Assemblage en gebruik van een plant-gnotobiotisch groeisysteem voor plant-microbe interactiestudies in granen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de samenstelling en het gebruik van een nieuw plant-gnotobiotisch groeisysteem dat is ontworpen om granen te accommoderen en gevalideerd is in tarwe en maïs. Dit plant-gnotobiotische systeem maakt gecontroleerde plant-microbenexperimenten mogelijk door steriele groeiomstandigheden, irrigatiebeheer en compatibiliteit met diverse bodemsubstraten te bieden.

Samenvatting

De ontwikkeling van microbiële landbouw-aanpassingen die consequent in het veld werken, vereist inzicht in de moleculaire mechanismen van plant-microbe interacties. Het bestuderen van deze onderliggende interactiemechanismen vereist het vermogen om planten te laten groeien onder milieugecontroleerde en gnotobiotische omstandigheden (d.w.z. alle micro-organismen die met de plant interageren zijn bekend, of dat nu kiemvrije, gedefinieerde microbiële gemeenschappen of natuurlijke gemeenschappen zijn). De momenteel beschikbare plant-gnotobiotische systemen zijn niet geschikt voor het bestuderen van grote planten van landbouwkundige belang, zoals granen. Bovendien missen de meeste van deze systemen het vermogen om irrigatie te beheren. Hier introduceren we GNOVA, een nieuw gnotobiotisch systeem dat is ontworpen om graanplanten te accommoderen die irrigatie kunnen beheren. Dit nieuwe systeem is een toegankelijk platform dat bestaat uit een 3D-geprinte basis en commercieel verkrijgbare materialen. Dit protocol biedt een stapsgewijze gids voor het samenstellen van het systeem en de opzet van het experiment. Daarnaast presenteren we een prestatievergelijking van GNOVA met een gnotobiotisch zaksysteem. GNOVA verlengde de plantengroei van twee weken in het zaksysteem tot 17 weken voor tarwe en 4 weken voor maïs. Het kiempercentage van beide gewassen steeg ook binnen de GNOVA van 66% naar 100% voor tarwe en van 75% naar 100% voor maïs. Tarwe die binnen GNOVA werd geteeld, ontwikkelde grondbewerkers, die ontbraken bij planten van dezelfde leeftijd binnen het zakkensysteem. Het verse gewicht van maïs die in de GNOVA werd geteeld, was 594% hoger dan in het zakkensysteem. Bovendien waren de scheuthoogte en wortellengte van maïs respectievelijk 89% en 57% groter binnen het GNOVA-systeem dan in de zakken. Het GNOVA-systeem breidt de gereedschapskist uit die wetenschappers beschikbaar is voor het verkennen van plant-microbiota interacties voorbij de zaailingfase in granen door meer groeiruimte en irrigatiebeheer te bieden.

Inleiding

Op microben gebaseerde landbouwbehandelingen hebben de afgelopen decennia veel belangstelling gekregen vanwege hun potentieel om de gewasproductiviteit te verbeteren door de groei van planten en hun weerstand tegen omgevingsstress te vergroten. Tegelijkertijd blijven de moleculaire werkingsmechanismen van deze biostimulanten slecht begrepen, wat kan bijdragen aan hun inconsistente resultaten over bodems, locaties en omgevingscondities ^1,2. Het bevorderen van verbeterde effectiviteit van bestaande microbengebaseerde behandelingen en de ontwikkeling van nieuwe technologieën vereist een dieper begrip van de moleculaire mechanismen van plant-microbe interactie ^3,4. Het ontleden van deze mechanismen blijft echter een uitdaging vanwege de complexiteit van natuurlijke microbiële gemeenschappen ^5,6. Om de microbiële effectoren en interacties die de voordelen van planten aandrijven te identificeren, kunnen we de complexiteit van natuurlijke systemen verminderen door gebruik te maken van synthetische microbiële gemeenschappen (SynComs) binnen groeisystemen, die de controle van de omgevingsomstandigheden en de microbiële gemeenschap mogelijk maken. Gnotobiologie, de studie van gastheren die geassocieerd zijn met gedefinieerde microbiële gemeenschappen⁷, stelt onderzoekers in staat om kiemvrije gastheren te vergelijken met die gekoloniseerd met bekende microbiële gemeenschappen, om zo microbiële functie te koppelen aan plantfenotype⁸.

Vroege gnotobiotische systemen werden gebouwd met glasreageerbuizen^{9, 10, 11, 12} en potten¹³. Sindsdien hebben we een snelle uitbreiding gezien van nieuwe systemen die zijn ontwikkeld om planten gnotobiotisch te bestuderen. De meest gebruikte systemen tegenwoordig zijn het gebruik van petrischaaltjes¹⁴, reageerbuizen ^15,16, glazen potten¹⁷, magenta doosjes¹⁸, verzegelde zakken¹⁹, hydroponics²⁰, FlowPot en GnotoPot²¹, microfluidica systemen²² en EcoFABs²³. Ondanks deze vooruitgang zijn de meeste systemen ofwel geoptimaliseerd voor imaging²² of exsudate collection^17,20 of ontworpen voor kleine modelsoorten 14,18,21. Veel zijn gesloten systemen die de irrigatiecontrole en de duur van experimenten beperken. Deze beperkingen vormen uitdagingen voor het bestuderen van grotere landbouwgewassen, zoals granen, die extra ruimte, luchtstroom en waterbeheer vereisen.

Met het besef van de noodzaak van een systeem dat grotere planten en langere studies kan accommoderen, is de EcoFAB 3.0 onlangs ontwikkeld om gnotobiotische teelt uit te breiden naar grotere planten²⁴. De EcoFAB 3.0 biedt een groter volume van wortel en kopruimte, wat de groei van Sorghum bicolor tot 4 weken ondersteunt en het mogelijk maakt exsudate te verzamelen en^{wortelbeeldvorming 24} weken mogelijk te maken. Hoewel dit nieuwe systeem een veelbelovend voorbeeld is van het uitbreiden van gnotobiotische systemen naar landbouwgewassen, blijft er behoefte aan een toegankelijk en veelzijdig platform dat gemakkelijk in laboratoria kan worden toegepast en compatibel is met een breed scala aan experimentele workflows. Om deze reden ontwikkelden we GNOVA (GNotobiotic system for Versatile plant Applications), een systeem dat is ontworpen om graangewassen onder gnotobiotische omstandigheden te accommoderen. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het assembleren en bedienen van GNOVA en demonstreren we de prestaties ten opzichte van een gnotobiotisch zaksysteem dat routinematig in ons laboratorium wordt gebruikt. Met de ontwikkeling van dit nieuwe systeem hebben we het vermogen om tarwe en maïs onder steriele omstandigheden te verbouwen verbeterd door een grotere groeiruimte en ingebouwde irrigatie te bieden in vergelijking met eerdere gesloten systemen. De prestaties van GNOVA zijn vergelijkbaar met die van de EcoFAB 3.0, waarmee het repertoire van hulpmiddelen voor het dissecten van interacties tussen planten en microbiomen in niet-model graangewassen wordt uitgebreid. Bovendien worden de veelzijdigheid en aanpassingsvermogen van plantgnotobiotica versterkt door het eenvoudige ontwerp van GNOVA, het gebruik van commercieel beschikbare materialen en beschikbare 3D-objectbestanden, waarmee onderzoekers materialen en ontwerpen kunnen aanpassen om hun onderzoeks- en budgetbehoeften aan te passen.

Protocol

OPMERKING: 3D-printbestanden voor de basis zijn te vinden in de aanvullende materialen en zijn openbaar beschikbaar in Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc). Voor snelheid en kostenefficiëntie raden we aan om in bulk te printen bij lokale commerciële 3D-printdienstverleners.

1. Samenstelling van het gnotobiotische systeem

1. Start de potmontage (voer één keer uit vóór herhaald experimenteel gebruik).
   1. Sluit de bodem van de pot door de roestvrijstalen draadgaascirkel over één uiteinde van de polycarbonaatbuis te plaatsen en de cirkel vast te zetten met de slangklem (Figuur 1A).
   2. Boor irrigatieopeningen door een irrigatieopening van 1/4 inch (6,35 mm) te creëren, 1,5 cm van de bovenrand van het open uiteinde van de polycarbonaatbuis. Boor twee 1/8 inch (3,18 mm) sleuven 3 cm van de eerste opening, met één sleuf 1 cm van de rand en de andere 2 cm van de bovenste opening.
      OPMERKING: Indien nodig kunnen extra buizenlijnen rond de bovenrand van de pot worden toegevoegd volgens dezelfde stappen.
   3. Installeer de irrigatieslang door een kort stuk siliconen buis door de opening van 1/4 inch te steken.
   4. Zet de buis vast door de kabelbinder door de twee 1/8 inch sleuven te rijgen (Figuur 1B). Steek de mannelijke luer van aansluiting 1 in de siliconen buis die buiten de pot steekt (Figuur 1C).
      OPMERKING: De slanghaak van fitting 1 moet zichtbaar zijn.
   5. Bereid spuitvaten voor door een lege spuitvat te vullen met glaswol en het uiteinde af te sluiten met een klein stukje aluminiumfolie (Figuur 1C).
   6. Bevestig een kort stuk siliconen buis aan het smeerslot van de spuitloop (Figuur 1C).
   7. Maak twee identieke spuitloopjes klaar. Bevestig een van de voorbereide spuitlopen aan de blootliggende slangbarb van fitting 1 op de buis die uit de pot steekt (Figuur 1D).
   8. Pauze: Geassembleerde potten kunnen worden opgeslagen voor later experimenteel gebruik.

Figuur 1: Potconstructie. A) Onderkant van de pot gesloten met draadgaas en slangklem. (B) Irrigatiepoort aan de bovenrand van de pot. (C) De irrigatieleiding eindigt met een zichtbare slangbarb van Fitting 1 met voorbereide spuitloop. (D) Geassembleerde pot met gesloten irrigatieleiding Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Potvoorbereiding voor het experiment (voer het uit vóór elk nieuw experiment)
   1. Bekleed de onderkant van de pot met twee voorgesneden cirkels met glasvezelbuiswikkeling (Figuur 2A).
   2. Bereid het bodemsubstraat voor door twee delen klei te mengen met één deel zand. Voeg 840 ml substraat toe aan de pot.
   3. Bedek de potten met een plastic dop en sluit vast met tape (Figuur 2B).
   4. Autoclaaf vulde potten op droogcyclus bij 121 °C gedurende 30 minuten. Laat het een nacht afkoelen met plastic doppen op de potten. Opnieuw autoclaaf op droogcyclus bij 121 °C gedurende 30 minuten. Laat het volledig afkoelen. Houd de potten afgedekt met de plastic dop.
      OPMERKING: Andere bodemsubstraten kunnen worden gebruikt, maar de hoeveelheid per pot moet vooraf worden geoptimaliseerd. GNOVA is ook getest met 800 ml 100% klei en 1 L 100% zand. Andere bodemsubstraten kunnen meer autoclavecycli of andere instellingen vereisen voor volledige sterilisatie.
      VOORZICHTIG: Voorzichtigheid is geboden bij het verwijderen van potten uit de autoclaaf, omdat het materiaal heet zal zijn en de slangklemmen kunnen losraken. Zorg ervoor dat de slangklemmen met de vingers stevig zitten zodra ze zijn afgekoeld voordat je de potten opneemt.
   5. Plaats gekoelde potmeters in de 3D-geprinte basis. Plaats de met aarde gevulde pot in de 3D-geprinte voet. Houd de pot vast bij de basis, niet bij de openingszuilen, want die zijn het meest kwetsbare deel.
   6. Steek de irrigatiebuis door een van de onderste openingen van de 3D-geprinte voet (Figuur 2C).
      OPMERKING: Autoclave de 3D-geprinte steunbasis niet, want dit kan het stuk laten smelten. Experimenten die temperaturen boven de 60 °C vereisen, kunnen een alternatief hittebestendig filament nodig hebben (zie Materiaaltabel).
   7. Houd de potten na het autoclaveren op kamertemperatuur en verwijder de plastic dop of de voorbereide spuit pas bij de definitieve experimentatie.

Figuur 2: Illustratie van de voorbereide pot. (A) Onderkant van de pot bekleed met glasvezel buiswrap. (B) De bovenkant van de pot gesloten met plastic dop. (C) Lege pot geplaatst in het definitieve 3D-geprinte basisontwerp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Glazen cilindervoorbereiding (uitvoeren vóór elk nieuw experiment)
   1. Bedek één uiteinde van de glazen cilinder met een voorgesneden DW4-filter en bevestig dit met de vinyltape (Figuur 3A).
   2. Draai de glazen cilinder om zodat deze naar het andere open uiteinde gericht is en bevestig een katoenen ring in de buis, 14 cm van de rand verwijderd. Maak de katoenen ring vast met chirurgisch tape (Figuur 3B).
   3. Sluit het onderste uiteinde van de cilinder af met een sterilisatiewrap met twee elastiekjes (Figuur 3B).
   4. Autoclaveer de voorbereide glazen cilinders op een droogcyclus bij 121 °C gedurende 30 minuten voor gebruik. Na autoclave, bewaar je de steriele glazen cilinders op kamertemperatuur totdat ze nodig zijn zonder de wrap te verwijderen.

Figuur 3: Glazen cilinderassemblage. (A) Bovenste uiteinde van de glazen cilinder gesloten met DW4 filtermateriaal en vinyltape. (B) Onderkant van de glazen cilinder, voorzien van een katoenen ring en afgesloten met sterilisatiefolie en elastiekjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Voorbereiding van irrigatiefilters (voer uit vóór elke bewatering, met uitzondering van stappen 1.4.4–1.4.6, die slechts één keer gedaan mogen worden)
   1. Assembleer de filterhouder door het PES-filtermembraan (Figuur 4A.4) tussen de filterhouder (Figuur 4A.5) en de filterschijf (Figuur 4A.3) te plaatsen.
   2. Oriënteer de gladde zijde van het filtermembraan in de richting van de uitlaat, zodat deze naar de bovenkant van de filterhouder gericht is (Figuur 4A.1).
   3. Plaats de O-ring (Figuur 4A.2) in de bovenkant van de filterhouder (Figuur 4A.1). Bevestig de filtertop aan de filterhouder. Alleen handaandraaien.
   4. Bevestig connectoren. Steek de mannelijke slok van fitting 2 in de bovenste poort van de filterhouder.
   5. Bevestig een kort stuk siliconen buis aan het uiteinde van de slang op het filter (Figuur 4B). Plaats de mannelijke slurer van een fitting 1 in het uiteinde van de andere voorbereide spuitloop uit stap 1.1.6 (Figuur 4B).
   6. Verbind het filter met de slangdraadkoppeling van de voorbereide spuitbuis.
   7. Autoclaveer de gemonteerde filters op een droogcyclus bij 121 °C gedurende 30 minuten. Draai filters strak aan zodra ze zijn afgekoeld en voor gebruik.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om alle benodigde filters voor te bereiden en te autocalaten in een gesloten polypropyleendoos. Eenmaal geautoclaveerd kunnen de irrigatiefilters steriel op kamertemperatuur worden gehouden tot gebruik, zolang de voorbereide spuit niet wordt verwijderd.

Figuur 4: Filterhouder-assemblage. (A) Gedemonteerd filterhouderonderdeel: 1. Filterhouder boven, 2. O-ring, 3. Filterschijf, 4. Filtermembraan, en 5. Filterhouder. (B) Geassembleerde filterhouder met een bijbehorende voorbereide spuitbuis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Opzet van het experiment

1. Bereid oplossingen en materialen minstens één dag voor voordat je het experiment opzet voor en steriliseer.
   1. Bereid 0,5X Murashige en Skoog plantengroeimedium voor volgens de instructies van de fabrikant. Autoclaaf medium op vloeibare cyclus bij 121 °C gedurende 30 minuten.
   2. Autoclaveer de gedemonteerde flesdopdispenser op een droogcyclus bij 121 °C gedurende 30 minuten. Autoclaaf 1 L gedeïoniseerd water in een vloeibare cyclus bij 121 °C gedurende 30 minuten.
   3. Autoclaaf glazen petrischaal, 500 mL bekers, theezeefjes en pincet op een droogcyclus op 121 °C voor 30 minuten per dag van tevoren.
      OPMERKING: Tenzij anders vermeld, moeten de volgende stappen worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap met behulp van aseptische techniek.
2. Steriliseer zaden aan de oppervlakte.
   OPMERKING: Het protocol voor de sterilisatie van oppervlaktezaden hangt af van de te gebruiken plantensoort. Het gnotobiotische systeem is getest met zowel tarwe als maïs met behulp van de volgende zaadsterilisatieprotocollen.
   VOORZICHTIG: Draag een labjas, handschoenen en beschermende brillen bij het hanteren van bleekmiddel en natriumhypochloriet, want deze chemicaliën kunnen irriterend of bijtend zijn voor huid en ogen. Ethanol is brandbaar; Gebruik geen open vlam in de buurt.
   1. Tarwezaadsterilisatie²⁵
      1. Vul twee bekers met 150 mL 95% v/v ethanol, één beker met 150 mL onverdund huishoudbleekmiddel en twee bekers met 150 mL water.
      2. Doe tarwezaden in de theezef. Roer voorzichtig de theezeef met pitten in een van de bekers met 95% v/v ethanol gedurende één minuut.
      3. Overbreng de zaden naar een nieuwe theezeef. Beweeg theezeefjes voorzichtig met zaden in bleekmiddel gedurende 10 minuten.
      4. Overbreng de zaden naar een nieuwe theezeef. Beweeg de theezeefjes voorzichtig met zaden in de andere beker met 95% v/v ethanol.
      5. Beweeg theezeefjes voorzichtig met zaden in steriel gedeïoniseerd water gedurende 30 seconden. Beweeg de theezeefjes voorzichtig met zaden in de andere beker met steriel gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten. Plaats steriele zaden in een lege steriele petrischaal.
   2. Maïszaadsterilisatie²⁶
      1. Plaats maïszaden in een 50 mL conische buis. Vul de conische buis met 70% v/v ethanol. Draai de kegelvormige buis voorzichtig om gedurende 3 minuten.
      2. Dekanteer 70% ethanol en vul de conische buis met zaden met 2% v/v natriumhypochloriet. Draai de kegelvormige buis voorzichtig om gedurende 3 minuten.
      3. Dekanteer 2% natriumhypochloriet en spoel de zaden af met steriel gedeïoniseerd water. Giet water over en spoel de zaden vier keer af met water. Plaats maïszaden in een steriele petrischaal.
3. Voeg het microbiële inoculum toe aan het medium waar van toepassing.
   OPMERKING: Er werd geen microbieel inoculum toegepast tijdens optimalisatie en steriliteitstesten van het gnotobiotische systeem.
4. Zet de flesdopdispensers in elkaar en bevestig ze aan de mediaflessen.
   OPMERKING: Omdat dit een open systeem is, raden we aan een container te hebben om het doorstroommedium op te vangen. We ontdekten dat het gebruik van een bakplaat goed werkt en makkelijke beweging mogelijk maakt, maar het vereist regelmatig leegmaken.
5. Haal de plastic dop van de pot en doe 378 mL medium in de pot.
   OPMERKING: Dit komt overeen met ongeveer 70% door water gevulde poriënruimte (WFPS), die aangepast moet worden bij gebruik van andere bodemsubstraten. Gebruik 360 ml voor klei en 358 ml voor zand.
   1. Zaai het gesteriliseerde zaad tot de juiste diepte met een steriele pincet.
   2. Zaai tarwe op een diepte van 1/2 inch en maïs op een diepte van 1,5 cm. Of zaai steriele, vooraf gekiemde zaailingen in GNOVA. Gebruik voorgekiemde zaden voor maïsgroeitests.
   3. Vervang de plastic dop bovenop de pot.

3. Eindassemblage en experimentele werking

1. Breng de pot en glazen cilinder over naar een groeikamer. Houd de glazen cilinder met de onderkant naar beneden dicht bij de pot.
2. Verwijder snel de plastic dop van de pot en de sterilisatiefolie van de glazen cilinder. Laat de glazen cilinder op de bovenkant zakken en zet hem op de rand van de 3D-geprinte voet.
   OPMERKING: Een vlam (bijvoorbeeld een draagbare bunsenbrander) kan ook naast de pot worden geplaatst tijdens de definitieve assemblage van het groeisysteem om het risico op besmetting verder te verkleinen.
   VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat er bij het werken met een open vlam geen andere brandbare materialen in de buurt zijn. Let op de positie van de vlam ten opzichte van je lichaam om brandwonden te voorkomen.
3. Kweek planten tussen 4 en 17 weken, afhankelijk van de plantensoort, met soortspecifieke groeiomstandigheden.
4. Verbouw tarwe bij dag/nachttemperaturen van 22 °C/16 °C en maïs bij 27 °C/23 °C. De fotoperiode voor beide planten is 12 uur alleen onder fluorescerende licht.

4. Irrigatie

1. Bevestig een lange siliconen buis aan de flesdopdispenser.
2. Houd de steriliteit tijdens het bewateren met een draagbare vlam. Als een draagbare vlam geen optie is, voer dan irrigatie uit met bleekmiddel om de steriliteit te behouden.
3. Irrigatie met een draagbare vlam.
   VOORZICHTIG: Werk voorzichtig rond open vlammen om lichamelijk letsel en schade aan de faciliteit te voorkomen.
   1. Plaats vlam bij de irrigatieleiding. Haal de spuitvat uit de irrigatieleiding en de filterhouder. Houd alle buisuiteinden binnen de vlamzone.
   2. Bevestig de filterhouder aan de irrigatieleiding. Verbind de twee spuitlopen met elkaar. Verbind het andere lange stuk siliconen slang van de flesbovende dispenser op de onderste poort van de filterhouder.
   3. Geef 150 mL 0,5X Murashige en Skoog media. Scheid de twee spuitlopen.
   4. Haal de siliconen slang los van de filterhouder en vervang deze door één spuitvat.
4. Irrigatie met 10% bleekmiddel
   OPMERKING: We raden aan deze irrigatiestrategie te gebruiken in grote experimenten (n > 50) om de doorvoer tijdens het bewateren te verhogen.
   VOORZICHTIG: Draag een labjas, handschoenen en beschermende bril bij het hanteren van bleekmiddel.
   1. Doe een bleekoplossing van 10% v/v in twee kleine plastic bekers en plaats deze bij de irrigatieleiding. Haal de spuitvat uit de irrigatieleiding en de filterhouder.
   2. Dompel alle slangen onder in de 10% bleekoplossing totdat ze nodig zijn. Schud de overtollige bleekoplossing eraf. Bevestig de filterhouder aan de irrigatieleiding van de pot.
   3. Verbind het andere lange siliciumbuisstuk van de flesbovende dispenser op de onderste poort van de filterhouder.
   4. Geef 150 mL 0,5X Murashige en Skoog media. Haal de siliconen buis los van de filterhouder.
      OPMERKING: Het irrigatievolume is 120 mL voor zand en 360 mL voor klei.
   5. Vervang het filter in de irrigatieleiding door een spuitvat nadat je overtollig bleekmiddel hebt geschud.
      OPMERKING: Als het irrigatievolume verandert, houd dan rekening met ongeveer 20 mL medium om de irrigatieleiding te primen.
5. Irrigeer potten één keer per week. Pas het irrigatievolume en de frequentie aan op basis van het doel van het experiment en het gebruikte bodemsubstraat. Als er 100% zand wordt gebruikt, verhoog dan de irrigatiefrequentie naar twee keer per week.

5. Oogst

OPMERKING: Dit oogstprotocol werd gevolgd tijdens het testen en optimaliseren van het gnotobiotische systeem. Het oogstprotocol moet worden aangepast om rekening te houden met specifieke onderzoeksdoelen en het volume monsters dat wordt verwerkt.

1. Bereid alle oplossingen en materialen voor en steriliseer ze minstens één dag voor de oogst.
   1. Autoclaaf 4 L gedeïoniseerd water en 500 mL 0,145 M NaCl, in een vloeistofcyclus bij 121 °C gedurende 30 minuten per dag vooraf.
   2. Autoclaafschaar en pincet op een droogcyclus bij 121 °C voor 30 minuten per dag van tevoren.
      OPMERKING: Tenzij anders vermeld, moeten de volgende stappen worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap met behulp van aseptische techniek. Als steriliteit niet nodig is voor het verzamelen van monsters, kunnen al deze stappen buiten een laminaire stromingskap worden uitgevoerd.
2. Breng de gnotobiotische systemen over van de groeikamer naar het laboratorium en plaats ze dicht bij de laminaire stromingskap.
3. Haal de glazen cilinder uit de pot en plaats de pot snel in de laminaire flow afzuigkap. Haal de pot uit de 3D-geprinte basis.
4. Houd de plant aan de basis en gooi het bodemsubstraat in een pot. Schud voorzichtig grote klonten bodembodem van de wortels af.
   OPMERKING: Bodembodembodemmonsters kunnen worden verzameld en verwerkt volgens het specifieke onderzoeksdoel in deze fase van de oogst. Het hier kort beschreven protocol werd gebruikt voor het testen van de steriliteit van bodems.
5. Bodemoogst voor bodembacterietelling²⁷ met behulp van enkelplaat-seriële verdunningsspotting²⁸.
   1. Vul de putten van een 96-put plaat met 270 μL van 0,145 M NaCl. Laat de eerste rij leeg. Voeg 1 g bodembodem toe aan een 15 mL conische buis met 9 mL 0,145 M NaCl.
   2. Vortex op maximale snelheid gedurende 5 minuten. Breng 30 μL van het monster over naar een lege put van de 96-put plaat.
   3. Bereid zeven seriële verdunningen van elk monster voor door 30 μL van elk monster te pipetten in de put eronder, die 270 μL NaCl-oplossing bevat.
   4. Meng goed door tussen elke transfer op en neer te pipetten.
   5. Bereid een seriële verdunningsspot van elke plaat voor door 10 μL van elke seriële verdunning op één enkele R2A-plaat te plateren.
   6. Kantel de platen om de druppels te verspreiden. Broed platen uit op kamertemperatuur.
   7. Tel kolonievormende eenheden (CFU) en bereken CFU/g van de bodem.
6. Scheid scheuten van wortels met een steriele schaar. Record verse schietgewicht.
7. Maak de wortels schoon door ze voorzichtig te schudden in een beker met gedeïoniseerd water. Dep de wortels droog en neem verse lading op.
   OPMERKING: Boven- en ondergronds materiaal kan op dit punt worden verzameld en verwerkt volgens de methodologie die het meest geschikt is voor de relevante downstream-analyse.

Resultaten

We ontwikkelden GNOVA, een nieuw plant-gnotobiotisch systeem, dat de steriele en gecontroleerde omgeving mogelijk maakt die nodig is om plant-microbe interacties te onderzoeken. Dit nieuwe systeem biedt 62 cm (24,4 inch) verticale scheutruimte en een pot van 1,3 L die compatibel is met verschillende bodemsubstraten. Het volledig gemonteerde systeem is ongeveer 92,4 cm hoog en 11,6 cm breed (4,57 inch). In vergelijking met andere systemen heeft het de hoogste verticale capaciteit voor scheutgroei en de op één na grootste wortelkamer (Aanvullende Tabel 1). GNOVA vereist slechts 0,0135 m^² oppervlak in de groeikamer, waardoor dit systeem compact en wendbaar is. Dit systeem kan worden gebruikt in groeikamers met een verticale vrijruimte van 1,22 m. Alle componenten van dit systeem, behalve de 3D-geprinte basis, zijn autoclavabel en compatibel met autoclaves met afmetingen van 24 inch × 24 inch × 36 inch (breedte × lengte × hoogte; 61 cm × 61 cm × 91 cm). Dit stroomlijnt de experimentele opzet door handmatige sterilisatie van individuele onderdelen te omzeilen. Daarnaast zijn de meeste onderdelen van dit systeem herbruikbaar, waardoor de kosten per experiment ongeveer 6 USD bedragen na de initiële installatiekosten van 54 USD per eenheid (Aanvullende Tabel 2). De milieuomstandigheden binnen GNOVA werden bepaald door de temperatuur en relatieve luchtvochtigheid van het systeem te volgen met een een week oude maïsplant gedurende drie dagen. De temperatuur binnen de GNOVA was gemiddeld +1,3 °C hoger dan die van de groeikamer (Aanvullende Figuur 1). De temperatuurverschillen binnen het systeem en de kamer waren groter tijdens de lichtcyclus (gemiddeld +2,5 °C) dan tijdens de donkere cyclus (gemiddeld +0,4 °C). De relatieve luchtvochtigheid binnen GNOVA was gemiddeld 63%, in tegenstelling tot 34% in de groeikamer.

Figuur 5: Renderings van het GNOVA-systeem. (A) 3D-model van het definitieve ontwerp van de steunbasis (B) Dwarsdoorsnede van 3D-model van de ondersteuningsbasis (C) Dwarsdoorsnede van het 3D-model van volledig geassembleerde GNOVA Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om steriliteit binnen het systeem te waarborgen, voerden we een proefperiode van vier weken uit met niet-geïrrigeerde en geïrrigeerde systemen zonder planten. De besmetting op de glazen cilinder werd vastgesteld door boven en onder de katoenring te bemonsteren met directe wattenuitstrijkplating. Er werd geen detecteerbare microbiele groei boven drie kolonies (d.w.z. één kolonie per derde van het bemonsterde oppervlakte) waargenomen boven de katoenring voor zowel niet-geïrrigeerde (n=4) als geïrrigeerde monsters (n=6) (Aanvullende Figuur 2A). Onder de katoenring werd groei waargenomen in één niet-geïrrigeerde replica, terwijl er geen groei werd vastgesteld in geïrrigeerde systemen (Aanvullende Figuur 2B). Dit wijst op een laag besmettingspotentieel van de glazen cilinder, aangezien microbiële groei slechts aanwezig was in beperkte replica's onder de katoenring, die niet in contact is met de plant. Bodemverontreiniging werd beoordeeld door seriële verdunningen op R2A-platen te spotten (Aanvullende figuur 2C). Er werd geen significante microbiële groei vastgesteld in beide toestanden, behalve een enkele geïrrigeerde replica met een niet-scoreerbare kolonievormende eenheidstelling uit seriële verdunningen (d.w.z. < 30 kolonies). Naast de steriliteitstests hebben we een prestatievergelijking uitgevoerd van tarwe en maïs die binnen GNOVA zijn geteeld met ons standaard gnotobiotische groeiprotocol van twee weken in een zak systeem¹⁹. Om het effect van kleine omvang en gebrek aan irrigatie op de plantprestaties te begrijpen, hebben we de groeiperiodes in de zak verlengd om overeen te komen met die binnen GNOVA. Hoewel het initiële bodemwatergehalte dat tijdens de installatie van beide systemen werd gebruikt, werd overeengestemd, ontving GNOVA wekelijkse fertigatie, terwijl de zakken dat niet deden. Voor alle vergelijkingen gebruiken we het zaksysteem als referentie, omdat dit de eerste gnotobiotische opstelling van ons lab was. Zowel tarwe als maïs bereikten 100% kieming binnen GNOVA, terwijl tarwe in het zaksysteem slechts 67% (n = 3) en maïs 75% (n = 8) behaalde (Figuur 6).

Figuur 6: Kieming van tarwe (n = 3) en maïs (n = 8) binnen GNOVA (paars) en zaksysteem (groen). De kiemuitkomst van elke replicate wordt weergegeven door punten op de y-as, hetzij als Geen kieming of Gekiemd voor elk gnotobiotisch systeem. Balken geven de kiemingssnelheid (%) van elke plantensoort binnen verschillende systemen weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Er werd ook een groeitest uitgevoerd voor tarwe en maïs om de maximale levensvatbare groeiperiode en plantprestaties binnen GNOVA te bepalen. Hoewel ons standaardprotocol slechts twee weken groei voorschrijft, hebben we de groeiperiode binnen de zakken verlengd tot meer dan twee weken voor een betere vergelijking tussen de twee systemen. Na twee weken had tarwe die binnen GNOVA (n=3) was geteeld, al Zadocks groeistadium (GS) 13 bereikt (Figuur 7A), terwijl het in de zak op GS11 bleef. In week vijf hadden de installaties GS21 bereikt binnen de GNOVA-systemen, zoals blijkt uit het uiterlijk van de frezen (Figuur 7B). Daarentegen ontbraken de frezen in de zaksystemen en bleven de installaties in GS13. Deze groeivertraging en het gebrek aan fenologische veranderingen binnen het zaksysteem leidden tot het stoppen van planten in dit systeem in week zes. Tarweplanten bleven nog vijf weken groeien binnen GNOVA, waar een toename in bladaantal en biomassa werd waargenomen (Figuur 7C). Hoewel de tarwebiomassa na 12 weken groei binnen GNOVA visueel toenam, begonnen planten ook meer chlorotische bladeren te tonen, en werd het volume van de glazen cilinder gevuld met plantbiomassa (Figuur 7D). Tarwe werd daarna nog twee weken verbouwd (Figuur 7E,F). Er was echter geen visuele toename van biomassa, waardoor de groeitest werd beëindigd na 17 weken groei. De groei van maïs werd ook binnen de GNOVA gedurende vier weken beoordeeld en vergeleken met maïs die in zakken werd geteeld (Figuur 8A,B). In dit experiment werden maïszaden gesteriliseerd en voorgekiemd voordat ze zaaiden in de GNOVA of het zaksysteem. Het verse scheut- en wortelgewicht van maïs verschilden significant tussen de twee systemen (Twee-monster t-test, p-waarde < 0,05, Aanvullende Tabel 3). Maïs die in GNOVA werd geteeld, had verse scheuten en wortels die gemiddeld respectievelijk 11,2 g en 5,7 g wogen (Figuur 8C,D). Daarentegen hadden de scheuten en wortels van maïs die in de zak werden gekweekt een vers gewicht van respectievelijk 1,29 g en 1,15 g. Over het geheel genomen is de verse biomassa van maïs die binnen GNOVA wordt geteeld met 593% toegenomen vergeleken met maïs in het zaksysteem. Bovendien waren de lengte van de scheut en wortel binnen GNOVA aanzienlijk groter dan in de zakken, respectievelijk 89% en 57% (Figuur 8E,F).

Figuur 7: Groei van tarwe binnen het GNOVA-prototype. (A) Tarwe op twee weken in Zadock's groeifase (GS) 13. (B) Vergelijking van tarwe na vijf weken groei in een zak en GNOVA. Stuurschepen zijn aanwezig binnen GNOVA (GS21) en ontbreken in de tas (GS13). (C) Toename van de biomassa van tarwe na 10 weken groei. (D) Toename van de biomassa van tarwe na 13 weken groei met het verschijnen van chlorotische bladeren. (E) Verdere toename van de biomassa van tarwe na 15 weken groei. F) Tarwebiomassa beslaat het grootste deel van het beschikbare groeivolume na 17 weken groei. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Groei van maïs binnen het GNOVA (paarse) prototype vergeleken met het zaksysteem (groen). Balken geven gemiddelde waarden aan ± standaardfout (n=4) (A) Maïs die vier weken wordt geteeld in GNOVA en zaksysteem. (B) Groottevergelijking van geoogste planten die in GNOVA worden geteeld en zaksysteem. (C) Fris schotgewicht (Mean±SE). (D) Verse wortelmassa (Mean±SE). (E) Opnamelengte (Mean±SE). F) Wortellengte (Mean±SE). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Temporele dynamiek van relatieve luchtvochtigheid en temperatuur gemeten binnen GNOVA (paars) en de groeikamer (oranje). De gegevens werden drie dagen lang met vijf minuten intervallen geregistreerd. Gegevens binnen GNOVA werden geregistreerd met een zeven weken oude maïsplant. Gebieden die in lichtblauw zijn getint, komen overeen met nachtelijke periodes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Figuur 2: Microbiële groei als gevolg van steriliteitstesten van de GNOVA zonder dat planten geen irrigatie krijgen (Controle) en met irrigatie (Geirrigeerd). (A) Glazen cilindermonsters boven de katoenen ring. (B) Glazen cilindermonsters onder de katoenen ring. (C) Enkelplaat-seriële verdunningsplatering van bodemmonsters. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Feature-vergelijking van GNOVA met andere bestaande plant-gnotobiotica (EcoFAB, magenta boxen, zakken, FlowPot, GnotoPot en EcoFAB 3.0). Systemen worden vergeleken op basis van belangrijke parameters die relevant zijn voor experimenteel ontwerp, zoals planthoogtecapaciteit, wortelvolumecapaciteit en irrigatiebeheersing. Informatie werd samengesteld uit gepubliceerde literatuur en beschikbare systeembeschrijvingen; waar gegevens niet expliciet zijn gerapporteerd, worden schattingen aangegeven. † Beste benadering wanneer niet gespecificeerd in de literatuur; ‡ Het systeem hoeft niet uit elkaar gehaald of naar laminaire stromingskap te worden verplaatst om de taak uit te voeren; * Mogelijk met aanpassingen aan het systeem; Kostencategorieën worden gedefinieerd als: laag (< USD 30 per eenheid), medium (USD 30-100 per eenheid), hoog (> USD 100 per eenheid) Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Materiaallijst (BOM) en geschatte kosten voor assemblage en exploitatie van één GNOVA-eenheid. Materialen worden gecategoriseerd als herbruikbare of eenmalige componenten, met bijbehorende eenheidskosten, benodigde hoeveelheden per systeem en totale kosten per systeem. Herbruikbare componenten dragen bij aan de initiële installatiekosten, en eenmalige materialen vertegenwoordigen de verbruikskosten per experiment. * berekend uit onderhandelde bulkprijzen voor kostenefficiënte tarieven; ** De benodigde hoeveelheid varieert met de duur van het experiment, het gebruikte bodemsubstraat en het onderzoeksdoel. Waarde voor een vier weken durend experiment met een wekelijks irrigatieschema met de klei- en zandmix; † Schatting van de hoeveelheid materiaal die per systeem nodig is; ‡ Bevat geen prijs voor voedingsoplossing of bodemsubstraat, aangezien dit varieert afhankelijk van het experimentele doel.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 3: De resulterende p-waarden van de twee-steekproef t-test voor maïsgroei maten variabelen die binnen GNOVA en het zaksysteem zijn gekweekt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het hier gepresenteerde plant-gnotobiotische systeem, GNOVA, biedt een toegankelijk en veelzijdig hulpmiddel om de interacties tussen plant en microbe in graangewassen te bestuderen. De belangrijkste kenmerken zijn onder andere een verhoogde groeicapaciteit en ingebouwde irrigatie, waardoor de groei van granen onder steriele omstandigheden verder wordt dan het zaailingstadium. De prestaties van dit systeem zijn vergelijkbaar met die van EcoFAB 3.0 en bieden een toegankelijk alternatief plant-gnotobiotisch systeem. Het systeem is opgebouwd uit commercieel verkrijgbare componenten die zijn geselecteerd op kosten, eenvoud en compatibiliteit met middelgrote autoclaven, wat de adoptie in laboratoria vergemakkelijkt. Assemblage en bediening zijn eenvoudig en vereisen geen gespecialiseerde apparatuur, waardoor de implementatiebarrières worden verminderd. GNOVA kan worden aangepast om verschillende onderzoeksdoelen te dienen dankzij de compatibiliteit met een breed scala aan bodemsubstraten, zaadsterilisatieprotocollen, microbiële inoculanten (kiemvrij, SynCom, of natuurlijke gemeenschap) en diverse downstream-analyses.

Minimale besmetting is essentieel in planten-gnotobiotische experimenten om ervoor te zorgen dat de waargenomen effecten kunnen worden toegeschreven aan microben van belang en niet aan verontreinigingen. De eenvoudige werking van GNOVA vermindert het risico op besmetting. Strikte naleving van de aseptische techniek en de volgende belangrijke aanbevelingen zorgen ervoor dat de steriliteit behouden blijft. Tijdens de experimentopbouw raden we aan om de laminaire stroomkap tussen microbiële inoculanten te desinfecteren om kruisbesmetting van behandelingen te minimaliseren. De volgorde waarin behandelingen worden toegepast kan ook kruisbesmetting verminderen. Het toepassen van kiemvrije behandelingen vóór levende microbiële behandelingen is ideaal. Ook kunnen vreemde microben via zaden worden geïntroduceerd. Protocollen voor oppervlaktezaadsterilisatie moeten daarom worden geoptimaliseerd voor elke plantensoort of zaadbron om steriliteit en kieming in balans te brengen²⁶. Sterilisatieprotocollen voor niet-model granen, zoals sorghum²⁴, gerst²⁹, switchgrass en haver²³ , kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd in GNOVA. Als sterilisatie de kieming negatief beïnvloedt, kunnen in plaats daarvan voorgekiemde zaden worden gebruikt. Irrigatie vormt een belangrijke bron van besmetting in gnotobiotische systemen. Het meest kritieke moment tijdens dit proces is het bevestigen van de filters aan de irrigatieleidingen. De buisuiteinden van de irrigatieleidingen en filters moeten tijdens dit proces steriel blijven. Vlamsterilisatie vereist behendigheid en kan arbeidsintensief zijn, vooral bij grote experimenten (n >50). Daarom wordt de alternatieve bleekmethode aanbevolen voor grote experimenten of wanneer vlamsterilisatie niet praktisch is. Het onderhouden van extra steriele filters en het beschikbaar hebben van bleekmiddel of ethanol tijdens het bewateren wordt ook aanbevolen in geval van verontreiniging tijdens het verwerken van materialen in het systeem. Daarnaast wordt het opnemen van besmettingscontrole-units (d.w.z. geen plant, geen microbebehandeling en irrigatie) sterk aanbevolen om de steriliteit te monitoren en verontreinigingen te identificeren.

Om het risico op irrigatiebesmetting te overwinnen, waren de vroegste plant-gnotobiotische systemen volledig gesloten en misten ze irrigatievermogen, wat de duur van de experimenten beperkte. Maïs werd gnotobiotisch geteeld in^{zakken 19,30}, glazen tubes en petrischaaltjes¹⁵ tussen twee en vier weken. Om water en voedingsstoffen tijdens de plantengroei aan te vullen, maakten alternatieve systemen zoals de EcoFAB²³, FlowPot en GnotoPot²¹ irrigatie mogelijk door gedeeltelijke demontage binnen laminaire stromingskappen. Dit beperkte hun grootte en compatibiliteit met grotere planten. Omdat irrigatieleidingen gemakkelijk toegankelijk zijn buiten GNOVA, is demontage niet nodig en is het systeem niet beperkt tot de laminaire stroomkapgroottes. Dit zorgt niet alleen voor een continue aanvoer van voedingsstoffen en water, maar vergroot ook de beschikbare groeiruimte. Verminderde scheutruimte kan de fotosynthetische capaciteit verminderen en bijdragen aan een stunt^{van 24}, en beperking van het wortelvolume kan leiden tot wortelbinding en verminderde water- en voedingsopname³¹. De combinatie van kleine groeiruimte en gebrek aan irrigatie in het zaksysteem kan de verminderde biomassa en het gebrek aan fenologische progressie van maïs en tarwe verklaren in vergelijking met het GNOVA-systeem. Dit nieuwe systeem maakte gnotobiotische groei van maïs mogelijk voor een duur vergelijkbaar met die van sorghum in EcoFAB 3.0²⁴. Bovendien overtreft het de gnotobiotische groei van tarwe gedurende vier weken in een hydroponisch systeem (20) in een meer representatief bodemsysteem. Naast fysieke beperkingen vertrouwen gnotobiotische systemen vaak op beperkte luchtstroom om steriliteit te behouden. Beperkte luchtstroom kan leiden tot hogere temperatuur en luchtvochtigheid, evenals lagere gasuitwisselingssnelheden, wat de fysiologie van planten kan beïnvloeden^. Verbeterde groei is gerapporteerd in systemen met een verbeterde luchtstroom, zoals magenta dozen uitgerust met HEPA-filters³³ die vergelijkbaar werken als het DW4-filter dat in GNOVA wordt gebruikt. Evenzo vertoonde EcoFAB 3.0 verhoogde temperatuur en relatieve luchtvochtigheid, maar werd nog steeds beschouwd als een robuust platform voor gnotobiotische groei van sorghum²⁴. Dit suggereert dat hoewel fysieke en omgevingsbeperkingen blijven bestaan binnen gnotobiotische systemen, de hier gepresenteerde vooruitgang in systeemontwerp nog steeds verbeterde omstandigheden biedt die de gnotobiotische groei van granen effectiever ondersteunen.

Eenvoudige aanpassing is een andere belangrijke eigenschap van GNOVA. De modulariteit van het ontwerp stelt gebruikers in staat om individuele onderdelen aan te passen die beter aansluiten bij hun onderzoeksbehoeften en budget. Dit systeem is compatibel met elk bodemsubstraat, inclusief natuurlijke bodems. Aanpassingen aan het opzetvolume, concentratie van nutriëntenoplossing en irrigatievolume en -frequentie moeten gebaseerd zijn op de fysisch-chemische eigenschappen van de bodem, aangezien deze direct invloed hebben op de beschikbaarheid en distributie van nutriënten en water³⁴. Droogte kan worden veroorzaakt door het gewicht van het gehele GNOVA-systeem te monitoren en de bodemwaterinhoud gravimetrisch^{te bepalen 35}. Worteluitlaatgassen kunnen destructief worden verzameld door geoogste planten uit te broeden in ultrazuiver water³⁶ of door het systeem door te spoelen om niet-steriele uitspoelingen^te verkrijgen. Als steriele exsudaten nodig zijn, kunnen de pot en de 3D-geprinte ondersteuningsbasis van GNOVA worden aangepast om een ingebouwde exsudateverzamelfunctie te bevatten, vergelijkbaar met die in het ontwerp van EcoFAB 3.0²⁴. Wetenschappers die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van prioriteitseffecten³⁸ op de assemblage van microbiële gemeenschappen kunnen extra irrigatieleidingen rond de pot aanleggen. Dit maakt latere toepassingen van microbiële inoculanten mogelijk, terwijl de steriliteit van de hoofdirrigatieleiding behouden blijft. Omgevingsomstandigheden kunnen worden gemonitord door gedesinfecteerde draadloze temperatuur- en relatieve luchtvochtigheidssensoren binnen GNOVA te plaatsen. Als alternatief zou het vervangen van de glazen cilinder door een polycarbonaatkamer en het boren van bemonsteringspoorten²⁴ het mogelijk maken om de omgeving te meten en gassen te bemonsteren. Dit zou de kwantificering van gassen en vluchtige verbindingen, zoals_{CO2, O2} en ethyleen, mogelijk maken, met het potentieel om de plantprestaties te beïnvloeden³³. De luchtstroom naar het systeem kan ook worden verhoogd door de katoenen ring in de glazen cilinder te verwijderen. Echter, elk van deze aanpassingen kan het risico op besmetting verhogen en is nog niet gevalideerd of geoptimaliseerd binnen GNOVA.

Ondanks de voordelen en veelzijdigheid van GNOVA moeten er enkele beperkingen worden overwogen. Het moet worden opgemerkt dat dit systeem het beste geschikt is voor gebruik in gecontroleerde groeikamers, omdat ongecontroleerde omstandigheden in de kas of het veld de prestaties kunnen beïnvloeden. Hoewel tarwe 17 weken binnen het systeem kon groeien, werden er rond 12 weken groeitijd tekenen van stress waargenomen. Daarom mag tarwe niet langer dan 12 weken worden verbouwd. Bovendien werd het behoud van steriliteit alleen bevestigd door vier wekelijkse irrigatie-evenementen over een groeiperiode van vier weken; Langere experimenten brengen een verhoogd risico op besmetting met zich mee. Hoewel GNOVA een verhoogde wortelvolumecapaciteit heeft, is wortelrestrictie nog steeds mogelijk, en een temporele beoordeling van wortelmorfologie kan helpen om optimale groeiduur te bepalen die wortelbinding minimaliseert. Daarnaast kunnen sommige aanpassingen aan het systeem, zoals het vervangen van de glazen cilinder door een polycarbonaatcilinder, de installatiekosten verhogen tot meer dan 100 USD per eenheid. Momenteel staat GNOVA alleen einddestructieve bemonstering toe, wat de arbeids- en replicatiebehoefte verhoogt voor temporele studies van microbiële dynamica, exudatiepatronen of steriliteitsmonitoring. Tot slot is het behouden van steriliteit tijdens de opstelling, irrigatie en oogst tijdrovend, en zelfs vereenvoudigde systemen zoals GNOVA vereisen toegewijde inspanning, wat de totale operationele kosten verhoogt. Gezamenlijk moeten deze beperkingen worden meegenomen bij het invoeren van dit systeem. Bovendien moeten omgevingsbeperkingen veroorzaakt door gnotobiotische groei worden meegenomen bij het plannen van experimenten en het interpreteren van resultaten, omdat deze de fysiologie van planten en daarmee het bijbehorende microbioom kunnen beïnvloeden.

GNOVA biedt een veelzijdig gnotobiotisch platform dat compatibel is met graangewassen. Het systeem maakt het mogelijk om vrijwel intacte wortelsystemen terug te vinden die geschikt zijn voor wortelarchitectuuranalysetools zoals RhizoVision Explorer³⁹ en ARIA⁴⁰, waardoor de wortelmorfologie kan worden karakteriseerd als reactie op diverse microbiële inoculanten en omgevingsomstandigheden. In combinatie met SynComs en multi-omics-analyses faciliteert GNOVA de identificatie van mechanistische verbanden tussen microbiële effectoren en plantreacties. Grotere SynComs (>100 leden) gecombineerd met metagenomische ^analyse 41,42,43 kunnen worden gebruikt om co-occurrence patronen te onderzoeken en microben van ecologisch belang te identificeren onder verschillende omstandigheden ^5,44. Daarentegen maken kleinere SynComs (<50 stammen) in combinatie met metatranscriptomic^45,46, metaproteomic 19,47,48 en metabolomics 49,50,51 een gedetailleerde karakterisering van functionele respons bij zowel planten als microben^{mogelijk 44}. Samen positioneren deze capaciteiten GNOVA als een waardevol instrument voor het identificeren van belangrijke microbiële eigenschappen die de ontwikkeling van nieuwe bioinoculanten kunnen versnellen die de duurzaamheid van landbouwsystemen verbeteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Powerconnect snoerloze boormachine & 100-delige set	Black+Decker	BDC120VA100	1/4" en 1/8" boorkopjes nodig.
Vinyl tape, geel, 1" breed x 36 meter	3M	471	Verbruiksartikel
Sterling rubberbanden maat #32  (2 rubberbanden per systeem)	Amazon	B001I1QO00	Verbruiksartikel.
Tarwezaad			Cultivar gebruikt in dit experiment: Catawba
Glasvezel pijpwikkelisolatie, 3 " breed x 1/2 " dik  (2 voorgesneden cirkels per systeem)	Lowe's	28930	Snijden in 2 7/8 " (7.3 cm) diam cirkels. Verbruiksartikel. Voor hoogwaardige productie van cirkels rolt u de wikkelisolatie uit en gebruikt u de open rand van de pot om de cirkel te snijden door de pot boven de isolatiewikkel te plaatsen en druk en draai toe te passen.
DW4 Filter media, Voorgesneden tot 15" x 75 meter  (1 gesneden cirkel per systeem)	Class Biological Clean, Ltd	NA	Snijden in 6.3 " (16.02 cm) diam cirkels. CBC heeft andere voorgesneden of standaardrolmaten die indien gewenst kunnen worden gekocht.  Verbruiksartikel. knip een sjabloon van de cirkel in karton en gebruik deze om cirkels door het gebied van de DW4-media te tekenen en met een schaar te snijden.
Siliconen buis, Versilon SPX-50 Hoogsterkte, 1/8" ID x 1/4" OD x 1/16" wanddikte	Saint-Gobain	ABX00007	Snijden in twee lange stukken ( 16" // 40.64 cm) en drie korte stukken (2.5" // 6.35 cm)
Natriumhypochloriet 5% beschikbaar chloor in waterige oplossing	VWR	JT9416-1	Verdunnen tot 2% v/v en gebruiken voor maïs sterilisatie protocol
Murashige & Skoog medium, micro en macro elementen. 25 L	Research Products International	M10200-25.0	Verdund tot 0.5x sterkte
Ethanol, 100%, Deacon Labs	Fisher scientific	04-355-451	Verdund tot 95% v/v
Spuit 3 mL, luer lock ongesteriliseerd  (2 per systeem)	Fisher scientific	14-817-117	Werp de plunjer weg en bewaar alleen de cilinder, vul met glaswol en dek af met folie.
Glazen bekers, 250 mL	VWR	470191-150	Vijf zijn nodig voor sterilisatie van tarwezaad
Maïszaad			Genotype gebruikt in dit experiment: Mexico 21–22 B73XMo17
Aluminium bakplaat 18" x 26"	Amazon	B01FIK54LQ	Zorg ervoor dat het past op de afmetingen van uw stroomkast
Natriumchloride	Fisher scientific	BP358-1	Bereid 0.145 M oplossing.
3D geprinte basis, polymelkzuur (PLA) filament gebruikt (1 per systeem)	Protolabs	NA	Afdrukken en bewerkbare bestanden zijn te vinden in aanvullende materialen. Beschikbare bestanden op Dryad.org DOI https://doi.org/10.5061/dryad.f7m0cfzbc. AUTOCLAVE NIET als PLA werd gebruikt als filament om de basis te produceren. PLA smelt boven 150 °C en kan vervormd raken boven 60 °C. Het wordt aanbevolen dat de integriteit van de PLA 3D geprinte basis wordt getest als deze bij temperaturen boven 40 °C wordt gebruikt. Voor materialen met hogere hittebestendigheid zoals PETG (Polyethyleen tereftalaat Glycol) of PC (polycarbonaat) kan in plaats daarvan worden gebruikt; dit zal de kosten van het onderdeel verhogen en mogelijk nog steeds niet autoclaveerbaar zijn. 3D-printing van de basisprototypen werd voltooid in een persoonlijke printer met bouwvolumes van 256 × 256 × 256 mm (lengte × breedte × hoogte). Voor snelheid en kostenefficiëntie raden we aan om in bulk te printen bij lokale commerciële 3D-printserviceproviders.
Mannelijke luer naar slangbarb fitting 1/8 " ID, dierlijk afgeleide-vrije polypropelene  (2 per systeem)	Cole-Parmer	EW-50114-69	Refereert als fitting 1 in het protocol
Mannelijke slip luer naar slangbarb fitting 1/8 " ID, dierlijk afgeleide-vrije polypropyleen  (1 per systeem)	Cole-Parmer	EW-50114-63	Refereert als fitting 2 in het protocol
201 Roestvrij staal wormwiel slangklemmen, 1 1/2" -3 1/2" klemmotie (1 per systeem)	Grainger	5CZF2	Refereert als slangklemmen in protocol
Airstream Gen 3 Laminaire stromingskast met eenvoudige schakelaar, afmetingen 24 1/4" x 47 " x 28 1/4 "	ESCO Lifesciences	2120707	Refereert als laminaire stromingskap in protocol. Elke laminaire stromingskap met vergelijkbare afmetingen werkt. Aanpassingen kunnen nodig zijn in kleinere stromingskappen.
Speelzand, Quikrete Premium. 50 lb	The Home Depot	1001709466	Refereert als zand in protocol
304 Roestvrij staal geweven draad, 120 maas (1 per systeem)	Amazon	B09KRS5F7T	Refereert als roestvrij stalen draadgaas in artikel. Snijd in 4.7" (11.9 cm) diameter cirkels. Voor hoge doorvoer of cirkelproductie, knip een sjabloon van de cirkel in karton en gebruik deze om cirkels door het gebied van het geweven gaas van het geweven gaas te tekenen en met een schaar te snijden.
Klei (