Een digitaal microfluïdisch elektroporatieplatform voor low-input CRISPR-genoombewerking en mRNA-transfectie in suspensie-T-cellen en 3D-celmodellen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft miniaturiseerde CRISPR–Cas9 genoombewerking van de TCRα/β receptor in primaire menselijke T-cellen met behulp van 'DMF-ection', een digitaal microfluïdisch (DMF) elektroporatieplatform. De methode maakt parallelle, laag-input genbewerking met hoge levensvatbaarheid mogelijk en is verder aanpasbaar voor mRNA-levering in meercellige 3D-sferoïden.

Samenvatting

Digitale microfluidische (DMF) elektroporatie maakt precieze, laag-volume genetische manipulatie van zoogdiercellen mogelijk, terwijl cellulaire input tot 100x wordt geminimaliseerd en de levensvatbaarheid behouden blijft. Deze studie presenteert een high-throughput DMF-gebaseerde transfectieworkflow voor CRISPR-gemedieerde knockout van de TRAC-locus in primaire menselijke suspensie-T-cellen en voor mRNA-transfectie van driedimensionale HEK293T sferoïden. Met ruimtelijk afgezet CRISPR-gids-RNA's en on-cartridge ribonucleoproteïne (RNP) assemblage werd efficiënte TRAC-locusverstoring bereikt in zowel CD4⁺- als CD8⁺ T-celpopulaties met slechts 10.000 cellen per conditie, met post-editing levensvatbaarheid van meer dan 85%. Biofysische karakterisering met behulp van flow-geïnduceerde en Taylor-dispersieanalyses toonde aan dat polymeeradditieven Cas9–sgRNA-complexen stabiliseren onder elektroporatiebuffercondities, wat reproduceerbare bewerking ondersteunt bij submicrolitervolumes. De workflow werd verder aangepast voor 3D-toepassingen door EGFP mRNA in intacte HEK293T sferoïden te brengen, wat resulteerde in robuuste en ruimtelijk uniforme fluorescentie zonder de groei of morfologie van de sferoiden te belemmeren. Samen tonen deze resultaten aan dat DMF-elektroporatie efficiënte genoombewerking en mRNA-levering mogelijk maakt over zowel suspensie-immuuncellen als meercellige sferoïden. Dit platform biedt een schaalbare en laag-input oplossing voor toepassingen in CAR-T celtherapie, functionele genomica en geavanceerde 3D-cellulaire modellen.

Inleiding

Genbewerking in primaire menselijke cellen wordt steeds belangrijker voor zowel therapeutische ontwikkeling als fundamenteel onderzoek, inclusief toepassingen in immuno-engineering, modellering van zeldzame ziekten en functionele genomica¹. Hoewel elektroporatie zeer efficiënte genoombewerking mogelijk maakt, vereisen conventionele cuvet-gebaseerde systemen doorgaans tot miljoenen cellen per conditie, waardoor hun gebruik voor door patiënten afgeleide monsters en zeldzame immuunpopulaties beperkt^{wordt 2}. Bovendien zijn deze systemen slecht geschikt voor grootschalige screening vanwege beperkingen in doorvoer, automatisering en reagensverbruik³.

Microfluidische elektroporatie is naar voren gekomen als een veelbelovende benadering voor low-input genoombewerking⁴. De meeste bestaande platforms vertrouwen echter op continue stromingsarchitecturen die complexe vloeistofhantering, beperkte flexibiliteit bij het mengen van reagentia en relatief hoge celvereisten per conditie vereisen. Daarentegen maakt digitale microfluidica (DMF) actieve manipulatie mogelijk van discrete druppels op nanoliterschaal op een vlakke elektrodearray, wat precieze controle mogelijk maakt over de samenstelling, timing en ruimtelijke lokalisatie van reacties. Dit plug-and-play druppelgebaseerde formaat is zeer geschikt voor laagvolume, hoogdoorvoerwerk, waarbij behoud van primaire cellen en reagentia essentieel is⁵.

Recent werk heeft de haalbaarheid aangetoond van DMF-gebaseerde intracellulaire levering met tri-druppel elektroporatie-architecturen die gelokaliseerde, laagstroom-elektrische velden genereren voor efficiënte RNP- en mRNA-levering, terwijl thermische en elektrochemische stress ^6,7,8 worden geminimaliseerd. Voortbouwend op deze basis werd een volgende generatie DMF-elektroporatieplatform ontwikkeld, genaamd 'DMF-ection', met 48 onafhankelijk adresseerbare reactieplaatsen, volledige automatiseringscompatibiliteit en schaalbare cartridgeproductie⁹ (Figuur 1). De DMF-cartridge bestaat uit een onderste PCB-plaat en een plastic bovenplaat, gescheiden door een pakking, die via uitlijnsnaps in één correcte oriëntatie worden gemonteerd (Figuur 1A). De 48-plex indeling is georganiseerd in acht identieke families (Figuur 1A–H), elk met zes onafhankelijk adresseerbare elektroporatieplaatsen, die tot 48 parallelle bewerkingscondities per cartridge ondersteunen (Figuur 1B). Gids-RNA-bibliotheken worden op het substraatoppervlak aangebracht met behulp van een akoestische dispenser voorafgaand aan de montage van de cartridge. De positionele nauwkeurigheid van depositie werd bevestigd op alle 48 locaties, waarbij dropposities binnen submillimeterafwijking van het elektrodemiddenpunt clusterden (Figuur 1C), wat een betrouwbare RNP-assemblage op de cartridge ondersteunt. Na het laden worden cellen en vloeibare elektrodedruppels op de cartridge geactiveerd om de tri-druppel elektroporatiegeometrie te vormen (Figuur 1D). Na elektroporatie worden cellen afgeladen in kweekplaten voor herstel en downstream analyse, inclusief flowcytometrie, sequencing en microscopie (Figuur 1E). Dit systeem maakt hoogefficiënte genoombewerking mogelijk met tot 100 keer minder cellen dan standaard cuvette-gebaseerde methoden, waardoor de toegang tot genoomengineering in toepassingen met lage input en hoge doorvoer aanzienlijk wordt uitgebreid.

Deze studie beoordeelt de prestaties van het platform door meerdere biomoleculaire ladingen af te leveren, waaronder mRNA en CRISPR–Cas9 ribonucleoproteïne (RNP) complexen, wat efficiënte transfectie en genverstoring bereikt. Naast primaire T-cellen biedt DMF-ection een generaliseerbaar kader voor het afleveren van nucleïnezuren in complexe meercellige structuren. Driedimensionale (3D) sferoïden en organoïde-type modellen vormen aanzienlijke barrières voor de penetratie van reagens vanwege hun architectuur en kwetsbaarheid, en conventionele elektroporatiemethoden verstoren vaak de morfologie of zorgen voor heterogene levering. Om te beoordelen of dezelfde miniaturiseerde elektroporatieprincipes die voor T-celbewerking worden gebruikt, ook gelden voor gestructureerde weefsels, werd de DMF-workflow toegepast op 3D-HEK293T sferoïden. Deze experimenten toonden aan dat DMF-gebaseerde elektrowetting intacte sferoïden voorzichtig binnen tri-druppelgeometrieën kan positioneren en een uniforme mRNA-afgifte ondersteunt, terwijl structuur en groei behouden blijven. Hoewel deze resultaten buiten het hier beschreven primaire T-celprotocol vallen, illustreren ze de bredere toepasbaarheid van programmeerbare DMF-elektroporatie voor opkomende 3D-cellulaire systemen die relevant zijn voor geneesmiddelenontdekking en ziektemodellering.

Protocol

De primaire menselijke T-cellen die in dit protocol worden gebruikt, zijn verkregen van commerciële leveranciers met geïnformeerde donortoestemming en in overeenstemming met toepasselijke institutionele, ethische en regelgevende richtlijnen. Alle omgang met biologisch materiaal van mensgemaakte basis vond plaats volgens institutionele bioveiligheidsprotocollen. Onderzoekers die dit protocol implementeren, zijn verantwoordelijk voor het waarborgen dat hun gebruik van primaire menselijke cellen voldoet aan de eisen van de lokale institutionele beoordelingscommissie (IRB) of ethische commissie, de toepasselijke bioveiligheidsvoorschriften en eventuele relevante nationale of regionale wetgeving die het gebruik van menselijk biologisch materiaal regelt. Er was geen patiënt-identificeerbare informatie gekoppeld aan het celmateriaal dat in deze studie werd gebruikt.

1. Voorbereiding en activatie van primaire menselijke T-cellen

1. Ontdooi snel primaire menselijke CD3⁺ T-cellen in een waterbad van 37 °C. De cellen worden overgebracht naar voorverwarmde basale T-cel en centrifugeren op 180 × g gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en suspendeer de pellet opnieuw in een nieuw medium.
2. Bepaal de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller.
3. Susselt cellen bij 1 × 10^{6 cellen} /mL in een T-cel kweekmedium, aangevuld met een oplosbaar tetramere antilichaam CD3/CD28 T-cel activatorstimulus (volgens de instructies van de leverancier) en 200 IU/mL IL-2. Incubeer cellen 72 uur bij 37 °C, 5% CO₂.
   OPMERKING: Houd de celdichtheid tussen 0,5–2 × 10^{6 cellen} /mL tijdens activatie. Voer activatie uit in U-bodemplaten met 96 putten om het contact van cel tot activator en activatie-efficiëntie te optimaliseren.

2. Voorbereiding van geleidings-RNA-vlekken op het DMF-substraat (akoestische dispenserspotting)

1. Reconstrueren van gelyofilieerd sgRNA in nucleasevrij water tot een lagerconcentratie van 100 μM. In een aparte buis bereid je een voorraad van 100 mg/mL poly-L-glutaminezuur (PGA, natriumzout, MW 15.000–50.000 Da) in nucleasevrij water. Combineer sgRNA- en PGA-voorraad met een volumeverhouding van 5:4 (sgRNA: PGA), wat resulteert in een uiteindelijke sgRNA-concentratie van 55,6 pmol/μL en een uiteindelijke PGA-concentratie van 44,4 mg/mL in nucleasevrij water. Vortex kort en centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 30 seconden, aliquot in wegwerpvolumes en slaat ongebruikte aliquots op bij −80 °C tot 6 maanden.
   OPMERKING: Vermijd herhaalde vries-dooicycli.
2. Voeg het geleider-PGA-mengsel toe aan een akoestische bron met laag dode volume in putten die overeenkomen met de gewenste indeling van de reactieplaats.
3. Breng 40 nL (gelijk aan 2,2 pmol sgRNA) van het guide-PGA-mengsel over naar elk doelgebied van het DMF-substraat met behulp van een gekalibreerde akoestische dispenser.
   OPMERKING: Bij 55,6 pmol/μL levert 40 nL 2,2 pmol sgRNA per site (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Gedroogde geleiders worden opnieuw samengesteld tijdens het samenvoegen van druppels op de cartridge; volledige herophanging wordt bevestigd door consistente bewerkingsefficiëntie over verschillende sites.
4. In een biologische veiligheidskast laat je de gevlekte druppels volledig aan de lucht drogen op kamertemperatuur totdat er geen zichtbare vloeistof meer over is (ongeveer 5 minuten).
   OPMERKING: Gebruik geen geforceerde luchtstroom of warmte, omdat dit het geleide-RNA kan losmaken of degraderen.
5. Zet de DMF-cartridge in elkaar.
   1. In een biologische veiligheidskast richt je de bovenste plaat uit op het gevlekte substraat door de asymmetrische plastic snap-elementen van de bovenplaat te laten afstemmen met de inkepingen op de onderplaat. Oefen gelijkmatige, gelijktijdige druk uit langs de korte randen totdat een duidelijk mechanisch klikje wordt gevoeld, waarmee de vergrendelingsfuncties volledig worden vastgegrepen.
      OPMERKING: De cartridge is ontworpen met één correcte oriëntatie; Verkeerde montage veroorzaakt de snap niet. Houd substraten altijd bij de randen om besmetting of schade aan functionele oppervlakken te voorkomen en om te voorkomen dat de substraten tegen elkaar schuiven, omdat dit de oppervlaktecoatings kan bekrassen.
   2. Checkpoint: Bevestig de juiste montage met de mechanische drukknop.
      OPMERKING: Er is geen prerun elektrische indicator van coatingintegriteit; eventuele functionele storingen als gevolg van onjuiste assemblage worden automatisch gedetecteerd en gerapporteerd in het QC-rapport na uitvoering.
      Pauzepunt: Bewaar ongebruikte gemonteerde patronen in een verzegelde verpakking met droogmiddel (silicagelzakjes) tot 48 uur op kamertemperatuur.

3. Celvoorbereiding

1. Bereid voor elk gebruik 1 mL Complete Transfection Buffer voor door de DMF-compatibele elektroporatiebuffer te combineren met de meegeleverde biocompatibele niet-ionische tenside in een verhouding van 20:1 (v/v) (elektroporatiebuffer: tenside), wat resulteert in een uiteindelijke oppervlakteactieve concentratie van 0,05% (v/v). Meng voorzichtig en laat het op ijs staan.
   OPMERKING: De DMF-compatibele transfectiebuffer die hier wordt gebruikt, is een isotonische buffer met lage geleidbaarheid (geleidbaarheid: 3,5 mS/cm, osmolaliteit: 305 mOsm/L). Onderzoekers die alternatieve buffers gebruiken, moeten compatibiliteit met DMF-actuatie en cellevensvatbaarheid verifiëren. Het biocompatibele niet-ionische oppervlakteactieve stof dient om het vastzetten van druppels te verminderen; als het aangeleverde oppervlakteactieve middel niet wordt gebruikt, een geschikt alternatief.
2. Was geactiveerde T-cellen één keer met Transfection Buffer (zonder tensideer). Centrifugeer op 180 × g gedurende 5 minuten, aspireer het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in een Complete Transfection Buffer (met tensideer) bij 1,0 × 10⁷ cellen/mL in een totaal volume van 100 μL per cartridge. Blijf op ijs.
3. Onmiddellijk voordat je het op de cartridge laadt, voeg je Cas9-nuclease direct toe aan de 100 μL T-cel suspension en meng door zacht pipetteren; blijf op ijs.
   OPMERKING: Voor primaire T-cellen wordt Cas9 geladen met 42 pmol per 100 μL patroonvolume (0,42 pmol/μL). Elke elektroporatieplaats verwerkt ongeveer 1 μL celsuspensie, waarbij 0,42 pmol Cas9 per bewerking wordt geleverd. Optimaliseer deze dosering bij het aanpassen aan andere immuunceltypen (zie Tabel 1).

Component	Eindconcentratie per bewerking
Cas9	0,42 pmol in ~1 μL druppel
sgRNA	2,1 pmol (van 40 nL spot)
PGA	44,4 mg/mL voorraad in spottingmengsel
Oppervlakteactieve stof	0,05% (v/v)
Celinvoer	~10.000 cellen

Tabel 1: Samenvattende tabel van de eindconcentraties in elke transfectiedruppel.

4. Transfectie op het DMF-ectionplatform

1. Met een multikanaals pipet doseert u 10 μL van het T-cel/Cas9-mengsel in elk van de 8 cellaadpoorten, en 10 μL volledige transfectionbuffer in de 16 vloeibare elektrode-laadpoorten (zoals weergegeven in Figuur 1).
2. Stel de spanning in op 500 V, de pulsduur op 3 ms en het aantal pulsen op 2. Start de elektroporatiesequentie volgens de platforminstructies.
   1. Checkpoint: Bekijk direct na de run het QC-rapport na de run. Sporadische falen (<10% van de locaties) vereisen geen interventie. Als de storingen systematisch zijn, vervang dan de cartridge door de meegeleverde kwaliteitscontrolekaart, voer de Systeemgezondheidscontrole uit (~2 min) en neem contact op met technische ondersteuning als de problemen aanhouden.

5. Ontlading en herstel van bewerkte T-cellen

1. Met behulp van een vloeistofbehandelaar wordt elektroporatieve cellen van elke reactieplaats overgebracht naar een 96-put U-bodemplaat met 150 μL voorverwarmd basaal T-celmedium, aangevuld met 200 IU/mL IL-2.
2. Incubeer cellen 72 uur bij 37 °C, 5% CO₂ om eiwitomzet en veranderingen in de expressie van oppervlaktereceptoren mogelijk te maken.

6. Flowcytometrie-analyse van TRAC knockout

1. Cellen overbrengen naar een steriele 96-put conische bodemplaat om celverlies tussen washes te verminderen. Was cellen twee keer met Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) door te centrifugeren op 400 × g gedurende 5 minuten en het supernatant te verwijderen door de conische bodemplaat voorzichtig om te draaien. Cellen blijven pelleted in de plaat.
2. Bereid een oppervlaktekleurings-mastermix voor met anti-CD4, anti-CD8 en anti-TCRα/β antilichamen in een flow cytometry buffer bij door de fabrikant aanbevolen concentraties. Voeg per put 25 μL van de mastermix toe en incubeer 20 minuten bij 4 °C, beschermd tegen licht. Was twee keer met 1× PBS (zonder FBS) door 5 minuten te centrifugeren op 400 × g . Sussief cellen opnieuw in 100 μL van 1× PBS met een levensvatbaarheidskleurstof op 1:1.000 (v/v) en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur die beschermd is tegen licht.
   OPMERKING: Conische bodemplaten zijn effectief bij pelleting cellen; Controleer of cellen in alle stappen goed zijn geresuspendeerd.
3. Was cellen twee keer met een Flow Cytometry Buffer en susseer opnieuw in 150–200 μL per monster voor opname.
4. Configureer de cytometer met geschikte laserlijnen en filtersets voor de gebruikte fluorochromen (bijv. 488 nm excitatie voor levensvatbaarheidskleurstof; 405 nm of 488 nm voor oppervlaktemarkers indien van toepassing). Stel de spanningen in met single-stain-compensatieregelaars en een ongekleurd monster. Verzamel minimaal 5.000 live singlet-evenementen per monster. Gate sequentieel op: scatter singlets → levende cellen (levensvatbaarheidskleurstof negatief) → CD4⁺ of CD8⁺ → TCRα/β expressie.
   OPMERKING: Onder standaardomstandigheden kunnen het totaal aantal live gebeurtenissen variëren van 5.000 tot meer dan 10.000 per monster na verlies tijdens het wassen en kleuren, mits de cellen de tijd hebben gehad om te vermenigvuldigen.
5. Bepaal TRAC-genverstoring door de frequentie van TCRα/β-negatieve cellen binnen de CD4⁺- en CD8⁺-populaties te meten. Rapporteer knockout-efficiëntie als het percentage TCRα/β-negatieve cellen ten opzichte van de live singlet-poort voor elke subset.

Resultaten

Verwachte uitkomsten
Elektroporatie van 10.000 geactiveerde T-cellen per aandoening resulteert doorgaans in >85% TRAC knockout-efficiëntie met >95% levensvatbaarheid 72 uur na transfectie. Flowcytometrie toont een duidelijk verlies van TCRα/β-kleuring in de TRAC-targetingconditie ten opzichte van niet-doelgerichte sgRNA-controles (NTC) en controles die niet aan elektrische velden zijn blootgesteld. Tenzij anders vermeld, staat n voor onafhankelijke DMF-ection-runs die op afzonderlijke dagen worden uitgevoerd. Technische replicaties van dezelfde cartridgerun werden gemiddeld vóór statistische analyse en dragen niet onafhankelijk bij aan n. Alle hier gerapporteerde T-celexperimenten zijn uitgevoerd met cryopreserveerde cellen afkomstig van één gezonde donor. Donor-tot-donor variabiliteit met hetzelfde platform wordt verder gekarakteriseerd⁹.

Verbeterde stabiliteit van Cas9–sgRNA-ribonucleoproteïne onder elektroporatiecondities door anionische polymeeradditieven
Een kernontwerpvereiste van digitale microfluidica is een sterk hydrofobe oppervlakte, waardoor druppels tijdens elektrowetting vrij kunnen glijden. Hoewel deze eigenschap essentieel is voor druppelbeweging en precieze actualisering, brengt het uitdagingen met zich mee voor de lading van reagentia. Voor arrayed screening-toepassingen is het cruciaal dat door gebruikers gedefinieerde payloadbibliotheken direct op het cartridgeoppervlak kunnen worden gedeponeerd. Dit maakt het mogelijk dat reagentenindelingen het bibliotheekontwerp van de gebruiker weerspiegelen en ervoor zorgt dat de digitale microfludiaanse workflow naadloos arrayed experimenten kan uitvoeren zonder extra overdracht of handmatige tussenkomst. Nano-dispenser met een akoestische dispenser is hiervoor zeer geschikt, omdat het nanolitervolumes met hoge positionele nauwkeurigheid over grote arrays op verschillende oppervlakken kan leveren. Wanneer druppels echter een hydrofobe patroon raken, stuiteren, parelen ze of verspreiden ze zich niet gelijkmatig, wat leidt tot inconsistente afzetting en terugwinning. Deze variabiliteit is het duidelijkst bij intermediaire druppelvolumes variërend van 40 nL tot 120 nL (Figuur 2A, n = 3 per conditie, *** p-waarde < 0,01), waarbij wordt verondersteld dat de kinetische energie van de druppel hoog genoeg is om een terugslag te veroorzaken, maar de oppervlakteadhesie onvoldoende is om de vloeistof te verankeren. Daardoor kan directe depositie op de cartridge bij hogere payload-doseringen onbetrouwbaar zijn zonder verdere aanpassingen. Om dit effect te beperken, werden reagentia aangevuld met het bioveilige polymeer poly-L-glutaminezuur (PGA). PGA is een biologisch afbreekbare, negatief geladen polypeptide die veel wordt gebruikt als stabilisator in farmaceutische formuleringen, met uitstekende compatibiliteit voor levende-cel workflows. Er wordt verondersteld dat de geladen ruggengraat de druppelcontacthoek verlaagt en een meer gelijkmatige verspreiding bevordert, waardoor de terugslag wordt verminderd en de hechting aan het oppervlak verbetert. Met PGA aanwezig schalden de afgezet fluoresceinevolumes lineair met absorptie, en de variatie werd aanzienlijk verminderd tussen cartridges. Statistische analyse bevestigde dat PGA de reproduceerbaarheid significant verbeterde bij 40, 90 en 120 nL spottingvolumes (***p < 0,001, ****p < 0,0001), terwijl zeer kleine druppeltjes (10–20 nL) weinig verschil lieten zien, omdat de rebound minder uitgesproken is bij lage kinetische energieën.

Vervolgens werd de toevoeging van polymeeradditieven die in de DMF-workflow werden gebruikt geëvalueerd op hun invloed op het gedrag van Cas9–sgRNA-ribonucleoproteïne (RNP) onder de laagvolumebuffercondities die voor elektroporatie worden gebruikt. Hiervoor werd gebruik gemaakt van Flow-induced dispersie analysis (FIDA) technologie. FIDA werd gekozen omdat het een nauwkeurige, oplossingsfase-meting biedt van hydrodynamische radius en bindingsaffiniteit, waardoor interacties tussen eiwit en nucleïnezuur kunnen worden gekwantificeerd onder dezelfde buffervoorwaarden als in een experimentele setting. FIDA toonde aan dat vrij sgRNA een hydrodynamische straal (Rh) van 3,45 ± 0,26 nm vertoonde, wat overeenkomt met een kleine, enkelstrengige RNA-soort. Titratie met Cas9 produceerde een stabiel RNP-complex met een Rh van 15,32 ± 0,46 nm en een sub-nanomolaire bindingsaffiniteit (KD = 0,70 ± 0,14 nM) (Figuur 2).

Om het effect van polymeerstabilisatie te beoordelen, werd poly-L-glutaminezuur (PGA) toegevoegd aan het gids-RNA voorafgaand aan de vorming van RNP. De aanwezigheid van PGA verminderde de schijnbare affiniteit tussen Cas9 en sgRNA (K_D = 67,7 ± 9,5 nM) en verminderde de complexgrootte tot ongeveer 10 nm (Figuur 2A rechter paneel). Hoewel de verminderde affiniteit minder strak geassocieerde complexen suggereert, gaf de kleinere en meer uniforme R_h aan dat PGA de vorming van oversized RNP-assemblages voorkomt (Figuur 2B).

Vervolgens werd de stabiliteit van de RNP beoordeeld onder elektroporatiecondities met behulp van Taylor-dispersieanalyse (Figuur 2C). Zonder polymeer produceerden Cas9–sgRNA-mengsels brede, slecht passende Taylorgrammen die wijzen op aggregatie (Figuur 2B). Ter vergelijking: toevoeging van 0,0025 mg/mL PGA leverde goed gedefinieerde, monodisperze dispersieprofielen op (R² = 0,999) met R_h ~ 9,6 nm. Deze resultaten tonen aan dat PGA aggregatie voorkomt en de uniformiteit van RNP verbetert, waardoor reproduceerbare nanoliter-electroporatie mogelijk wordt. Deze stabilisatie biedt een mechanistische reden voor de hoge montage-efficiënties die zijn waargenomen in downstream T-celexperimenten.

Dosisafhankelijke bewerkingsefficiëntie in primaire T-cellen

Hoewel FIDA-experimenten aangaven dat PGA de efficiëntie van RNP-assemblage vermindert, werd aangenomen dat functionele bewerkingsuitkomsten minder beïnvloed waren, aangezien elektroporatie doorgaans wordt uitgevoerd met een overschot aan geleide-RNA ten opzichte van Cas9. Daarom werd het PGA–RNP invoervolume geëvalueerd op impact op knockout-efficiëntie in primaire menselijke T-cellen bij de TRAC-locus (Figuur 2D). Over vier cartridges was de bewerkingsefficiëntie consequent hoog (>75–80%) bij RNP-ingangen van 40 nL (2,1 pmol), 20 nL (1,05 pmol) en 10 nL (0,53 pmol), met minimale variabiliteit tussen CD4⁺ en CD8⁺ subsets. Zelfs bij 5 nL (0,26 pmol) bleef de bewerking robuust, hoewel er een bescheiden vermindering werd waargenomen vergeleken met hogere doseringen. Bij de laagste geteste dosis (2,5 nL, 0,13 pmol) nam de montage-efficiëntie aanzienlijk af en stabiliseerde rond ~60% TRAC KO. Controles bevestigden de specificiteit van de montage: wells zonder elektroporatie (0V) en off-cartridge controls (OCC) vertoonden alleen achtergrondknockout. De verhoogde TCR-negatieve frequentie waargenomen in de off-cartridge control (OCC) CD8⁺-populatie weerspiegelt waarschijnlijk donorspecifieke baseline TCR-downmodulatie na activatie, onafhankelijk van elektroporatie of genbewerking omdat deze cellen niet aan de cartridge zijn blootgesteld. Samen tonen deze resultaten aan dat DMF-ection efficiënte CRISPR-gemedieerde bewerking op nanoliter-schaal RNP-invoer mogelijk maakt. Belangrijk is dat de bewerking vergelijkbaar was tussen CD4⁺ en CD8⁺ T-cellen, wat de toepasbaarheid van het platform over T-cel subsets benadrukt en suggereert dat het RNP-gebruik met meer dan een orde van grootte kan worden verminderd zonder de knockout-efficiëntie te verminderen.

Efficiënte genverstoring in primaire CD4⁺- en CD8⁺ T-cellen met behulp van miniaturiseerde DMF-ection
Om de prestaties van de DMF-ectionworkflow dieper te valideren, werd CRISPR–Cas9-gemedieerde knockout van de TRAC-locus beoordeeld in primaire menselijke CD4⁺- en CD8⁺ T-cellen, waarbij slechts 10.000 geactiveerde cellen per conditie werden gebruikt. Drie experimentele groepen werden opgenomen: de TRAC-targeting guide condition (TRAC KO), een non-targeting control (NTC) om rekening te houden met niet-specifieke effecten van RNP-afgifte, en een off-cartridge control (OCC) om de basislijn TCRα/β-expressie vast te stellen in onbehandelde, niet-gemanipuleerde cellen. Er werd een standaard gatingstrategie toegepast om live singlets te identificeren, gevolgd door CD4⁺- en CD8⁺-subsets en TCRα/β-expressie (Figuur 3A). Hoge efficiëntie genverstoring van de TRAC-locus werd bereikt in beide T-cel subsets over 40 onafhankelijke elektroporatieruns. In CD4⁺ T-cellen bereikte de TRAC knockoutefficiëntie 88,4 ± 4,9%, vergeleken met 3,2 ± 4,7% in NTC en 9,8 ± 5,1% in OCC-omstandigheden. Een vergelijkbaar resultaat werd waargenomen in CD8⁺ T-cellen, waarbij TRAC KO 89,8 ± 4,2% bereikte, tegenover 4,2 ± 7,4% (NTC) en 20,2 ± 4,9% (OCC) (Figuur 3B, links). Belangrijk is dat elektroporatie geen substantiële cytotoxiciteit veroorzaakte onder de omstandigheden. De levensvatbaarheid overschreed 96% in alle groepen, zonder significant verschil tussen TRAC KO (97,1 ± 1%), NTC (96,8 ± 1%) en OCC (97 ± 1%) (Figuur 3B, rechts). Samen tonen deze gegevens aan dat DMF-elektroporatie robuuste, hoogefficiënte TRAC-verstoring mogelijk maakt, terwijl de cellulaire levensvatbaarheid over meerdere onafhankelijke runs behouden blijft. Primaire menselijke T-cellen zijn verkregen uit commerciële bronnen met geïnformeerde donortoestemming en in overeenstemming met ethische richtlijnen van institutionele en leveranciers.

Behandeling van HEK293T sferoïden met digitale microfluidica
Vervolgens werd de digitale microfluidische elektroporatieworkflow geëvalueerd voor toepassingen met meercellige driedimensionale structuren. Holle HEK293T sferoïden werden gevormd door ongeveer 100 cellen per put in laag-hechtende microplaten te zaaien en 24 uur te cultiveren om sferoïde te vormen (Figuur 4A). Gevormde sferoïden werden vervolgens verzameld, opnieuw opgehangen en geladen op de digitale microfluïdische cartridge voor elektroporatie. Na behandeling werden de sferoïden afgeladen in een 96-well plaat voor downstream beeldvorming en groeianalyse.

Om een gemiddelde opbrengst van één sferoïde per put na elektroporatie te bereiken, werd er bewust een overtollig aantal sferoïden op de patroon geladen om materiaalverlies tijdens het hanteren en overbrengen te compenseren. Ongeveer 192 sferoïden werden opnieuw opgehangen in 100 μL elektroporatiebuffer en op de patroon geladen. Elke reactiefamilie ontving ~9,3 μL van de suspensie, wat overeenkomt met ~18 sferoïden, met individuele druppels die ~1 μL bevatten (1–2 sferoïden per druppel). Omdat ongeveer de helft van de sferoïden tijdens de werking van de patroon in de laadpoort bleef, resulteerde deze laadstrategie gemiddeld in ~1 sferoïde per tri-druppel elektroporatieplaats.

Analyse van sferoïde herstel gaf aan dat 0–1 sferoïden typisch per put werden afgelast, wat overeenkomt met ongeveer 4–6 sferoïden per reactiefamilie (Figuur 4B linker paneel). Dit herstel is lager dan het theoretische maximum en weerspiegelt verliezen die optreden tijdens het wassen, aspiratie van supernatant en het vasthouden van sferoïden in de laadpoort. Deze verliezen worden toegeschreven aan de kleine sferoïde diameter (~100 μm) en de inherente moeilijkheid om de uniforme verdeling van niet-enkelcellige structuren binnen suspensie te behouden. Daardoor blijven sommige sferoïden ongelijk verdeeld of komen ze niet in het tri-druppelgebied binnen. Het laden van een overmaat sferoïden zorgde ervoor dat er op de meeste elektroporatieplaatsen ten minste één sferoïde aanwezig was, waardoor consistente downstreamanalyse mogelijk was, zoals aangetoond door een microscoopbeeldvorming van DAPI-gekleurde sferoïde in de microfluidicapatroon (Figuur 4B, rechter paneel). Verdere procesoptimalisatie kan het aantal sferoïden verminderen dat nodig is om gelijkwaardig herstel te bereiken. Ondanks deze verwerkingsverliezen maakte de workflow het mogelijk om de intacte sferoïden zachtjes te positioneren binnen de tri-druppel elektroporatiegeometrie.

EGFP mRNA-levering en levensvatbaarheid in HEK293T sferoïden
Efficiënte afgifte van EGFP mRNA in HEK293T sferoïden werd waargenomen na elektroporatie (50 ng GFP mRNA per sferoïde). Fluorescentiemicroscopie uitgevoerd 24 uur na elektroporatie toonde robuuste en ruimtelijk uniforme GFP-expressie in de gehele elektroporatieve sferoïden, terwijl er geen detecteerbare fluorescentie werd waargenomen onder 0 V of buiten de cartridge gecontroleerde omstandigheden (Figuur 4C, linker paneel). Kwantitatieve analyse van genormaliseerde gemiddelde fluorescentieintensiteit (MFI) per sferoïde gebied bevestigde succesvolle transfectie onder beide geteste elektroporatieparameterset (Figuur 4C, middenpaneel). Specifiek vertoonden sferoïden die elektroporeerd waren bij 500 V, 2 ms, 2 pulsen een MFI van 6,96 × ^10-5 ± 3,50 × ^10-5, terwijl die elektroporeerde bij 375 V, 6 ms, 1 puls een MFI van 5,05 × ^10-5 ± 3,29 × ^10-5 vertoonden. Er werd geen meetbare fluorescentie gedetecteerd onder controleomstandigheden (0 ± 0). Beide elektroporatiecondities produceerden significant een hogere fluorescentie vergeleken met controles (p < 0,05), zonder statistisch significant verschil tussen pulsparameters. Om te beoordelen of elektroporatie de groei van de sferoiden of de structurele integriteit nadelig, werden de diameters van de sferoiden dagelijks gemeten gedurende 5 dagen na behandeling. Electroporatieve sferoïden vertoonden groeikinetiek vergelijkbaar met onbehandelde controles, wat aangeeft dat mRNA-transfectie de levensvatbaarheid of proliferatiecapaciteit van de sferoiden niet aantastte (Figuur 4C, rechter paneel). Samen tonen deze resultaten aan dat digitale microfluïde elektroporatie efficiënte mRNA-afgifte in intacte meercellige sferoïden mogelijk maakt, terwijl structurele integriteit en groei behouden blijven, wat de haalbaarheid ondersteunt om dit platform uit te breiden naar driedimensionale cellulaire modellen.

De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. De statistische significantie werd bepaald met eenrichtings-ANOVA en Tukey's post hoc-correctie voor meervoudige vergelijkingen, met een significantiedrempel van p < 0,05. N waarden vertegenwoordigen onafhankelijke biologische replicaten (aparte donoren of onafhankelijke cartridge-runs) zoals gespecificeerd in de figuur.

Figuur 1. DMF-elektroporatieplatformarchitectuur en workflow. (A) Foto van de DMF-patroon. (B) Geannoteerd schema van de samengestelde 48-plex cartridge-indeling (middenafbeelding), met de (A–H) organisatie van acht identieke families, elk met zes onafhankelijk adresseerbare elektroporatieplaatsen, met vloeibare elektrode-laadpoorten, cellaadpoorten, anode-, kathode- en nanospotgebieden gelabeld (linker insetafbeelding). Belangrijke kenmerken, waaronder laadpoorten, losspoorten en montageklemmen, zijn gelabeld. De patroon wordt in elkaar gezet door de twee platen in één juiste richting te zetten totdat er een duidelijke mechanische inschakeling wordt gevoeld. Rechts afbeelding: vloeistofbehandelaar dispenseerkaart toont kleurgecodeerde posities voor laadpoorten (rood), lospoorten (roze) en het lokaliseren van doelgebieden (blauw). (C) Links: afbeelding die de positionele nauwkeurigheid van akoestische afgifte over alle 48 locaties toont (n = 48), met dropposities uitgezet ten opzichte van het elektrodemiddenpunt (mm). De strakke clustering bevestigt de nauwkeurigheid van submillimeter afzetting. Rechts: representatieve foto's die een correct gecentreerde plek tonen vóór de rehydratatie door de celdruppel (boven) en tijdens de rehydratatie, waarbij de druppel heen en weer wordt geschoven waar de gids is om opnieuw te suspenderen (onder, rode pijl). (D) Bovenaanzicht van discrete elektroporatiegebieden, die de stapsgewijze beweging van druppels toont vanaf (i) rehydratatie van de lading door de druppel heen en weer te bewegen over het afgezet geleide-RNA, (ii) beweging naar de elektroporatieplaats tussen anode en kathode, waar de celdruppel overbruggen met de twee flankerende druppels vloeibare elektrode en wordt gepulseerd, en (iii) de volledige tri-drop die naar zijn losspoort beweegt voordat deze door de vloeistofbehandelaar wordt opgehaald. (E) End-to-end workflowschema. Geleider-RNA wordt op het cartridgesubstraat aangebracht met behulp van een akoestische dispenser. Cellen en lading worden voorbereid en geladen op de cartridge met behulp van een geautomatiseerde vloeistofbehandelaar. Elektroporatie wordt uitgevoerd op het DMF-platform. Cellen worden afgeladen in een plaat met 96 putten en overgebracht naar een broedmachine voor terugwinning. Downstream-analyse wordt uitgevoerd met behulp van flowcytometrie, microscopie, next-generation sequencing of andere geschikte uitlezingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Impact van polymeersupplementatie op depositie en RNP-assemblage. (A) Polymeersupplementatie verbetert de akoestische afzettingsnauwkeurigheid. Fluoresceïneabsorptie na afzetting en reconstitutie over vier onafhankelijke patronen, met of zonder poly-L-glutaminezuur. De variantie werd verminderd bij intermediaire volumes (40–120 nL) in aanwezigheid van PGA. 
(B) Invloed van PGA op Cas9–sgRNA-assemblage. FIDA-affiniteitsbindingscurves die de hydrodynamische straal (Rh) meten in afwezigheid (linker paneel) of aanwezigheid (rechter paneel) van PGA. Vrij sgRNA vertoonde een Rh van 3,45 ± 0,26 nm, terwijl Cas9-titratie een RNP-complexgrootte van 15,32 ± 0,46 nm opleverde (Kd = 0,70 ± 0,14 nM). Toevoeging van PGA verminderde de complexgrootte en verzwakte de bindingsaffiniteit op een concentratieafhankelijke manier. Met toevoeging van 0,005 mg/mL PGA vertoonde vrij sgRNA een Rh van 4,31 ± 0,07 nm, terwijl Cas9-titratie een RNP-complexgrootte van 10,21 ± 0,38 nm (K opleverde)_d = 67,7 ± 9,5 nM). Experimenten werden uitgevoerd in een elektroporatie-assaybuffer met lage geleidbaarheid en 0,05% Pluronisch F-68. Fluorescentie werd gedetecteerd op 480 nm met behulp van de geïntegreerde LED-module. Voor alle experimenten werd een permanent gecoate capillaire (Ø 75 μm, L = 100 cm) gebruikt. Om het effect van polyanionische polymeren op RNP-assemblage te testen, werd PGA toegevoegd aan assaymengsels bij concentraties van 0,0025 mg/mL en 0,005 mg/mL. Deze voorwaarden werden geselecteerd om het bereik te modelleren dat wordt gebruikt in digitale microfluidica-elektrobewaking en elektroporatiebuffers. Voor directe bindingsanalyse werd 10 nM FAM-gelabeld sgRNA dat zich richt op de TRAC-locus gebruikt als fluorescerende indicator. Toenemende concentraties Cas9-nuclease (tot 500 nM) werden in een CapMix-assay getitreerd tegen de indicator om verspreidingsprofielen voor complexvorming te genereren. Alle experimenten werden uitgevoerd bij 25 °C, waarbij elk datapunt 40 nL Indicator en ~12 μL analyte verbruikte (Cas9). Experimenten werden uitgevoerd met de volgende volgorde: (1) spoelen met 0,1% fosforzuur bij 3.500 mbar gedurende 30 seconden; (2) spoelen met assaybuffer op 3.500 mbar gedurende 30 seconden; (3) het vulen van de capillaire met analyte op 3.500 mbar gedurende 20 seconden; (4) de indicator injecteren bij 50 mbar gedurende 10 seconden; (5) mobiliseren en meten met analyte op 400 mbar gedurende 180 seconden. Hydrodynamische stralen werden berekend door gebruik te maken van de geëxtraheerde piekbreedte bij de helft van de maximale piekhoogte en dissociatieconstanten (K_D) werden bepaald door niet-lineaire regressie die past op een 1:1 bindingsmodel. (C) Effect van PGA op de stabiliteit van de RNP. Taylor-dispersieprofielen van Cas9–sgRNA-complexen met en zonder PGA, uitgevoerd met 500 nM Cas9-nuclease en 50 nM FAM-getagd sgRNA. Bij afwezigheid van PGA werd geen stabiel complex waargenomen, wat blijkt uit de toenemende vorming van grote aggregaten samen met een afnemend signaal van het complex in de loop van de tijd (links). Toevoeging van 0,0025 mg/mL PGA leverde een goed gedefinieerde, monodisperse Taylorgram op met minimale aggregatie van een R_h ~ 9,6 nm (R² = 0,999, toch). Complexe stabiliteit werd beoordeeld onder standaard elektroporatiecondities (500 nM Cas9 + 50 nM sgRNA) met of zonder 0,0025 mg/mL PGA. De monsters werden vooraf gemengd en op 4 °C gehouden in de inlaat-monstertray, terwijl de injecties in intervallen van 10 minuten over meerdere uren werden uitgevoerd. Experimenten werden uitgevoerd met de volgende volgorde: (1) spoelen met 0,1% fosforzuur bij 3.500 mbar gedurende 30 seconden; (2) spoelen met assaybuffer op 3.500 mbar gedurende 30 seconden; (3) het opvullen van de capillaire met analyte (assay buffer) bij 3.500 mbar gedurende 20 seconden; (4) de indicator injecteren bij 50 mbar gedurende 10 seconden; (5) mobiliseren en meten met analyte op 400 mbar gedurende 180 seconden. Onstabiele complexvorming werd aangetoond door de vorming van grote aggregaten (spikes in het Taylorgram) en afnemend signaal. Stabiele complexen werden geïdentificeerd door goed passende, monodisperse Taylorgrammen (R² > 0,99), en R_h waarden werden geëxtraheerd uit aangepaste profielen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. TCR alfa/beta knockout-efficiëntie en levensvatbaarheid in primaire menselijke T-cellen. (A) Representatieve flowcytometrie-gatingstrategie voor levende singlets, CD4⁺ en CD8⁺ T-cel subsets, en TCRα/β expressie in controle- (niet-targeting sgRNA) en experimentele (TRAC sgRNA) condities. Cellen werden sequentieel gegated op FSC/SSC, singlets, levensvatbaarheid en CD4⁺ of CD8⁺ populaties voorafgaand aan de beoordeling van TCRα/β oppervlakteexpressie. (B) Links: TCRα/β knockout-efficiëntie in CD4⁺ en CD8⁺ T-cel subsets onder drie omstandigheden: TRAC KO, non-targeting control (NTC) en off-cartridge control (OCC). CD4⁺: TRAC KO = 88,4 ± 4,9% (n = 40), NTC = 3,2 ± 4,7% (n = 24), OCC = 9,8 ± 5,1% (n = 18). CD8⁺: TRAC KO = 89,8 ± 4,2% (n = 40), NTC = 4,2 ± 7,4% (n = 24), OCC = 20,2 ± 4,9% (n = 18). Rechts: Post-elektroporatie levensvatbaarheid onder alle omstandigheden, met een hek op singlets. Levensvatbaarheid: TRAC KO = 97,1 ± 1% (n = 40), NTC = 96,8 ± 1% (n = 24), OCC = 97 ± 1% (n = 18). Individuele datapunten worden weergegeven met gemiddelde en SD. n staat voor onafhankelijke elektroporatieruns over meerdere cartridges en dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Efficiënte mRNA-afgifte in HEK293T sferoïden met behulp van DMF-ection. (A) Workflowdiagram dat het proces van het vormen van sferoïden en het uitvoeren van sferoidtransfectie beschrijft. Honderd HEK293T cellen worden per put geladen in een gespecialiseerde sferoide microplaat en 24 uur gekweekt om sferoïden met een diameter van 100 μm te vormen. Sferoïden (192) worden afgeladen en opnieuw opgehangen in 100 μL transfectiebuffer. Deze ophanging wordt, met de juiste lading, geladen op de geleide-gestippelde DMF-ection-cartridge met 9,3 μL per familie. Zodra elektroporatie plaatsvindt, worden monsters afgeladen in een 96-putplaat voor downstream analyse. (B) Links: Aantal sferoïden per familie afgeladen op DMF-ection patroon vergeleken met handgepipetteerde off-cartridge besturingen. Midden: Fluorescerende afbeelding van tri-drop, waarbij een groter rood vierkant de tri-drop omlijnt en de rode ovaal de bol omcirkelt. Rechts: Fluorescerende afbeelding met laadpoort met geladen sferoïden (blauwe cirkels). (C) Linkerpaneel: Brightfield-beelden van intacte HEK293T sferoïden vóór elektroporatie en fluorescentiebeelden van sferoïden 24 uur na EGFP mRNA-elektroporatie, vergeleken met 0 V en off-cartridge controles. (D) Bovenpaneel: Kwantificering van de gemiddelde fluorescentieintensiteit genormaliseerd naar het sferoide gebied voor twee elektroporatiecondities (500 V, 2 ms, 2 pulsen; 375 V, 6 ms, 1 puls). Geen significant verschil tussen elektroporatietoestanden, maar alle elektroporatietoestanden verschillen significant van 0 V en off-cartridge regelaars (500 V 2 ms 2 puls: 6,955 × ^10-5 ± 3,502 × ^10-5, 375 V 6 ms 1 puls: 5,045 × ^10-5 ± 3,294 × ^10-5, 0 V: 0 ± 0, Off-cartridge controle: 0 ± 0 (*p < 0,05). Beelden werden verwerkt met FIJI beeldverwerkingspakket¹⁰. (500 V, 2 ms, 2 pulsen: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 puls: n = 4; Off-cartridge besturing: n = 3; 0 V regeling: n = 3). (D) Onderpaneel: Sferoide diameter na elektroporatie over 5 dagen onder omstandigheden. De diameter werd gemeten met FIJI op basis van fasecontractbeelden gemaakt met 20x vergroting en een omgekeerde microscoop. (500 V, 2 ms, 2 pulsen: n = 6; 375 V, 6 ms, 1 puls: n = 4; Uitgeschakelde cartridgecontrole: n = 3; 0 V regeling: n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een geminiaturiseerde digitale microfluidische elektroporatieworkflow die efficiënte intracellulaire levering in primaire menselijke T-cellen mogelijk maakt met nanoliter-druppels. Een centraal voordeel van deze methode is de mogelijkheid om CRISPR–Cas9 genoombewerking uit te voeren met slechts 10.000 cellen per reactie, wat de materiaalbehoefte aanzienlijk vermindert ten opzichte van conventionele elektroporatie. De druppelgebaseerde architectuur ondersteunt automatisering, waardoor reproduceerbare reagentiaverwerking en reactieassemblage op meerdere parallelle locaties worden gegarandeerd.

In eerdere studies toonde directe benchmarking van het DMF-ectionplatform tegen een veelgebruikt systeem aan dat conventionele nucleofectie minder dan 2% GFP-positieve T-cellen produceerde bij 10.000 cellen per edit, terwijl het DMF-ectionplatform >90% transfectie-efficiëntie behaalde onder dezelfde lage inputcondities. Voor een gearrayed screen van 192 condities vereiste het DMF-platform 25 keer minder cellen en ongeveer 50 keer minder Cas9 per conditie dan conventionele methoden⁹. Deze vergelijkingen benadrukken de materiële voordelen van miniaturiseerde DMF-elektroporatie voor toepassingen met lage input en screening

Kritieke stappen en probleemoplossing
Verschillende stappen zijn cruciaal voor succes. Nauwkeurige kalibratie van de akoestische vloeistofbehandelaar zorgt voor een precieze depositie van geleide-RNA op het patroonsubstraat, wat essentieel is voor consistente RNP-assemblage. Als spotting inconsistent is of druppels niet aan het substraat hechten, controleer dan of PGA in het guide-RNA-mengsel is opgenomen in de juiste concentratie (5 mg/mL eind) en dat de akoestische dispenser is gekalibreerd voor de specifieke bronplaatgeometrie. Inconsistente spotting bij tussenliggende volumes (40–120 nL) wordt meestal veroorzaakt door druppelrebound op het hydrofobe oppervlak; het licht verhogen van de PGA-concentratie of het verlagen van de doseerhoogte kan dit oplossen.

Het handhaven van de juiste celconcentratie vóór het laden is belangrijk, omdat dichtheidsafwijkingen de druppelvorming kunnen belemmeren en de bewerkingsefficiëntie kunnen verminderen. Als de bewerkingsefficiëntie onder de 75% daalt, verifieer dan eerst dat de activatie van T-cellen voldoende was (bevestig de upregulatie van CD25 en CD69 via flowcytometrie vóór elektroporatie), en bevestig dat Cas9 en sgRNA direct voor de lading zijn gecombineerd in plaats van vooraf.

Polymeeradditieven spelen een belangrijke rol bij het stabiliseren van Cas9–sgRNA-complexen onder elektroporatiebuffercondities¹¹. Hoewel PGA de nominale bindingsaffiniteit vermindert, verbetert het stabiliserende effect de reproduceerbaarheid en voorkomt het aggregatie bij nanolitervolumes. Dit is een instelbare parameter voor onderzoekers die de workflow aanpassen aan andere eiwit–RNA-complexen.

Probleemoplossing
Mislukte druppelbrugvorming
Bekijk het instrumentele kwaliteitscontrolerapport na elke proef na de uitvoering. Het ontbreken van gedetecteerde stroom duidt op mislukte brugverbinding, hetzij door onvoldoende druppels of het niet fuseren, en wordt automatisch door het systeem gemarkeerd. Getroffen locaties kunnen niet binnen dezelfde run worden teruggevonden. Als de storingen sporadisch zijn (<10%), is geen actie nodig; Verdeel replicates over meerdere cartridges om impact te minimaliseren. Als de storingen systematisch zijn, voer dan de kwaliteitscontrole en de System Health Check uit en neem contact op met technische ondersteuning als de problemen aanhouden.

Inconsistente sgRNA-spotting
Na het dispenseren controleer je visueel dat alle verwachte druppels aanwezig zijn, gecentreerd binnen elektrodegrenzen en vrij van satellietdruppels. Voeg PGA toe aan het geleide RNA-mengsel om polydispersie te voorkomen. Controleer bij ontbrekende druppels het register van de dispenser en geef opnieuw indien nodig. Bij slechte meniscusvorming houd je minimaal 5 μL per put, draai de plaat kort rond en tik zachtjes op een vlak oppervlak. Werk op ijs en sluit platen af als ze niet in gebruik zijn om verdamping te voorkomen.

Verminderde montage-efficiëntie
Als er een verminderde bewerkingsefficiëntie wordt waargenomen, onderzoek dan in de volgende volgorde: (1) valideer de afgiftecondities met EGFP mRNA voordat je doorgaat met RNP; (2) bevestigen dat de gemeten QC-stroom overeenkomt met verwachte waarden; (3) celdichtheid titreren, geleide-RNA en Cas9-concentratie; (4) de hoge cellevensvatbaarheid onmiddellijk voor het laden bevestigen; (5) de integriteit van het reagens en de opslagcondities verifiëren; (6) bevestig dat de uitleesmethode geschikt is voor de celdichtheid en het doel van interesse.

Het platform aanpassen aan alternatieve celtypen en modellen
Voor andere primaire immuunceltypen, zoals NK-cellen of regulerende T-cellen, zullen elektroporatieparameters optimalisatie vereisen. Celgrootte is een belangrijke bepalende factor voor de elektrische velddrempel die nodig is voor membraanpermeabilisatie: kleinere cellen vereisen hogere veldsterktes, terwijl grotere cellen permeabiliseerd zijn bij lagere spanningen—een goed gedocumenteerd verband in de elektroporatiebiofysica. Als uitgangspunt voor celtypen kleiner dan geactiveerde CD3⁺ T-cellen, houd de spanning (500–550 V) aan of verhoog je licht, terwijl de pulsduur kort blijft (2–3 ms) om overmatige thermische stress te voorkomen. Voor grotere cellen verlaag je de spanning tot 350–400 V en moduleer je de pulsduur zonder meer dan 10 ms te overschrijden. Daarnaast is micro-optimalisatie op donorniveau gebruikelijke praktijk bij elektroporatie, en parameters die in gezonde donorcellen worden gevalideerd, vertalen zich mogelijk niet direct naar ziek of patiëntafgeleid materiaal. Cellen van donoren met hematologische maligniteiten, chronische infectie of immunodeficiëntie vertonen vaak gewijzigde biofysische eigenschappen, en de bewerkingsefficiëntie en levensvatbaarheid moeten voor elke nieuwe donor opnieuw worden geëvalueerd, vooral bij het werken met niet-gezonde of klinische monsters. De cellevensvatbaarheid moet worden beoordeeld 24 en 72 uur na elektroporatie en de parameters moeten iteratief worden aangepast. De Cas9-dosering moet mogelijk ook met 1,5–2× worden verhoogd ten opzichte van het T-celprotocol als de afgifte van RNP wordt verminderd.

Voor grotere of dichtere 3D-modellen zoals organoïden met een diameter van meer dan 200 μm, kan de pakking in de cartridge aangepast moeten worden om een grotere structuurgrootte en diffusiebarrières te accommoderen. Gebruikers die dergelijke toepassingen proberen moeten overwegen om de buitenste cellagen vooraf te dissociëren om de penetratie van reagens te verbeteren of meerdere pulscondities achter elkaar toe te passen. Neem contact op met de corresponderende auteur voor advies over het aanpassen van druppelgeometrie en pulsparameters voor structuren boven de hier gevalideerde 100 μm sferoïde diameter.

Translatierelevantie
Het translationele potentieel van deze workflow gaat verder dan alleen knockout. Het platform is toegepast op homologiegerichte reparatie-knock-in van een 4 kb GFP-constructie en een functionele anti-HER2 CAR bij de TRAC-locus in primaire T-cellen, evenals op een 45-doelen arrayed CRISPR-screen die nieuwe regulatoren van CD4⁺ T-celuitputting⁹ identificeert. Deze toepassingen illustreren een pad van protocolniveau-optimalisatie naar functionele ontdekking in klinisch relevante primaire celmodellen. Desalniettemin blijven er belangrijke beperkingen bestaan: functionele uitkomsten zoals allelische verstoringspercentages door sequencing, cytokinesecretie en in vivo engraftment zijn niet beoordeeld in het huidige protocol en vormen noodzakelijke volgende stappen voor therapeutische vertaling. Bovendien ondersteunt het platform 48 parallelle reacties per cartridge, maar multi-cartridge parallelisatie is vereist voor grotere schermen.

Beperkingen
Zoals bij elk miniaturiseerd platform moeten bepaalde praktische beperkingen worden erkend. Downstream fenotypering moet worden aangepast aan de kleine reactieschaal; Acquisitie van flowcytometrie kan extra concentratiestappen of het poolen van replicateputten vereisen om voldoende gebeurtenistellingen te bereiken. De elektroporatie-instellingen van het platform kunnen ook optimalisatie vereisen voor celtypen met een hoge gevoeligheid voor elektrische velden, en gebruikers dienen gepubliceerde parameters als startpunten te behandelen in plaats van universeel vaste waarden. Ten slotte werd formele levensvatbaarheidskleuring op uitgebreide post-elektroporatietijden niet uitgevoerd voor de hier gepresenteerde sferoidworkflow; Diametergebaseerde groeitracking werd gebruikt als een surrogaatmaatstaf voor structurele integriteit en vertegenwoordigt een belangrijke richting voor toekomstige karakterisering.

Al met al biedt DMF-ection, een niet-virale transfectiemethode, een krachtige en flexibele aanpak voor genoombewerking en mRNA-levering in omgevingen met lage input en hoge doorvoer. De compatibiliteit met primaire T-cellen, gestructureerde 3D-modellen en geautomatiseerde vloeistofbehandeling vergroot de mogelijkheden in celtherapie-engineering, multiconditie-CRISPR-screening en miniaturiseerde functionele genomica.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentatie
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Sferoïde protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Sferoïde protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentatie
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Sferoïde kweekmedium
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfectie
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentatie
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentatie
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Sferoïde kweekmedium
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentatie
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Sferoïde protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cel media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Perifere bloed, gecryopreserveerd, pan CD3+ Helper T Cellen, negatief geselecteerd
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cel Activeringsmedia
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cel Activeringsmedia
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentatie
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentatie
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Sferoïde kweekmedium
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Gebruik een bij 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Sferoïde protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfectie- gebruik bij 1:20 in DMF compatibele buffer om complete Transfectie buffer te maken
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Sferoïde protocol