Medium-throughput kolom DNA-extractie met behulp van 24-well racks

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve methode om de extractie van plasmide-DNA te versnellen. Door gebruik te maken van op maat gemaakte 3D-geprinte rekken die compatibel zijn met standaard schandelbakplaatrotoren, kunnen onderzoekers tot 48 spinkolommen met doppen of tot 116 spinkolommen zonder doppen tegelijk verwerken, wat de verwerkingstijd aanzienlijk vermindert vergeleken met handmatige microcentrifugemethoden.

Samenvatting

Silica-membraan spinkolomextractie is de standaard voor hoogwaardige DNA-zuivering, maar is arbeidsintensief en moeilijk handmatig op te schalen buiten kleine batches. Bestaande geautomatiseerde vloeistofbehandelingsrobots zijn vaak nog steeds te duur voor kleine en middelgrote laboratoria. Dit artikel presenteert een gestroomlijnde, semi-geautomatiseerde aanpak met behulp van op maat ontworpen, 3D-geprinte rekken die standaard centrifugatieplaatrotors passen.

Het voorgestelde systeem maakt de parallelle verwerking van maximaal 116 standaard commerciële spinkolommen mogelijk. Het rackontwerp biedt ruimte voor een "geneste" configuratie, waardoor gelijktijdige lysaatklaring (via filtratiekolommen) en DNA-binding (via silicakolommen) in één enkele centrifugatiestap mogelijk is. Bovendien bevat het ontwerp een gedeeld afvalreservoir, waardoor het niet nodig is om de doorstroming van individuele buizen tijdens wasstappen weg te gooien.

Deze methode bereikt DNA-opbrengst en zuiverheid vergelijkbaar met standaard handmatige protocollen, maar vermindert de totale verwerkingstijd met ongeveer 50–70% voor monsterbatches groter dan 24 (60–90 minuten in plaats van 120–180 minuten). De totale tijd die nodig is voor stappen zoals lysaatfiltratie, washes en afvalverwijdering wordt met 5–10 minuten verminderd, ongeacht het aantal verwerkte monsters. Deze open-source hardwarebenadering overbrugt de kloof tussen handmatige minipreps en dure automatisering.

Inleiding

De isolatie van nucleïnezuren met behulp van silica-matrices werd voor het eerst opgehelderd in 1979 door Vogelstein en Gillespie, die het fundamentele principe vaststelden van het adsorberen van DNA-fragmenten tot glaspoeder in aanwezigheid van hoge concentraties chaotrope zouten, specifiek natriumjodide¹. Deze doorbraak bood een veiliger, efficiënter alternatief voor de giftige fenol-chloroformextractie en de arbeidsintensieve cesiumchloridegradiënt ultracentrifugatiemethoden die het tijdperk domineerden. Vervolgens optimaliseerden Boom en coauteurs deze methodologie aanzienlijk door guanidiniumthiocyanaat (GuSCN) als primaire chaotrope agent² te introduceren. Deze innovatie was cruciaal, omdat GuSCN tegelijkertijd werkt als een krachtig eiwitdenaturant om cellen te laten smelten en als een sterke remmer van RNases en DNases, waardoor de integriteit van nucleïnezuren tijdens de initiële extractiefasen behouden blijft.

Sinds de introductie is deze vaste-fase extractietechnologie—algemeen bekend als de "Boom-methode"—grondig verfijnd. Het is aangepast om nucleïnezuren te isoleren uit steeds complexere biologische matrices, variërend van bacterieel plasmide³ en genomisch DNA⁴ tot eukaryote mitochondriale⁵ en genomisch DNA met hoog moleculair gewicht. Bovendien is de technologie opgeschaald voor klinische en forensische toepassingen, waaronder de isolatie van celvrij circulerend DNA uit plasma⁶, het extraheren van hardnekkig plantaardig DNA en RNA rijk aan polyfenolen⁷, en de zuivering van virale nucleïnezuren⁸. Er zijn ook veel commerciële bouwpakketten met spinkolommen beschikbaar.

Het fysisch-chemische mechanisme dat aan dit proces ten grondslag ligt, is afhankelijk van de verstoring van de waterstructuur door chaotrope ionen. Bij een hoge ionische sterkte en lage pH worden de hydratatieschalen rondom zowel de nucleïnezuurfosfaatruggengraat als het silica-oppervlak verwijderd (uitdroging). Dit bevordert de vorming van kationbruggen—meestal gemedieerd door Na⁺ of chaotrope kationen—tussen de negatief geladen silanolgroepen op het silicaoppervlak en de fosfaatgroepen van het nucleïnezuur. Selectiviteit met betrekking tot nucleïnezuurtype (DNA versus RNA) en fragmentlengte wordt bereikt door de precieze modulatie van de bufferchemie. Zo kunnen specifieke zoutconcentraties en pH-waarden de binding van lange genomische strengen boven korte oligonucleotiden bevorderen, of onderscheid maken tussen RNA en DNA. Daarnaast maken moderne versies van deze technologie vaak gebruik van aangepaste silica-oppervlakken om de differentiële adsorptie-isothermen van specifieke nucleïnezuursoorten te versterken.

De canonieke workflow voor silica-gebaseerde nucleïnezuurzuivering verloopt door vier verschillende fasen: (1) Lysis, waarbij het biologische uitgangsmateriaal wordt gehomogeniseerd en cellulaire structuren worden gedesintegreerd, vaak met behulp van alkalische omstandigheden of detergenten (SDS/Triton); (2) Klaring, waarbij cellulair afval, neergeslagen eiwitten en polysacchariden worden verwijderd om verstopping van kolommen te voorkomen; (3) Binding, waarbij het supernatant wordt aangepast met chaotrope zouten en ethanol om adsorptie naar het silicamembraan te bevorderen; en (4) Washing, waarbij de membraangebonden nucleïnezuren worden gespoeld met alcoholhoudende buffers om resterende zouten en remmers te verwijderen voordat ze worden geelueerd in een buffer met lage ionische sterkte.

Hoewel de chemie van dit proces robuust is, blijft de mechanische behandeling van individuele spinkolommen een belangrijke bottleneck voor medium-throughput workflows (24–100 monsters), wat een kloof creëert tussen handmatige verwerking en dure geautomatiseerde vloeistofbehandelingssystemen. Bestaande benaderingen om handmatige kolomgebaseerde nucleïnezuurextractie te vereenvoudigen omvatten vacuümmanifolds en robotwerkstations voor geautomatiseerde zuivering ^9,10,11,12.

Vacuümmanifolden zijn doorgaans verkrijgbaar in een random-access configuratie uitgerust met 20–24 Luer-plugadapters voor centrifugale kolommen, of in een ontwerp bedoeld voor gebruik met 96-well platen. Vacuümmanifolden die zijn geconfigureerd voor 20–24 monsters versnellen de kolomreinigingsstap tijdens DNA-zuivering vergeleken met centrifugatie, omdat ze het verwijderen van kolommen van de rotor elimineren. Hoewel deze methode handig is, kan kruisbesmetting optreden doordat de kolomafvoertip contact maakt met de Luer-opening van het vacuümmanifold. Als DNA uit een kolom de Luer-opening binnenkomt, kan het tijdens het volgende gebruik van de manifold naar een andere monsterkolom worden overgedragen. Om besmetting te voorkomen raden fabrikanten extra accessoires^{aan 10,13}; deze bemoeilijken echter de montage van de extractieopstelling en worden vaak weggelaten.

Vacuümmanifolden die zijn ontworpen voor het 96-put formaat hebben een andere constructie en zijn niet bedoeld voor microcentrifugekolommen, maar voor compatibele 96-put DNA-extractieplaten, waarin putten een silicamembraan bevatten. In dit geval wordt DNA-extractie uitgevoerd met behulp van voorverpakte 96-well-formaat DNA-isolatiekits¹⁴. Deze kits bieden een hoge doorvoersnelheid, maar hebben beperkte toepasbaarheid, omdat het verwerken van minder dan 96 samples vaak onpraktisch is.

Geautomatiseerde robotwerkstations voor nucleïnezuurextractie zijn ongetwijfeld de meest handige methode voor DNA-zuivering, omdat ze minimale betrokkenheid van de operator vereisen, waardoor onderzoekers tijd besparen en stochastische factoren zoals besmetting worden geminimaliseerd. Helaas hebben de meeste extractiestations geen universaliteit en werken ze uitsluitend met speciale kits. Deze werkstations worden voornamelijk gebruikt in diagnostische laboratoria, maar zijn niet kosteneffectief voor de meeste kleine tot middelgrote academische laboratoria.

Er is dus een lacune in de laboratoriumpraktijk voor medium-throughput DNA-extractiemethoden die in staat zijn om tussen de 12 en 96 monsters in minder dan 1 uur te verwerken. We presenteren een rack met 24 putjes die handmatige isolatie mogelijk maakt van maximaal 48 monsters met afgekapte spinkolommen en tot 116 monsters met niet-afgekapte spinkolommen. Een centrifuge met een schandeldraerplaatrotor en een microcentrifuge met een vaste hoek worden als extra apparatuur gebruikt. De procedure voor plasmide-DNA-zuivering wordt gepresenteerd als voorbeeld van het gebruik van 24-well racks, aangezien plasmide-DNA-isolatie een klaringsstap omvat om gelyseerde celresten te verwijderen, wat het proces moeilijk te automatiseren maakt. Desalniettemin kunnen deze racks worden gebruikt voor vrijwel elke kolomgebaseerde nucleïnezuurextractiemethode.

Protocol

1. Voorbereiding van 3D-geprinte apparatuur

1. Print het rack met een 3D-printer met een filament en een 0,4 mm nozzle. Gebruik generiek PLA-, PETG- of ABS-filament met 100% infill. Stel de laaghoogte in op 0,1 mm en schakel oppervlaktegladmaking in. Pas de printinstellingen aan om waterdichtheid en mechanische stabiliteit te garanderen.
   OPMERKING: STL-bestanden voor rackcomponenten worden verstrekt in Supplemental File 1. Volg de gespecificeerde printparameters voor het Basisreservoir. Test het reservoir vóór gebruik door het te vullen met 70% ethanol en centrifugeren voor langere periodes (1, 2, 5, 10 en 30 minuten) om te bevestigen dat er geen lekkage of structurele schade is.
2. Lijm de componenten van het basisreservoir aan elkaar om een afgesloten eenheid te vormen.

2. Bacteriële kweek en lysis

1. Inoculeer E. coli-transformanten in 3–5 mL LB-medium met geschikte antibiotica. Broed 's nachts (12–16 uur) op 37 °C met schudden.
2. Oogst cellen door centrifugatie bij 2.000 × g gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg.
   OPMERKING: Celpellets kunnen worden opgeslagen bij −20 °C vóór de verwerking.
3. Voeg 250 μL resuspension buffer (Buffer P1 met RNase A) toe aan de pellet. Sussie volledig opnieuw door vortexen of pipetteren.
4. Voeg 250 μL lysisbuffer toe (Buffer P2). Meng door de buis voorzichtig 4–6 keer om te draaien.
   OPMERKING: Vermijd intensief mengen om afscheiding van genomisch DNA te voorkomen.
5. Voeg 350 μL neutralisatiebuffer toe (Buffer N3). Meng direct grondig door inversie.
   OPMERKING: Er moet een witte neerslag ontstaan, wat wijst op succesvolle neutralisatie.

3. Assemblage van de filtratie-eenheid

1. Plaats DNA-bindende kolommen in de kolomhouderlaag van het rek.
2. Plaats kolomdeksels in aangewezen sleuven om ze tijdens centrifugatie vast te zetten.
3. Plaats clarification/filterkolommen in de filterkolomlaag direct boven de bindingskolommen.
   OPMERKING: Als er geen filterkolommen beschikbaar zijn, centrifugeer dan het lysaat in microbuizen en breng het supernatant over naar de bindingskolommen.

4. Lysaatverwijdering en DNA-binding

1. Breng het geneutraliseerde lysaat van stap 2.5 over in de filtratiekolommen.
2. Plaats het gemonteerde rek in een schanderende bakplaatschijf.
   VOORZICHTIG: Zorg voor een goede balans door een contragewichtrek met gelijke massa en identieke configuratie te gebruiken.
3. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.
4. Haal het rooster van de centrifuge.
5. Verwijder en verwijder de filterkolomlaag.

5. Wassen

1. Voer de doorvoer van het reservoir af in een afvalcontainer. Zet het rek weer in elkaar met bindkolommen.
2. Voeg 500–700 μL wash buffer toe aan elke bindingskolom met behulp van een multikanaals pipet.
3. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 1 minuut.
4. Verwijder de doorvoer uit het reservoir.
5. Herhaal de wash door washbuffer aan elke kolom toe te voegen en te centrifugeren op 2.000 × g gedurende 1 minuut.
   OPMERKING: Kolommen kunnen na het wassen op kamertemperatuur of 4 °C worden bewaard.

6. Drogen en eluatie

1. Verwijder de bindingskolommen van het rek en breng ze over in 2 mL verzamelbuisjes.
2. Centrifugeer op >10.000 × g gedurende 1 minuut om het membraan te drogen.
3. Schakel kolommen over om 1,5 mL buizen schoon te maken.
4. Voeg 50 μL elutiebuffer of water direct aan het membraan toe. Incubeer 1 minuut op kamertemperatuur.
5. Centrifugeer op >10.000 × g gedurende 1 minuut om DNA te elueren.

7. Optioneel: Co-precipitatie met titaniumdioxide

1. Meng de lysisbuffer met titaniumdioxidepoeder in een volume-massaverhouding van 2:1.
2. Voeg 250 μL van de titaniumdioxide-suspensie toe aan het lysaat. Mix via inversie.
3. Voeg 350 μL neutralisatiebuffer toe en meng grondig.
4. Centrifugeer op 2.000 × g gedurende 1 minuut.
5. Verzamel het supernatant zonder het neerslag te verstoren.
6. Breng het supernatant over naar de bindingskolom.

Resultaten

Rackvariaties
We hebben vier versies van racks ontwikkeld die geschikt zijn voor een breed scala aan centrifugemodellen, waardoor we de beschikbare middelen in verschillende laboratoriumomgevingen kunnen gebruiken en rekening houden met de voorkeuren van de gebruiker. Alle rekken hebben een 24-wellenformaat, maar bevatten afhankelijk van de versie extra zitplaatsen voor kolommen. Gedetailleerde afmetingen en compatibiliteit worden verstrekt in Supplemental File 2. Een afbeelding met hoge resolutie van het gemonteerde rack is te vinden in Aanvullende Figuur S1.

De basisversie met racks (Figuur 1) is de meest productieve configuratie. Het bestaat uit vier delen en heeft afmetingen van 88 × 130 × 77 mm. Het maakt het gelijktijdig gebruik van maximaal 48 kolommen mogelijk bij kolommen met hoofdletters of tot 116 kolommen bij kolommen zonder kapjes. De rackcomponenten zijn ontworpen voor gebruiksgemak en om ongewenste effecten tijdens centrifugatie te minimaliseren. Spinkolommen worden in de kolomlaag geplaatst, die groeven heeft om doppen in te brengen; Dezezelfde groeven kunnen ook kolommen zonder kappen opvangen. De kolomlaag rust op het reservoir. De drainageopening van de kolommen bevindt zich boven de uitsparing van het reservoir, wat helpt om spetteren tussen aangrenzende kolommen te verminderen. Vloeistof loopt via een opening onderaan de uitsparing naar het reservoir. De reservoircapaciteit is ongeveer 100 mL, met plaats voor twee wastrappen met een hoge kolombelasting. De filterkolomlaag kan indien nodig boven de kolomlaag worden geplaatst, waarbij de filterkolommen erboven en in contact met de bindingskolommen worden geplaatst. De kap sluit de laag af waarin het filter of de bindingskolommen zich bevinden, waardoor de luchtstroom tijdens de centrifugerotatie wordt beperkt. De basisversie met tandheuwel is compatibel met A-2-DWP bakrotors (bijv. Eppendorf 5804), rotor 1770 (bijv. HETTICH Rotina 380) of gelijkwaardige systemen.

De mini-rackversie (Figuur 2) is geschikt voor een breed scala aan centrifugebakrotors. Het bestaat uit drie delen en heeft minimale afmetingen van 82,5 × 128 × 58 mm (met de filterkolomlaag). Het maakt het gebruik mogelijk van maximaal 48 kolommen met kappen of tot 90 kolommen zonder kapjes. De geometrie van deze versie lijkt op die van het basisrack, maar de buitenste rijen kolomposities zijn verwijderd en vervangen door groeven voor kolomkappen. De reservoircapaciteit varieert afhankelijk van de gedrukte versie. Het kleinste reservoir (20 mL) biedt plaats aan één wasstap voor ongeveer 30 kolommen; grotere reservoirs zorgen voor een hogere doorvoersnelheid. De filterkolomlaag heeft afgeronde randen om beweging van de rotorbak in kleinere centrifuges mogelijk te maken. De mini-rackversie is compatibel met UC-124 bucketrotors (bijv. Accumax iFuge UC02) of vergelijkbare systemen. Wanneer het wordt gebruikt zonder de filterkolomlaag, is het rek compatibel met A-2-MTP emmerrotors (bijv. Eppendorf 5430) of hun equivalenten.

De reservoirloze (onbedekte) versie (Figuur 3) is geschikt voor gebruikers met beperkte ervaring met 3D-printen, omdat het reservoir wordt vervangen door een externe container zoals een pipettipdoos. Deze versie bestaat uit drie delen en meet 79 × 115 × 61,5 mm. Het maakt het gebruik mogelijk van maximaal 48 kolommen met kappen of tot 78 kolommen zonder kappen. De geometrie lijkt op die van de vorige versies, maar mist een geïntegreerd reservoir. In plaats daarvan wordt een geschikte container gebruikt voor afvalinzameling. De kolom- en filterlagen hebben minder zitplaatsen, en de filterlaag bevat kegelvormige stoelen om interferentie met de rotorbeweging te voorkomen. De basis is ontworpen om in standaardcontainers te passen en kan worden gestabiliseerd met zijafstandhouders. De compatibiliteit hangt af van de gekozen container, maar omvat A-2-DWP emmerrotors (bijv. Eppendorf 5804), rotor 1770 (bijv. HETTICH Rotina 380) en UC-124 bakrotors (bijv. Accumax iFuge UC02).

De cap rack-versie (Figuur 4) is de eenvoudigste configuratie en wordt gebruikt samen met 5 mL of 10 mL 24-well diepe putplaten. Het bestaat uit één component met afmetingen van 73 × 10⁻ × 4 mm en maakt het gebruik van maximaal 48 kolommen mogelijk. Deze versie is compatibel met elke centrifugerotor die het bijbehorende plaatformaat ondersteunt.

Opbrengst en zuiverheid
DNA-extractie werd uitgevoerd op E. coli-culturen met zowel het standaard handmatige microcentrifugeprotocol als de rack-gebaseerde methode. Spectrofotometrische analyse toonde aan dat de kwaliteit van het DNA dat met de racks werd geëxtraheerd vergelijkbaar was met die verkregen met de standaardmethode. Typische A260/A280-verhoudingen varieerden tussen 1,8 en 1,9 voor beide benaderingen. De totale plasmidopbrengst (μg) toonde geen significant verschil tussen de conventionele methode en extractie met behulp van de rackconfiguraties (Figuur 5); ruwe gegevens worden verstrekt in Supplemental File 2. Plasmideconformatie bleef ook behouden, met vergelijkbare verdelingen van ontspannen, lineaire en supercoiled vormen (Figuur 6).

Kruisbesmettingsanalyse
Om mogelijke kruisbesmetting te beoordelen, werd een dambordexperiment uitgevoerd. De kolommen werden afwisselend geladen met een hooggeconcentratie ethidiumbromide-oplossing (die hoog-titer DNA simuleert) en water. Na centrifugatie bij 2.000 × g werd de kleurstofdistributie beperkt tot het afvalgebied direct onder de belaste kolommen, en werd er geen zichtbaar signaal gedetecteerd in aangrenzende putten of op aangrenzende kolomtoppen (Figuur 7). Deze observaties geven aan dat het rackontwerp de kans op spetteren en kruiskolomoverdracht onder de geteste omstandigheden vermindert.

Om de besmetting verder te evalueren, werd realtime PCR uitgevoerd met een amplicon als besmettingsmiddel (zie Supplemental File 2). Versterking werd alleen gedetecteerd in eluaten van kolommen waaraan de amplicon was toegevoegd (Figuur 8). Onder de geteste omstandigheden werd geen kruisbesmetting vastgesteld; De prestaties kunnen echter variëren afhankelijk van workflow en type sample.

Figuur 1: Basisversie van het rackassemblageschema. Exploded CAD-weergave toont de (A) Cap, (B) Filter Column Layer, (C) Column Holder Layer en (D) Base Reservoir. Het rek bestaat uit vier delen met afmetingen van 88 × 130 × 77 mm en maakt gelijktijdig gebruik van maximaal 48 kolommen met condensatoren of maximaal 116 kolommen zonder kapjes mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Mini-versie van het rackassemblageschema. Exploded CAD-weergave toont de (A) Filterkolomlaag, (B) Kolomhouderlaag en (C) Basisreservoir. Deze versie lijkt geometrisch op de basisversie, maar de twee zijrijen kolomzittingen zijn verwijderd en vervangen door groeven voor kolomkappen. Het bestaat uit drie delen, heeft minimale afmetingen van 82,5 × 128 × 58 mm (met de filterkolomlaag), en maakt het gebruik van maximaal 48 kolommen met caps of maximaal 90 kolommen zonder caps mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Reservoirloze (onbedekte) versie van het rackassemblageschema. Exploded CAD-weergave toont de (A) Filter Column Layer, (B) Column Holder Layer, (C) Base en (D) pipettip box. Deze versie vervangt het geïntegreerde reservoir door een externe container zoals een pipettipdoos. Het bestaat uit drie delen, heeft afmetingen van 79 × 115 × 61,5 mm, en maakt het gebruik van maximaal 48 kolommen met doppen of tot 78 kolommen zonder doppen mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Cap-versie van 24-well racks. Bovenaanzicht (links) en onderaanzicht (rechts). Dit is de eenvoudigste rackversie, gebruikt samen met 5 mL of 10 mL diepe putplaten met 24 putten. Het bestaat uit één onderdeel met afmetingen van 73 × 109 × 4 mm en maakt het gebruik van maximaal 48 kolommen met of zonder kapjes mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Vergelijking van DNA-opbrengst en zuiverheid. Spectrofotometrische analyse van plasmideopbrengst (μg/mL). Er werd geen statistisch significant verschil in totale plasmideopbrengst waargenomen tussen de conventionele methode en extractie met behulp van de rackconfiguraties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Vergelijking van DNA-kwaliteit. DNA-vormen werden gevisualiseerd door agarosegelelektroforese. De relaxte, lineaire en supercoiled vormen van DNA zijn vergelijkbaar tussen standaard handmatige extractie en rack-gebaseerde extractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Kruisbesmettingsbeoordeling. Uitzicht op het afvalreservoir na centrifugatie, met afzonderlijke afvalbassins zonder overlapping. De kolommen werden geladen met een hooggeconsentreerde ethidiumbromide-oplossing (die hoog-titer DNA simuleert) en water. Er werd geen kleurstof waargenomen in aangrenzende "water"-putten of op de uiteinden van naburige kolommen na centrifugatie, wat wijst op verminderde spettering en kruiskolomoverdracht onder de geteste omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Analyse van kruisbesmetting met behulp van kwantitatieve PCR. Versterkingscurves voor monsters met het verontreinigende middel worden rood weergegeven, terwijl monsters die alleen water bevatten groen zijn. Versterking werd alleen vastgesteld in monsters die het besmettende middel bevatten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Supplemental File 1: 3D-modelbestanden voor rackontwerpen. Deze bestandsset bevat STL-bestanden voor alle rackconfiguraties, inclusief de basisrackversie, mini-rackversie (met varianten van meerdere reservoirhoogtes), reservoirloze versie en caprack-versie. Individuele componenten (bijv. basisreservoir, kolomhouderlaag, filterkolomlaag en kap) worden voorzien voor 3D-printen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Bestand 2: Ondersteunende gegevens en methoden. Deze bestandsset bevat de centrifugecompatibiliteitstabel, gedetailleerde kruisbesmettingstestprocedure, ruwe DNA-opbrengstdatasets en PCR-instrumentuitvoerbestanden die bij de contaminatieanalyse horen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Basisversie van het rek (volledig gemonteerd). Afbeelding met hoge resolutie van de volledig gemonteerde basisrackconfiguratie, die de algehele structuur en componentindeling illustreert. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit protocol pakt de "doorvoerkloof in" in veel moleculaire biologielaboratoria. Hoewel 96-put filterplaten sneller zijn, kunnen ze lagere bindingscapaciteiten of verminderde eindconcentraties vertonen in vergelijking met individuele spinkolommen¹⁴. Door standaard spinkolommen aan te passen aan een plaat-rotor formaat, combineert deze methode de hoge opbrengst van kolommen met de snelheid van plaatgebaseerde workflows.

De racks zijn het meest voordelig bij het verwerken van meer dan 12 monsters. De belangrijkste innovatie van het protocol is het gebruik van 24-put racks, die de kolomgebaseerde nucleïnezuurextractie vereenvoudigen en versnellen door een gedeeld reservoir te gebruiken voor het afvoeren van supernatant en wasoplossingen. Bij gebruik van de racks is de tijd die nodig is om deze stappen uit te voeren voor 14–116 samples vergelijkbaar met die van 2–12 samples. Bovendien wordt de inspanning van de operator verminderd, omdat herhalende stappen zoals het verwijderen van individuele buizen, het overplaatsen van kolommen, het weggooien van wash-oplossingen en het openen van doppen worden geminimaliseerd. Omdat de oorspronkelijke kitcomponenten (oplossingen en spinkolommen) ongewijzigd blijven, wordt vergelijkbare DNA-kwaliteit verwacht en wordt deze ondersteund door de gepresenteerde resultaten.

3D-printen van de 24-wells rekken is mogelijk met standaardapparatuur, maar kan ervaring vereisen voor de basis- en miniversies. De versies zonder reservoir en met doppenrek zijn eenvoudiger en kunnen met minimale drukervaring worden geproduceerd. Een belangrijke overweging bij het modelleren van fused deposition is de vorming van micro-gaps tussen lagen, wat de waterdichtheid onder centrifugatie kan verminderen. Tests gaven aan dat 100% invulling, een reservoirwanddikte van 7 mm en een laaghoogte van 0,1 mm voldoende waterdichtheid bieden. Het verwarmen van het printbed en het aanbrengen van oppervlaktegladmaking verbeterde de afdichtingsprestaties verder. Daarentegen waren na-print afdichtmethoden met epoxyharsen of organische oplosmiddelen niet effectief, omdat vervorming tijdens centrifugatie leidde tot scheuren en lekkages. Onvoldoende wanddikte kan ook leiden tot structurele falen en verlies van waterdichtheid, wat mogelijk leidt tot een centrifuge-onevenwicht. Daarom wordt pre-use testen van geprinte componenten aanbevolen.

De vier rackversies zijn geschikt voor een breed scala aan centrifuges met bakrotoren, waardoor gebruikers de configuratie kunnen kiezen die het beste past bij hun apparatuur en doorvoereisen. De basisversie in het rack biedt de hoogste doorvoersnelheid, maar vereist grotere centrifuges en een hogere printkwaliteit. De mini-versie vermindert de behoefte aan centrifugegrootte, maar verlaagt ook de doorvoersnelheid. De versie zonder reservoir vereenvoudigt de fabricage en is compatibel met veelgebruikte containers zoals pipettipboxen, hoewel de compatibiliteit afhangt van de geometrie van de container. De cap-rack versie is de eenvoudigste configuratie, maar kan niet worden gebruikt met filterkolommen.

Filterkolommen die geen nucleïnezuren binden, zijn mogelijk minder gemakkelijk beschikbaar dan standaard bindingskolommen⁹. Bij afwezigheid daarvan kunnen extra verduidelijkingsstappen nodig zijn, waardoor de totale verwerkingstijd wordt verlengd. Alternatief kunnen filterpipettips (1000 μL) of het titaniumdioxide-protocol worden gebruikt.

De extractierekken functioneren als een mechanisch supplement tot standaard DNA-extractieworkflows⁹ en veranderen de buffersamenstelling of kolomchemie niet (behalve bij de titaniumdioxidevariant). Dienovereenkomstig wordt geen substantiële impact op de DNA-kwaliteit verwacht, wat consistent is met agarosegelelektroforese en vergelijkingen oplevert vergelijkbare plasmidvormen en -hoeveelheden ten opzichte van de standaardmethode.

Hoewel het gebruik van een gedeeld afvalreservoir een potentieel risico op kruisbesmetting met zich meebrengt, werd dit onder de geteste omstandigheden niet waargenomen. Een belangrijk ontwerpkenmerk is de "schoorsteen"-geometrie van de kolomuitlaten, die de scheiding tussen kolomuiteinden en het oppervlak van de afvalvloeistof behoudt. Om deze scheiding te behouden, mag het reservoir niet overgevuld worden en wordt het leegmaken na elke volledige debiet aanbevolen.

Een beperking van de methode is de maximale snelheid van scharenbakrotors (meestal 2.000 × g). Hoewel voldoende voor bind- en wasstappen, is deze snelheid niet voldoende voor volledige membraandrooging. Daarom is een laatste hogesnelheidscentrifugatiestap in een microcentrifuge met vaste hoek vereist. Ondanks deze extra stap blijven de totale tijdsbesparingen aanzienlijk voor batches van meer dan 24 monsters.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3D Printer Filament	NIT, Rusland	-	PETG of PLA aanbevolen
Buffer N3	Qiagen, Nederland	19064
Buffer P1	Qiagen, Nederland	19051
Buffer P2	Qiagen, Nederland	19052
Creality Ender-3 S1 Pro	Creality, China
Elution Buffer	Qiagen, Nederland	19086
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf, Duitsland	22626001	Vaste hoekrotor
Eppendorf Centrifuge 5804 R	Eppendorf, Duitsland	22625080	Zwengrotor met emmerplaten
Ethidium Bromide	Biolabmix, Rusland	EtBr-10
Frit of 1000 μL Filter Pipette Tip	GenFollower, China	E-FTB1000	Onderdeel van Filter Columns
Miniprep Without Filter Barrier Spin Column	JVLAB, China	-	Onderdeel van Filter Columns
Phenol Red	Lenreactiv, Rusland	200125
PrusaSlicer	Prusa Research, Tsjechische Republiek
QIAprep 2.0 Spin Miniprep Columns	Qiagen, Nederland	27115
RNase A	Qiagen, Nederland	19101
Wash Buffer	Qiagen, Nederland	19065