Methodenartikel

Senescentiedetectie met behulp van gereflecteerd licht in de vetachtige stromale vaatfractie

171 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70588

⸱

5 juni 2026

 ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet, 2Nordiska Kliniken Stockholm

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt gereflecteerd licht confocale microscopie voor objectieve, enkelceldetectie van senescence-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-gal) activiteit in de stromale vasculaire fractie die is geïsoleerd uit menselijk vetweefsel. De methode is compatibel met immunocytochemie, bevat pH-controles voor kwantitatieve beoordeling en biedt bovendien een gevoeliger en minder subjectief alternatief voor conventionele SA-β-gal kleuring.

Samenvatting

Cellulaire senescentie is een door stress veroorzaakte toestand die wordt gekenmerkt door permanente celcyclusstop en de ontwikkeling van een kenmerkend secretoorium profiel dat de weefselfunctie beïnvloedt en bijdraagt aan veroudering en metabole ziekten. Senescence-geassocieerde activiteit van β-galactosidase (SA-β-gal) wordt veel gebruikt als marker van senescente cellen; echter, conventionele SA-β-gal assays vertrouwen vaak op subjectieve visuele beoordeling en leveren beperkte kwantitatieve informatie. Deze beperkingen zijn vooral duidelijk in primaire menselijke celpopulaties, zoals de stromale vasculaire fractie (SVF) die afkomstig is van vetweefsel, dat een heterogeen mengsel bevat van preadipocyten, immuuncellen en endotheelcellen. Hier presenteren we een geoptimaliseerde reflectelicht-confocale microscopiebenadering voor hoogresolutie, kwantitatieve detectie van SA-β-galactiviteit in menselijke SVF-cellen. Dit protocol maakt objectieve single-cel analyse van SA-β-gal activiteit mogelijk, maakt gelijktijdige immunocytochemie mogelijk voor multiplexing detectie van extra senescence- of afstammingsmarkers, en bevat pH-gematchte controles. Door deze kenmerken te combineren, biedt deze methode een gevoelige, reproduceerbare en kwantitatieve benadering voor het bestuderen van cellulaire senescentie in heterogene primaire menselijke celpopulaties. Het biedt een verbeterd alternatief voor conventionele SA-β-gal beitsen.

Inleiding

Cellulaire senescentie is een veelzijdige reactie die kan ontstaan door veel soorten stress, waaronder DNA-schade, telomeerverlies en oncogenactivatie. Dit leidt tot een stabiele stilstand van de celcyclus samen met verhoogde weerstand tegen apoptose, mede veroorzaakt door de inductie van anti-apoptotische eiwitten 1,2. Veroudering is in verband gebracht met verbeterde celoverleving in contexten waar het behoud van weefselintegriteit essentieel is, zoals reparatie en onderhoud 3,4. Naast zijn rol in weefselhomeostase draagt senescentie ook bij aan de normale ontwikkeling door embryonale patronen 5,6 te vormen en als barrière voor tumorvorming door het bevorderen van het opruimen van beschadigde of mogelijk kwaadaardige cellen 7,8,9. Hoewel senescentie een gunstige functie kan vervullen, hebben meerdere studies een contrasterend aspect aangetoond waarbij senescente cellen een pro-inflammatoire secretorie kunnen ontwikkelen die de lokale stofwisseling kan verstoren, omliggende weefsels kan beschadigen en zelfs de tumorprogressie kan ondersteunen 10,11,12,13.

Veroudering is aangetroffen bij diverse celtypen over meerdere weefsels en wordt vaak geassocieerd met veroudering, ziekte, weefseldysfunctie of kanker. In de lever is aangetoond dat veroudering van leverstellate cellen tumorprogressie bevordert door metabole homeostase te veranderen via uitgescheiden factoren14,15. Studies naar hepatocyten16 of volledige leverbiopten17 geven aan dat veroudering in deze cellen kan bijdragen aan metabole comorbiditeiten zoals metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte en steatohepatitis geassocieerd met stofwisselingsstoornissen. Bovendien heeft de relatie tussen type 2 diabetes en senescentie het afgelopen decennium veel aandacht gekregen, met bewijs dat senescentie wordt gekoppeld aan diabetesgerelateerde complicaties in alvleeskliercell β en, hepatocyten16 en adipocyten 18,19,20,21. Deze bevindingen benadrukken het belang van het nauwkeurig identificeren van senescentie cellen in metabole weefsels, waar hun accumulatie en heterogeniteit bijdragen aan ziekteprogressie en het therapeutisch gerichtop 22.

De veranderingen in signaaloverdracht en eiwitexpressie die samenhangen met senescentie zijn vaak cel- en weefselspecifiek; Echter, verschillende kenmerken zijn globaal kenmerkend voor senescente cellen. Een van de meest gebruikte markers is de verhoogde enzymatische activiteit van β-galactosidase bij pH 6,0, bekend als senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal)23. β-galactosidase is een lysosomale hydrolase die in alle cellen voorkomt en normaal gesproken actief is bij een zure pH (~4,5–5,0), waar het bijdraagt aan de afbraak van geglycosyleerde substraten. Het kenmerkende kenmerk van SA-β-gal is het behoud van β-galactosidase-activiteit onder suboptimale pH-omstandigheden. In de klassieke assay worden cellen geïncubeerd met het synthetische substraat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal) bij pH 6,0, waarbij enzymatische activiteit in de meeste cellen verminderd is maar detecteerbaar blijft in senescente cellen. Dit leidt tot de vorming van een onoplosbaar blauw neerslag dat microscopischkan worden voorgesteld.

Hoewel deze assay breed is toegepast, is de detectie van het X-gal neerslag traditioneel gebaseerd op brightfield-microscopie. Brightfield-detectie is afhankelijk van visuele identificatie van blauwe neerslag en heeft daarom beperkte gevoeligheid voor laagniveausignalen en vroege senescentietoestanden. Daarentegen vangt reflecterend licht beeldvorming de optische dichtheid van het X-gal neerslag, waardoor kwantitatieve detectie mogelijk is over een breder dynamisch bereik. Meer recentelijk zijn fluorogene substraten ontwikkeld om de gevoeligheidte verbeteren. Deze benaderingen meten echter doorgaans β-galactosidase-activiteit onder omstandigheden die niet voldoen aan de klassieke pH-afhankelijke definitie van SA-β-gal. Daardoor kunnen ze de signaalintensiteit verhogen, maar de specificiteit voor senescentie verminderen. Daarentegen maakt de inherente opaciteit van het X-gal neerslag detectie mogelijk met behulp van confocale reflecterlichtbeeldvorming, wat een gevoeliger en kwantitatievere weergave oplevert terwijl de oorspronkelijke enzymatische definitie van SA-β-gal26 behouden blijft.

In de loop der jaren zijn aanvullende kenmerken van senescentie geïdentificeerd, waaronder een verhoogde expressie van de cycline-afhankelijke kinase-remmers P16 en P21, evenals de transcriptiefactor P53, die celcyclusarrest en andere senescentieprogramma's reguleert 27,28,29,30,31,32,33. Deze vooruitgang heeft geleid tot een robuustere definitie van senescentie, waarbij cellen doorgaans worden geclassificeerd op basis van de gecombineerde aanwezigheid van meerdere markers. In de praktijk worden deze markers echter vaak gemeten met verschillende modaliteiten: nucleaire markers, zoals P16 en P21, worden doorgaans gedetecteerd met fluorescentie-gebaseerde technieken, terwijl SA-β-galactiviteit traditioneel is beoordeeld met brightfield-microscopie. Deze scheiding heeft het vermogen om meerdere senescentiekenmerken binnen dezelfde cel te evalueren beperkt. Reflecterlichtbeeldvorming overwint deze beperking door directe integratie van SA-β-gal detectie met fluorescentie-gebaseerde markers binnen één beeldvormingsproces mogelijk te maken, wat een robuustere en biologisch betekenisvollere beoordeling van senescentie in heterogene celpopulaties mogelijk maakt.

Hoewel Dedic en collega's verschillende beperkingen van traditionele SA-β-gal beeldvorming aanpakken, waaronder verbeterde gevoeligheid, het gebruik van pH-gematchte controles voor objectieve drempelbepaling en compatibiliteit met immunocytochemie, werd hun gereflecteerd-licht confocale methode specifiek geoptimaliseerd voor geïsoleerde rijpe adipocyten26. Senescentie in vetweefsel is echter niet beperkt tot adipocyten34,35, en extra inzicht kan worden verkregen door het onderzoeken van de stromale vasculaire fractie (SVF). De SVF bestaat uit preadipocyten, endotheel- en fibroblastpopulaties, en diverse immuuncellen, die allemaal veroudering kunnen ondergaan en bijdragen aan vetremodel, ontsteking en veranderde metabole signalering. Het karakteriseren van senescentie binnen dit heterogene compartiment is daarom belangrijk om celtype-specifieke processen te koppelen aan weefselniveau en systemische uitkomsten.

Hier breiden we de detectie van gereflecteerd licht SA-β-gal uit naar SVF-cellen, waardoor toepassing ervan mogelijk is over meerdere soorten vetweefselcellen. Door deze aanpak te combineren met immunocytochemie, maakt de methode geïntegreerde enkelcelanalyse van SA-β-gal activiteit mogelijk, naast lijn- en functionele markers in primaire menselijke monsters.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de statuten van de Verklaring van Helsinki. De studie werd goedgekeurd door de regionale ethische commissie in Stockholm, DNR 2012/50-31.

1. Celvoorbereiding

  1. Gebruik stromale vasculaire fractie (SVF) cellen die via collagenase-vertering uit menselijk vetweefsel zijn geïsoleerd.
    OPMERKING: De celopbrengst varieert afhankelijk van de grootte van de biopsie en de weefselsamenstelling; echter, ongeveer 1,0 × 106 SVF-cellen worden doorgaans verkregen per 10 g vetweefsel.

2. X-gal kleuring en preparaten

  1. Fixeer cellen in 1 mL 2% paraformaldehyde (PFA) in een 1,5 mL microcentrifugebuis gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een wip.
  2. Centrifugeer op 600 × g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
  3. Bereid de X-gal kleuringsoplossing voor met behulp van de senescence β-Galactosidase kleurset volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Verdeel de kleuringsoplossing in 3 buisjes (elk 1 mL) en stel de pH aan naar 5, 6 en 8 met 1 M HCl en 1 M NaOH. Meet de pH met een gekalibreerde pH-meter.
  5. Voeg X-gal oplossing toe aan 0,5 × 106 cellen voor conditie en incubeer 24 uur bij 37 °C zonderCO2.
  6. Centrifugeer op 600 × g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
  7. Was cellen met PBS (pH 7), centrifugeer op 600 × g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
  8. Bereid primaire antistofoplossing (CD31 [1:200] of IgG-controle [1:333]) voor in 5% normaal donkey serum (NDS). Cellen 's nachts incuberen bij 4 °C.
  9. Was cellen 3 keer in PBST (0,1%) gedurende 10 minuten bij RT op een wip.
  10. Bereid secundaire antilichaamoplossing (anti-muis Alexa Fluor 555 [1:500]) en tarwekiemagglutinine (WGA [1:200]) in 5% NDS. Incubeer 1 uur bij RT op een skommelstoel.
  11. Centrifugeer op 600 × g gedurende 10 minuten en verwijder de secundaire antilichaamkleuringsoplossing.
  12. Was de cellen 3 keer in PBST (0,1%) gedurende 10 minuten op een wip bij RT.
  13. Centrifugeer op 600 × g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
  14. Suspendeer cellen opnieuw in de antifade mountant.
  15. Pipette de celsuspensie op microscoopglaasjes.
  16. Laat het montagemedium 's nachts uitharden bij RT om de cellen te immobiliseren.
  17. Voeg 100 μL 100% glycerol toe, leg een deklaag bovenop en sluit af met nagellak.

3. Microscopie

OPMERKING: Beeldcellen met een confocale microscoop die is geconfigureerd voor detectie van gereflecteerd licht. Het gereflecteerde lichtsignaal moet worden verzameld op of nabij de excitatiegolflengte met behulp van een door de fabrikant geleverde bundelsplitter of dichroïsche spiegelconfiguratie. Gebruik voor alle experimenten een 30× objectief met siliconenolie (numerieke apertuur 1,05).

  1. Selecteer de T90/R10 beam splitter-instelling binnen de microscoopsoftware.
  2. Gebruik 633 nm excitatie en verzamel gereflecteerd licht tussen 635–645 nm.
  3. Verkrijg het Hoechst-signaal met 405 nm excitatie.
  4. Verkrijg het WGA-signaal met 488 nm excitatie.
  5. Verkrijg het CD31-signaal met 555 nm excitatie.
  6. Stel de Z-stapgrootte in op het systeemoptimum (0,74 μm) en definieer een Z-stack op basis van het membraansignaal om het volledige celvolume vast te leggen.
  7. Verzamel beelden met identieke verwervingsinstellingen voor alle monsters. Sla bestanden op in het native microscoopformaat (bijv. .oir) zonder compressie.

4. Beeldanalyse

OPMERKING: Analyseer afbeeldingen met ImageJ en CellProfiler.

  1. Splits kanalen in ImageJ om Z-stacks voor elk kanaal te genereren (405, 488, 555, 633).
  2. Genereer opgesomde intensiteitsprojecties met de Z Project-functie en exporteer als 16-bits TIFF-bestanden.
  3. Importeer afbeeldingen in CellProfiler (versie 4.2.8) voor geautomatiseerde celsegmentatie en kwantificatie van de intensiteit van gereflecteerd licht per cel (Aanvullende Figuur 1 en Aanvullende Figuur 2).
  4. Exporteer intensiteitsmetingen naar een spreadsheet voor downstream analyse.

5. SA-β-gal scoren

  1. Definieer de drempel voor SA-β-gal positiviteit als de gemiddelde gereflecteerde lichtintensiteit van de pH 8-voorwaarde plus drie standaardafwijkingen.
  2. Classificeer cellen onder de pH 6-conditie met intensiteitswaarden boven deze drempel als SA-β-gal positief.

Resultaten

Gereflecteerd licht SA-β-gal kleuring van menselijke SVF-cellen produceerde duidelijke en reproduceerbare patronen over de drie pH-gecontroleerde omstandigheden. CD31-kleuring werd opgenomen om endotheelcellen binnen de SVF te identificeren, waardoor deze cellen van andere populaties kunnen worden onderscheiden. Hoewel slechts een klein aantal CD31-positieve cellen aanwezig was, bevestigde de marker de aanwezigheid van endotheelcellen en toonde de compatibiliteit van de methode met heterogene primaire monsters aan.

De pH 5-conditie genereerde een sterk signaal in de meeste cellen, wat overeenkomt met een hoge endogene bèta-galactosidase-activiteit bij een zure pH (Figuur 1Aa–AC). Bij pH 6, de conditie die werd gebruikt om SA-β-gal activiteit te beoordelen, was de kleuringsintensiteit verminderd ten opzichte van pH 5, en slechts een subset cellen toonde het signaal boven de achtergrond (Figuur 1Ba–BC). Deze verschuiving in zowel signaalintensiteit als frequentie is consistent met de verwachte pH-afhankelijkheid van de assay en maakt het mogelijk om cellen met behouden SA-β-galactosidase-activiteit onder suboptimale omstandigheden te identificeren. De pH 8-conditie produceerde minimaal gereflecteerd lichtsignaal, met de meeste cellen dicht bij of op achtergrondniveau (Figuur 1Ca–Cc). Deze voorwaarde werd gebruikt om de drempel voor SA-β-gal positiviteit te definiëren, aangegeven door de rode stippellijn in Figuur 1A c,Bc,Cc.

Voor kwantitatieve analyse werd de drempel voor SA-β-gal activiteit gedefinieerd als de gemiddelde gereflecteerde lichtintensiteit van de pH 8-conditie plus drie standaardafwijkingen. Cellen in de pH 6-conditie met intensiteitswaarden boven deze drempel werden geclassificeerd als SA-β-gal positief. Deze aanpak biedt een objectieve, datagedreven afkap die rekening houdt met achtergrondsignalen en de classificatie van vals-positieven minimaliseert.

Om de detectiegevoeligheid en compatibiliteit met immunocytochemie te beoordelen, werden reflecterend licht en brightfield-beeldvorming vergeleken over alle pH-condities. Bij pH 5 (Figuur 2Aa–Ad) toonde gereflecteerd licht een sterk X-gal neerslag, terwijl brightfield alleen de meest prominente afzettingen detecteerde. Bij pH 6 (Figuur 2Ba–Bd) identificeerde gereflecteerd licht SA-β-gal positieve cellen die niet betrouwbaar detecteerbaar waren door brightfield, waar het signaal zwak of diffuus leek. Bij pH 8 (Figuur 2Ca–Cd) detecteerde gereflecteerd licht minimaal signaal, wat consistent is met lage enzymatische activiteit, terwijl brightfield geen detecteerbare neerslag onthulde. Deze waarnemingen geven aan dat reflecterend lichtbeeld verbeterde detectie van X-gal neerslag biedt, vooral bij middelhoge en lage activiteitsniveaus.

De gereflecteerd licht SA-β-gal test werd ook uitgevoerd in een 96-put plaat (Aanvullende Figuur 3). Deze opstelling resulteerde in een verhoogd achtergrondsignaal door reflectie van het plastic oppervlak, waardoor het contrast tussen positieve en negatieve cellen afnam. Oppervlakte-imperfecties, zoals krassen, verhoogden de achtergrondreflectie verder (Aanvullende Figuur 3, zwarte pijlen). Daardoor was kwantitatieve analyse minder betrouwbaar dan beeldvorming op glazen dekmantels. Als een plaatformaat vereist is, worden glazen platen aanbevolen voor optimale signaaldetectie.

Samen tonen deze resultaten een duidelijke scheiding tussen de sterk positieve pH 5-conditie, het tussensignaal bij pH 6 en de minimale achtergrond bij pH 8. Dit patroon is consistent met het verwachte gedrag van de assay en ondersteunt het gebruik van reflecterlichtbeeldvorming voor de detectie van SA-β-gal activiteit in heterogene primaire celpopulaties.

figure-results-1
Figuur 1: pH-afhankelijke gereflecteerd licht SA-β-gal detectie in SVF-cellen.
WGA (Aa, Ba, Ca) en reflected light imaging (Ab, Bb, Cb) detecteren X-gal precipitaat bij pH 5, 6 en 8 condities. Het signaal is het sterkst bij pH 5, verlaagd bij pH 6 en minimaal bij pH 8. Kwantificering van de intensiteit van gereflecteerd licht (Ac, Bc, Cc) toont de verdeling van β-galactosidase-activiteit onder elke conditie. Elke stip vertegenwoordigt een enkele cel, en de rode stippellijn geeft de drempel aan die wordt gebruikt om SA-β-gal-positieve cellen te classificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Vergelijking van gereflecteerd licht en helderveld SA-β-gal detectie in SVF-cellen. Ingezoomde beelden van X-gal gekleurde SVF-cellen bij pH 5, 6 en 8 tonen WGA-kleuring (Aa, Ba, Ca), CD31-kleuring (Ab, Bb, Cb) om endotheelcellen te identificeren, reflecterend licht (Ac, Bc, Cc) om X-gal neerslag te detecteren, en bijbehorende brightfield-beelden (Ad, Bd, Cd). Reflecterlichtbeeldvorming detecteert X-gal neerslag onder omstandigheden, terwijl brightfield voornamelijk afzettingen met hogere intensiteit onthult en beperkte detectie biedt bij lagere signaalniveaus. CD31-kleuring wordt waargenomen bij zowel pH 5 als pH 6, waardoor endotheelcellen kunnen worden geïdentificeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Overzicht van de CellProfiler-pijplijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Werkstroom voor kernen en celsegmentatie. Representatieve beelden van (A) Hoechst-gekleurde kernen en (B) overeenkomstige kernsegmentatie. (C) Celsegmentatie op basis van de membraankleuring. (D) Overlay van kernen en celgrenzen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 3: Gereflecteerd licht SA-β-gal beeldvorming in een kunststof onderplaat met 96 putjes. (A) WGA-kleuring en (B) reflecterend lichtbeeld van X-gal gekleurde SVF-cellen in een standaard plastic laag met 96 putjes. Er wordt een verhoogd achtergrondsignaal waargenomen in vergelijking met beeldvorming op glas, wat overeenkomt met lichtreflectie van het plastic oppervlak, wat het contrast bij SA-β-gal detectie vermindert. Oppervlaktekrasjes (zwarte pijlen) versterken het achtergrondsignaal (B) verder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Senescence-geassocieerde β-galactosidase is een van de meest gebruikte markers voor het identificeren van senescente cellen; traditionele brightfield-detectiemethoden worden echter beperkt door een lage gevoeligheid en een hoge mate van subjectiviteit. Gereflecteerd lichtbeeldvorming van X-gal gekleurde SVF-cellen biedt een gevoeligere en reproduceerbare benadering om SA-β-galactiviteit op enkelcelniveau te meten, terwijl het compatibel blijft met fluorescentie-antilichaamkleuring. Door deze methode te optimaliseren voor SVF kan SA-β-galactiviteit worden gedetecteerd naast celspecifieke markers zoals CD31, waardoor de analyse van heterogene primaire celpopulaties mogelijk is zonder celsortering.

Verschillende technische parameters zijn cruciaal voor een betrouwbare implementatie. Nauwkeurige pH-kalibratie van de X-gal kleuringsoplossing is essentieel, omdat kleine afwijkingen de enzymatische activiteit kunnen veranderen en de signaaldetectie kunnen beïnvloeden. De pH-meter moet direct vóór gebruik met standaardbuffers (bijv. pH 4,0 en pH 7,0) worden gekalibreerd, en de pH van de kleuroplossing moet na voorbereiding worden gecontroleerd. Daarnaast moet Z-stack acquisitie het volledige celvolume omvatten, omdat onvolledige dekking leidt tot een onderschatting van de intensiteit van gereflecteerd licht. Beeldvormingsparameters, waaronder laservermogen en detectorversterking, moeten worden geoptimaliseerd om het signaal te maximaliseren zonder verzadiging en consistent blijven over de monsters.

In vergelijking met alternatieve senescentie-assays biedt reflecterend lichtbeeldvorming verschillende voordelen. Brightfield SA-β-gal detectie is afhankelijk van visuele identificatie van neerslag en heeft daarom beperkte gevoeligheid en is niet gemakkelijk compatibel met gemultiplexeerde analyse. Daarentegen detecteert reflectielichtbeeldvorming de optische dichtheid van het X-gal neerslag, terwijl de pH-afhankelijke enzymatische definitie van SA-β-gal behouden blijft. Dit maakt gelijktijdige detectie van SA-β-galactiviteit mogelijk naast fluorescentie-gebaseerde markers, waardoor veroudering kan worden beoordeeld met behulp van meerdere kenmerken binnen individuele cellen.

Ondanks deze voordelen kent de methode beperkingen. Reflecterend licht-imaging detecteert de optische dichtheid van het X-gal neerslag, maar kan dit signaal niet definitief onderscheiden van andere dichte intracellulaire structuren, waardoor pH-gecontroleerde omstandigheden essentieel zijn. De pH 8-voorwaarde biedt een basislijn voor achtergrondlicht en ondersteunt onderscheid tussen specifieke en niet-specifieke signalen. De aanpak vereist ook een confocale microscoop met geschikte reflecterlichtdetectiemogelijkheden, die mogelijk niet op alle systemen beschikbaar zijn. Daarnaast kunnen de eigenschappen van beeldoppervlakken de signaalkwaliteit beïnvloeden: plastic bodemplaten vergroten de achtergrond door reflectie en verminderen het contrast, terwijl glasoppervlakken betrouwbaardere detectie bieden.

Deze methode bouwt voort op het werk van Dedic et al., die reflecterend licht beeldvorming voor SA-β-gal detectie in volwassen adipocyten hebben vastgesteld, en breidt de benadering uit naar een breder scala aan celtypen26. Toepassing op vers geïsoleerde SVF toont aan dat de detectie van gereflecteerd licht van X-gal neerslag compatibel is met diverse primaire menselijke celpopulaties. Het vermogen om SA-β-gal detectie te combineren met afstammingsmarkers zoals CD31 maakt de analyse van gedefinieerde subpopulaties binnen heterogene weefsels verder mogelijk.

Hoewel variabiliteit tussen donoren wordt verwacht in primaire menselijke monsters, is het doel van deze studie om de technische implementatie van de methode vast te stellen in plaats van biologische variabiliteit te karakteriseren. Toekomstige toepassingen in meerdere biologische monsters of experimentele omstandigheden moeten passende statistische analyses bevatten. Daarnaast zal validatie in gevestigde senescentie-inductiemodellen en integratie met orthogonale senescentiemarkers de interpretatie van SA-β-gal-activiteit in complexe celpopulaties verder verfijnen.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflict aan.

Dankbetuigingen

Wij danken Liv Eidsmo en Keira Melican voor het bieden van toegang tot menselijke weefselbiopten, en Lena Appelsved voor de hulp bij het verwerken van monsters. Deze studie werd ondersteund door subsidies aan KLS van de Zweedse Onderzoeksraad (2022-01236), het Strategisch Onderzoeksprogramma voor Diabetes aan het Karolinska Institutet (C5471162), de Novo Nordisk Foundation (C5475033), Vallee Foundation Scholar Award (C5471234), Mark Foundation Aspire Grant (C5477023), The Swedish Cancer Society (22 2420), het Strategisch Onderzoeksprogramma voor Stamcellen en Regeneratie aan het Karolinska Institutet (C5472022) en de Knut and Alice Wallenberg Foundation (2020.0118; 2023.0536).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL tubesBioSphere72.706.200Biosphere safeseal tube 1.5 mL, 250 PC
5 mL tubesEppendorf30119401Eppendorf tubes 5.0 mL microtube
96-well plateCorning4680Corning 96-well high content ccreening microplates with film bottom
CD31 primary antibodyAbcamAb9498Anti-CD31 antibody clone JC/70A
Confocal microscope with reflected light capabilitiesEvidentFV-4000
CoverslipsEprediaBB02400500A113MNZOCoverslips 24 mm x 50 mm, #1.5 thickness (0.13-0.16 mm) 
DPBSGibco14190-136DPBS, no calcium, no magnesium
Fixation bufferSigma Aldrich1.00496.5000Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 
HClSigma-Aldrich320331-500mLHydrochloric acid (37%)
IncubatorStuartS130HHybridization oven/shaker
Microscopy slidesAvantor VWR631-1560Single-frosted slides, coloured ends
Mounting mediaInvitrogenP36984ProLong glass antifade mountant excitation/emission max 361/497 nm
Mouse IgG1 isotype controlR&D SystemsMAB002
NaOHSigma-AldrichS8045-500GSodium hydroxide ≥ 98%
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch Labs017-000-121
pH meterMeterLabR21M002 PHM210 standard pH meter 
Pipette tips (1000 µL)Biosphere70.1186.2101250µL filtered pipette tips
Pipette tips (200 µL)Corning4823200µL filtered pipette tips
SABG KitCell signaling9860SSenescence beta-galactosidase staining kit
Secondary antibody, Alexa Fluor 555InvitrogenA31570Donkey anti-mouse IgG (H+L) highly cross-adsorbed excitation/emission max
553/568 nm
Tween-20Fisher Scientific10419000Pure, Fisher chemical
Water bathRowe ScientificSWB20DStandard water bath
WGAInvitrogenW11261Wheat Germ Agglutinin (WGA) Alexa Fluor 488 conjugate: Excitation/emission max 495/519 nm

Referenties

  1. Wang, E. Senescent human fibroblasts resist programmed cell death, and failure to suppress bcl2 is involved. Cancer Res. 55 (10), 2284-2292 (1995).
  2. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nat Commun. 7 (1), 11190(2016).
  3. Jun, J. -I., Lau, L. F. The matricellular protein CCN1 induces fibroblast senescence and restricts fibrosis in cutaneous wound healing. Nat Cell Biol. 12 (7), 676-685 (2010).
  4. Krizhanovsky, V., et al. Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis. Cell. 134 (4), 657-667 (2008).
  5. Storer, M., et al. Senescence is a developmental mechanism that contributes to embryonic growth and patterning. Cell. 155 (5), 1119-1130 (2013).
  6. Muñoz-Espín, D., et al. Programmed cell senescence during mammalian embryonic development. Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).
  7. Eggert, T., et al. Distinct functions of senescence-associated immune responses in liver tumor surveillance and tumor progression. Cancer Cell. 30 (4), 533-547 (2016).
  8. Feldser, D. M., Greider, C. W. Short telomeres limit tumor progression in vivo by inducing senescence. Cancer Cell. 11 (5), 461-469 (2007).
  9. Xue, W., et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature. 445 (7128), 656-660 (2007).
  10. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nat Cell Biol. 15 (8), 978-990 (2013).
  11. Coppé, J. -P., Desprez, P. -Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol Mech Dis. 5 (1), 99-118 (2010).
  12. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. eLife. 4 (1), e12997(2015).
  13. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nat Med. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  14. Li, F., et al. FBP1 loss disrupts liver metabolism and promotes tumorigenesis through a hepatic stellate cell senescence secretome. Nat Cell Biol. 22 (6), 728-739 (2020).
  15. Yoshimoto, S., et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome. Nature. 499 (7456), 97-101 (2013).
  16. Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. J Hepatol. 58 (3), 549-556 (2013).
  17. Baboota, R. K., et al. BMP4 and Gremlin 1 regulate hepatic cell senescence during clinical progression of NAFLD/NASH. Nat Metab. 4 (8), 1007-1021 (2022).
  18. Chen, Y. -W., Harris, R. A., Hatahet, Z., Chou, K. Ablation of XP-V gene causes adipose tissue senescence and metabolic abnormalities. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), E4556-E4564 (2015).
  19. Gustafson, B., Nerstedt, A., Spinelli, R., Beguinot, F., Smith, U. Type 2 diabetes, independent of obesity and age, is characterized by senescent and dysfunctional mature human adipose cells. Diabetes. 71 (11), 2372-2383 (2022).
  20. Li, Q., et al. Obesity and hyperinsulinemia drive adipocytes to activate a cell cycle program and senesce. Nat Med. 27 (11), 1941-1953 (2021).
  21. Minamino, T., et al. A crucial role for adipose tissue p53 in the regulation of insulin resistance. Nat Med. 15 (9), 1082-1087 (2009).
  22. Shi, D., et al. Photoactivatable senolysis with single-cell resolution delays aging. Nat Aging. 3 (3), 297-312 (2023).
  23. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  24. Horwitz, J. P., et al. Substrates for cytochemical demonstration of enzyme activity:I. some substituted 3-indolyl-β-D-glycopyranosides1a. J Med Chem. 7 (5), 574-575 (1964).
  25. Lv, X., et al. Molecular engineering development of β-galactosidase-activatable fluorogenic probes for precise senescence tracking in cells, tissues and a mouse model of psoriasis. Sens Actuators B Chem. 444 (1), 138406(2025).
  26. Dedic, B., et al. Senescence detection using reflected light. Aging Cell. 23 (1), e14295(2024).
  27. Alcorta, D. A., et al. Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 (INK4a) in replicative senescence of normal human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13742-13747 (1996).
  28. Hara, E., et al. Regulation of p16CDKN2 expression and its implications for cell immortalization and senescence. Mol Cell Biol. 16 (3), 859-867 (1996).
  29. Lin, A. W., et al. Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive MEK/MAPK mitogenic signaling. Genes Dev. 12 (19), 3008-3019 (1998).
  30. Okamoto, A., et al. Mutations and altered expression of p16INK4 in human cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (23), 11045-11049 (1994).
  31. Serrano, M., Hannon, G. J., Beach, D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. Nature. 366 (6456), 704-707 (1993).
  32. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  33. Wong, H., Riabowol, K. Differential CDK-inhibitor gene expression in aging human diploid fibroblasts. Exp Gerontol. 31 (3), 311-325 (1996).
  34. Gustafson, B., Nerstedt, A., Smith, U. Reduced subcutaneous adipogenesis in human hypertrophic obesity is linked to senescent precursor cells. Nat Commun. 10 (1), 2757(2019).
  35. Barinda, A. J., et al. Endothelial progeria induces adipose tissue senescence and impairs insulin sensitivity through senescence associated secretory phenotype. Nat Commun. 11 (1), 481(2020).

Herprints en machtigingen

Tags

Cellulaire senescentievetweefselSA-beta-gal-activiteitreflectielichtmicroscopieconfocale microscopiesingle-cell-analyseimmunocytochemielineage-markers
Senescentiedetectie met behulp van gereflecteerd licht in de vetachtige stromale vaatfractie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.