco	15250061
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604013	Trypsin substitute
Wnt-3a-conditioned medium	(Broutier et al.)	N/A	Secretion of cell lines