Collagenase-injecties combineren met door inspanning veroorzaakte mechanische overbelasting: een muismodel dat overbelasting simuleert stressblessure Knieartrose

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de oprichting van een muismodel van door overbelasting veroorzaakte stress-geïnduceerde knieartrose door intra-articulaire collagenase-injecties te combineren met door inspanning veroorzaakte overbelasting, waarmee een minimaal invasief platform wordt geboden voor het onderzoeken van degeneratieve pathogenese.

Samenvatting

Knieartrose (KOA) is een multifactoriele degeneratieve gewrichtsaandoening die wordt veroorzaakt door de complexe wisselwerking van biologische weefselafbraak en aanhoudende mechanische overbelasting. conventionele chirurgische diermodellen veroorzaken vaak trigger-posttraumatische gewrichtsvernietiging, waardoor de geleidelijke en cumulatieve pathogenese van de degeneratieve KOA bij mensen niet nauwkeurig wordt nagebootst. Om deze translationele kloof te overbruggen, stelt de huidige studie een nieuw en reproduceerbaar muismodel op dat overbelastingstress-geïnduceerde KOA simuleert door milde enzymatische kraakbeendegradatie te combineren met aanhoudende mechanische belasting. Specifiek werden gestandaardiseerde intra-articulaire injecties van type II collagenase gecombineerd met dagelijkse mechanische overbelasting via een strikt gekalibreerde rotator-type vermoeidheidsapparaat gedurende een periode van vier weken. De effectiviteit van deze dual-factor interventie werd gevalideerd met behulp van uitgebreide gedrags-, histologische en moleculaire analyses. Geautomatiseerde loopanalyse toonde ernstige bewegingsproblemen aan in de gecombineerde groep. Deze werden gekenmerkt door aanzienlijke verminderingen in paslengte, pasbreedte en pootoppervlak in de piekstand. Histomorfologische evaluaties met safranine O-fast groene kleuring bevestigden deze functionele tekorten, met progressieve kraakbeenstructurele schade, oppervlaktedefecten en significant verhoogde Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-scores die trouw de pathologische kenmerken van vroege tot middenstadium menselijke KOA weerspiegelen. Bovendien toonden immunohistochemische evaluaties een duidelijke upregulatie van het mechanosensitive kanaal Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) en gelijktijdige reductie van het cruciale matrixeiwit Collagen Type II Alpha 1 (COL2A1) in gewrichtschondrocyten. Door lokale gewrichtsinstabiliteit te integreren met gecontroleerde mechanische stress, voorkomt deze minimaal invasieve strategie het acute trauma dat geassocieerd is met chirurgische modellen. Dit protocol stelt een klinisch relevant experimenteel platform op voor het volgen van dynamische moleculaire mechanismen, het evalueren van chronische pijnfenotypes en het testen van langdurige therapeutische interventies voor artrose in een vroeg stadium.

Inleiding

Artrose (OA) is een multifactoriele degeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door pijn, zwelling, stijfheid en verminderde functie, en ontstaat door factoren zoals obesitas, mechanische belasting en trauma¹. Knieartrose (KOA) komt zeer vaak voor en komt steeds vaker voor naarmate je ouder wordt, maar klinische onderzoeken zijn vaak beperkt in omvang vanwege diverse klinische manifestaties. Daarom vereist de ontwikkeling van effectieve behandelingen geschikte diermodellen². Gezien de intrinsieke heterogeniteit van OA bestaat er geen universeel geaccepteerd "goudstandaard"-model, waardoor onderzoekers specifieke modellen moeten identificeren die aansluiten bij hun wetenschappelijke onderzoek.

KOA wordt momenteel in de moderne geneeskunde gekarakteriseerd als een aandoening waarbij mechanische en biologische factoren op het gewrichtskraakbeen en het perichondrale weefsel samenwerken. Het gevolg van deze ingewikkelde wisselwerking is voornamelijk de progressieve achteruitgang van het gewrichtskraakbeen en de omliggende matrix³. Mechanische stress dient als een cruciaal transductiesignaal dat verschillende fysiologische en pathologische processen binnen gewrichtscellen en weefsels bestuurt⁴. Het in een gezonde staat houden van het gewrichtskraakbeen vereiste een passende mechanische belasting binnen het fysiologische bereik. Omgekeerd leidt overmatige belastingsoverbelasting vaak tot de degeneratie van kraakbeen en het daaropvolgende ontstaan van KOA⁵. Spontane modellen worden belemmerd door aanzienlijke tijds- en economische investeringen⁶, terwijl chirurgisch geïnduceerde modellen een destructieve benadering gebruiken die voornamelijk midden- tot late stadium KOA vertegenwoordigt, afwijkend van natuurlijke degeneratieve progressie ^7,8. Omgekeerd richten chemisch geïnduceerde modellen zich op de collageenmatrix, maar slagen ze er niet in de uitgebreide veranderingen van menselijke degeneratieve OA vast te leggen wanneer ze zonder mechanische stress⁹ worden gebruikt. Door enzymatische afbraak te combineren met mechanische overbelasting wordt deze hiaten aangepakt door de geleidelijke pathogenese van overbelasting en stressschade nauwkeuriger te reconsceneren. Het doel van deze studie is het opzetten en valideren van een nieuw muismodel van KOA door intra-articulaire type II collagenase-injecties te combineren met overbelasting met behulp van een roterend wielvermoeidheidsapparaat.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Experimenten werden uitgevoerd onder een projectvergunning (nr.: PZSHUTCM201016022) verleend door het Experimenteel Dierencentrum van de Shanghai Universiteit voor Traditionele Chinese Geneeskunde Ethiek, in overeenstemming met het National Research Council (VS) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Protocol voor de productie van diermodellen

1. Verdeel willekeurig 32 C57BL/6 muizen van 10 weken oud in vier groepen: controle, collagenase, overmatige inspanning en collagenase + overmatige inspanning.
   1. Acklimatiseer alle muizen een week onder standaard voeder- en huisvestingsomstandigheden voordat de modelleringsprocedures worden gestart.
2. Induceer de diermodellen over een periode van 4 weken volgens de toegewezen experimentele groepen.
   1. Geef type II collagenase via intra-articulaire injectie aan de muizen in de collagenasegroep.
   2. Laat de muizen in de groep met veel oefening trainen met een roterend wiel.
   3. Pas zowel de intra-articulaire collagenase-injectie als de roterende wieltraining toe op de muizen in de groep collagenase + overmatige oefening.
   4. Houd exact dezelfde trainingsfrequentie en -duur aan in alle relevante trainingsgroepen.

2. Type II collagenase intra-articulaire injectieprotocol

1. Anesthesie
   1. Induceer anesthesie met isoflurane toegediend via een gekalibreerde gasanesthesiemachine. Voer snelle inductie uit bij een concentratie van 2%–3% isofluran.
   2. Houd de anesthesie op 1,5%–2% isofluran. Zorg voor de juiste werking van het anesthesie-opvangsysteem om beroepsmatige blootstelling te voorkomen.
   3. Monitor de ademhalingsfrequentie en reflexen van de muis continu gedurende de procedure.
2. Huidvoorbereiding
   1. Breng ontharingscrème aan op het gebied rondom het linker kniegewricht. Verwijder het haar volledig met een schraper.
   2. Maak de blootgestelde huid grondig schoon. Houd aseptische omstandigheden gedurende de hele voorbereiding.
3. Type II collagenase-bereiding
   1. Breng het type II collagenasepoeder in evenwicht tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten in een steriele bioveiligheidskast. Gebruik steriele fosfaatgevulde zoutoplossing (PBS, pH 7,2–7,4) als exclusief oplosmiddel en buffer voor het oplosproces.
   2. Weeg precies de benodigde massa collagenasepoeder met behulp van een analyseweegschaal. Voeg langzaam het steriele PBS toe aan het poeder om een uiteindelijke werkconcentratie van 0,04 U/μL te bereiken.
   3. Meng de oplossing voorzichtig door het mengsel op en neer te pipetteren totdat het helder is en vrij van zichtbare deeltjes. Vermijd tijdens deze stap gewelddadige vortexvorming om verlies van enzymatische activiteit te voorkomen.
   4. Centrifugeer de bereide 0,04 U/μL-oplossing bij 1.000 tpm gedurende 5 minuten bij 4 °C. Dit verwijdert onopgeloste microdeeltjes en voorkomt een verstopping van de naald tijdens de volgende injectie.
   5. Aspiraat het supernatant in steriele buizen en bewaar deze in een ijsbad van 4 °C voor direct gebruik. Bereid de oplossing vers voor elke sessie om maximale enzymatische activiteit te garanderen.
4. Intra-articulaire injectie
   1. Pak de dorsale huid van de muis vast met de duim en wijsvinger van de niet-dominante hand. Zet beide onderpoten vast met de ring- en kleine vingers om de kniegewrichten op natuurlijke wijze te strekken en het injectiegebied volledig bloot te leggen.
   2. Houd een 10 μL microspuit vast die is uitgerust met een 30 G naald. Steek de naald parallel aan het huidoppervlak in de oppervlakkige huidlaag voor ongeveer 0,2 cm bij het ingangspunt.
   3. Pas de richting van de naald langzaam aan naar een loodrechte oriëntatie ten opzichte van de huid wanneer de weefselweerstand afneemt.
   4. Blijf de naald ongeveer 0,3–0,5 cm verder bewegen totdat een verlies van weerstand wijst op binnenkomst in de gewrichtsholte. Trek de spuitzuiger langzaam terug om te bevestigen dat er geen bloedreflux is.
   5. Injecteer 5 μL van de type II collagenase-oplossing (concentratie: 0,04 U/μL) in de gewrichtsholte met constante snelheid¹⁰.
   6. Houd de naaldpositie direct na de injectie aan. Druk voorzichtig op de huid rondom de injectieplaats gedurende 10–15 seconden.
   7. Trek de naald langzaam terug. Druk het inlaatpunt zachtjes in met een steriel gaas gedurende 30 seconden om lekkage van geneesmiddelen te voorkomen.
   8. Plaats de muis in een warme en droge kooi thuis. Laat het dier natuurlijk herstellen van de narcose, wat meestal 5–10 minuten duurt.
   9. Hervat de standaard huisvesting en voeromstandigheden nadat de muis volledig is hersteld.
   10. Voer deze intra-articulaire injecties twee keer per week uit met een interval van 3–4 dagen tussen de injecties, exclusief tijdens de 4-weekse modelleringsperiode (na de initiële acclimatisatie van 1 week).
   11. Verwijder alle scherpe voorwerpen onmiddellijk in goedgekeurde biohazard-containers.
       OPMERKING: Zorg ervoor dat getraind personeel alle injecties uitvoert om gewrichtsletsel en experimentele variabiliteit te minimaliseren.

3. Roterend Rad-geïnduceerd Overbelastingprotocol

1. Apparatuurvoorbereiding en veiligheidscontrole
   1. Stel de snelheid van het rotatortype vermoeidheidsapparaat in op 12 rpm (ongeveer 0,063 m/s) en de duur op 2 uur per sessie.
   2. Zet de elektrische stimulatiemodule aan. Bevestig dat de huidige uitgang binnen het vooraf ingestelde veilige bereik van 0,1–0,3 mA ligt. Verhoog de stroomintensiteit niet handmatig.
      VOORZICHTIG: Gebruik de elektrische stimulatiemodule uitsluitend om de muizen terug naar het wiel te leiden, niet als een bestraffende prikkel. Controleer de bedrading van het apparaat op schade en zorg voor goed contact met elektroden voordat u het in gebruik brengt, om kortsluitingen en elektrische schokken te voorkomen.
2. Acclimatisatietraining
   1. Zorg ervoor dat de roterende wielkamers van het vermoeiingsapparaat schoon, droog en vrij van vuil zijn. Deactiveer de elektrische stimulatie-elektroden bij de wielingang om eventuele stimulatiegerelateerde stress te elimineren.
   2. Behandel elke muis voorzichtig bij de basis van de staart of schep ze met steriel zacht weefsel. Plaats muizen individueel in het centrale deel van het loopvlak van het roterende wiel.
   3. Plaats de muis in een natuurlijke viervoetige staande houding op het horizontale loopoppervlak. Oriënteer het lichaam parallel aan de centrale rotatieas van het wiel met de voorpoten naar voren en de achterpoten iets naar achteren.
   4. Gebruik een tijdelijke, niet-beperkende zachte barrière om te voorkomen dat de muis de smalle elektrodezone binnenkomt tijdens de eerste 2 minuten. Verwijder na deze periode de barrière zodat de muis vrij de hele kamer kan verkennen.
   5. Laat de muizen de eerste 3 dagen dagelijks 10 minuten in het stationaire apparaat. Start tijdens deze periode geen rotatie van het wiel en start geen elektrische stimulatie.
   6. Houd de muis in de gaten op tekenen van ernstige stress, zoals aanhoudend bevriezen of overmatig opzetten. Verplaats de muis voorzichtig naar het centrale wielgebied als deze abnormaal gedrag vertoont om een natuurlijke houding te herstellen.
   7. Start het wiel op een snelheid van 5 rpm gedurende een duur van 30 minuten op dag 4. Deze stap laat de muizen wennen aan het bewegingsritme van het apparaat zonder gebruik te maken van elektrische aanwijzingen.
   8. Leid de muizen handmatig terug naar het midden van het wiel als ze vallen of stoppen tijdens de ritmische aanpassingsfase. Zorg ervoor dat de elektrische stimulatie gedurende de gehele 4-daagse acclimatisatieperiode uitgeschakeld blijft.
      VOORZICHTIG: Vermijd het gebruik van elektrische stimulatie tijdens de acclimatisatiefase om angst-geïnduceerde stressreacties te voorkomen en toekomstige trainingsnaleving te waarborgen.
3. Formele uitvoering van de oefening
   1. Geef de formele training elke dag op een vast tijdstip (bijv. 9:00–11:00 uur). Draag geïsoleerde handschoenen om de muizen in het rotator-achtige vermoeidheidsapparaat te plaatsen.
   2. Sluit de deur van het apparaat. Start de vooraf ingestelde parameters van 12 rpm (~0,063 m/s) voor een maximale duur van 2 uur per sessie (zie Figuur 1).
      VOORZICHTIG: Houd de muizen continu in de gaten tijdens de training. Pauzeer de training van 5 minuten als een muis continu valt (meer dan 3 keer binnen 1 minuut) om ernstige uitputting en stressgerelateerde blessures te voorkomen.
4. Bepaling en stimulatie van het eindpunt van vermoeidheid
   1. Houd de muizen continu in de gaten om hun vermoeidheidstoestand te evalueren. Beëindig de trainingssessie vroegtijdig, zonder de volledige duur van 2 uur te forceren, als een muis aan ten minste twee van de vier specifieke vermoeidheidscriteria voldoet om overstress te voorkomen.
   2. Definieer criterium 1 als het onvermogen om langer dan 5 seconden op het rijwiel te blijven staan voordat je valt. Definieer criterium 2 als een significant verhoogde valfrequentie van 3 of meer keren binnen een periode van 1 minuut.
   3. Definieer criterium 3 als het ontbreken van een vrijwillige intentie om terug te keren naar het wiel, waarbij de muis onbeweeglijk blijft of slechts kort beweegt ondanks elektrische stimulatie.
   4. Definieer criterium 4 als de presentatie van abnormale locomotorische houdingen. Let op duidelijke tekenen zoals slepende ledematen of een wankelende gang.
   5. Laat het apparaat automatisch een milde elektrische stimulatie activeren wanneer een muis naar de ingang van de spinner valt. Zorg ervoor dat de elektrische stimulatie onmiddellijk stopt zodra de muis terugkeert naar het^{wiel 11}.
      VOORZICHTIG: Beëindig de training onmiddellijk als de muis abnormale aandoeningen vertoont zoals stuiptrekkingen of dyspneu. Verwijder de muis van het apparaat en bied indien nodig symptomatische behandeling toe.
5. Post-training verwerking en frequentie
   1. Zet de stroom van het apparaat uit nadat de training is afgelopen. Draag geïsoleerde handschoenen om de muizen te verwijderen en ze terug te brengen naar hun eigen kooien.
   2. Geef de muizen voldoende drinkwater. Observeer de dieren op abnormale activiteit, mentale toestand of ledemaatproblemen (bijv. claudicatio of spiertrillingen).
   3. Noteer eventuele afwijkingen en zorg tijdig voor behandeling.
   4. Houd deze trainingsfrequentie aan van één keer per dag, 2 uur per sessie, gedurende 4 opeenvolgende weken. Houd de trainingsparameters en veiligheidsmonitoring gedurende de hele periode consistent.
      OPMERKING: Controleer vóór elke dagelijkse trainingssessie of het vermoeidheidsapparaat en de elektrische stimulatiemodule goed functioneren om een consistente stimulatieintensiteit te garanderen.

4. Gait-analyse

1. Systeemoverzicht
   1. Voer de gangopname en -analyse uit met behulp van een geautomatiseerd gangbeeldvormingssysteem.
   2. Voer alle loopprocedures uit op 32 C57BL/6 muizen van 10 weken na de 4 weken durende modelleerperiode.
   3. Plaats de hogesnelheidscamera onder de transparante loopbandband om ventrale beelden tijdens het voortbewegen vast te leggen.
2. Acclimatisatie en opstelling
   1. Wennen alle muizen aan het loopbandapparaat voordat je formele gegevens verzamelt om stress te minimaliseren.
   2. Stel de loopbandsnelheid in op 20 cm/s om het fysiologische looptempo van de muizen te volgen.
   3. Registreer drie onafhankelijke valide proeven per muis met een rustinterval van 2 minuten tussen de proeven.
3. Procesopname en Stride Selectie
   1. Laat de muis tijdens elke proef gedurende een verwervingsperiode van 60 seconden continu lopen.
   2. Voer een vervangende proef uit als een opname ongeldig is door "bevriezen", springen of draaien.
   3. Start gegevensverzameling pas nadat de muis een stabiele, consistente voortbeweging heeft bereikt gedurende minstens 10 seconden.
   4. Selecteer minimaal 4 opeenvolgende volledige stappen uit elke 60-seconden trial voor analyse.
   5. Zorg ervoor dat twee onafhankelijke blinde waarnemers de stride-selectie uitvoeren om subjectieve bias te elimineren.
   6. Controleer of de muis een natuurlijke viervoetige houding aanneemt zonder te springen of plotselinge snelheidsschommelingen.
   7. Controleer of de pas zowel een gewichtshoudingsfase als een voorwaartse voortstuwingsswingfase bevat.
   8. Controleer op duidelijke foto's van contact met de pootband zonder verlies te volgen, wazig te worden of besmetting te veroorzaken.
4. Beeldverwerking en parameterextractie
   1. Gebruik de ingebouwde algoritmen van de systeemsoftware om vastgelegde beelden te digitaliseren en contactpunten tussen pootriemen te detecteren.
   2. Bereken de swing/standverhouding als de verhouding van de duur van de swingfase tot de duur van de standfase.
   3. Meet de paslengte (cm) als de lineaire afstand die tijdens één volledige pas wordt afgelegd.
   4. Meet de breedte van de pas (cm) als de horizontale afstand tussen de mediale randen van contralaterale achterpoten bij de piekstand.
   5. Bepaal het pootoppervlak bij piekstand (cm²), wat het totale contactoppervlak bij maximale draagkracht vertegenwoordigt.
   6. Bereken de variabiliteit van het pootoppervlak (cm²) als de variatiecoëfficiënt van het contactoppervlak over opeenvolgende passen.
   7. Bereken de gemiddelde waarde van de 3 geldige proeven voor elke individuele muis en exporteer de uiteindelijke datasets.
      OPMERKING: Sluit proeven met onregelmatig stop-, spring- of draaigedrag uit van de analyse.

5. Histologie

1. Weefselverzameling en fixatie
   1. Euthanaer alle muizen op humane wijze door cervicale dislocatie na de inductieperiode van 4 weken. Ontleed voorzichtig het linker kniegewricht en verwijder het omliggende overtollige zachte weefsel.
   2. Dompel het monster onmiddellijk onder in voorgekoelde 4% paraformaldehyde (PFA) fixatief (w/v). Zorg ervoor dat het fixatieve volume 10–15 keer het monstervolume is om het weefsel volledig onder te dompelen.
   3. Fixeer het weefsel op kamertemperatuur gedurende 48 uur. Beweeg de fixatiecontainer voorzichtig elke 8 uur om voldoende fixatieve penetratie te garanderen.
2. Weefselontkalking
   1. Spoel het gefixeerde monster 10 minuten af met langzaam stromend water. Herhaal dit spoelproces drie keer om de resterende PFA te verwijderen.
   2. Overbreng het monster in een 0,5 mol/L ethyleendiaaminetetraazijnzuur (EDTA) decalcificatieoplossing (pH 7,2–7,4). Houd het volume van de decalcificatieoplossing op 20 keer het monstervolume en bewaar het bij 4 °C.
   3. Ontkalk het weefsel gedurende 14–21 dagen. Vervang de oude vloeistof elke 3 dagen door een verse EDTA-ontkalkingsoplossing.
   4. Test het decalcificatie-eindpunt door het subchondrale bot voorzichtig te doorboren met een steriele naald. Beëindig het ontkalkingsproces wanneer de naald soepel en zonder weerstand doorboort.
   5. Was het volledig ontkalkte monster 2 uur onder stromend water om de resterende EDTA te verwijderen. Was het monster vervolgens drie keer met fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) gedurende elk 5 minuten.
3. Inbedding en Sectie
   1. Dehydrateer het ontkalkte monster achtereenvolgens met behulp van een gegradueerde ethanolreeks (70%, 80% en 90% voor 2 uur elk; 95% voor 1 uur; absolute ethanol twee keer voor 1 uur elk).
   2. Maak het gedehydrateerde weefsel twee keer in xyleen schoon gedurende 10 minuten per stuk. Leg het vrijgemaakte weefsel in paraffine.
   3. Snijd het paraffine-ingebedde weefsel in 5 μm dikke, sagittale doorlopende secties met behulp van een microtoom. Bevestig de secties op poly-L-lysine-gecoate glazen glaasjes en bak ze 2 uur in een dia droogplaat op 60 °C.
4. Histomorfologische evaluatie
   1. Kleur de doorsneden met safranine O-fast groen om de histomorfologie van het gewrichtskraakbeen te evalueren.
   2. Beoordeel de kraakbeendegeneratie met behulp van het Osteoarthritis Research Society International (OARSI) scoresysteem onder dubbelblinde omstandigheden¹².
5. Immunohistochemie (IHC) Kernworkflow
   1. Deparaffiniseer de secties in xyleen twee keer gedurende 10 minuten per stuk. Rehydrateer de secties sequentieel via een gegradueerde ethanolreeks tot gedeïoniseerd water.
   2. Dompel de secties onder in een 0,01 mol/L citratbuffer (pH 6,0) voor microgolf-geïnduceerde warmte-epitoopterugwinning. Verhit de buffer tot kookpunt op hoog vermogen en laat het dan zachtjes sudderen op medium vermogen gedurende 15 minuten.
   3. Laat de secties natuurlijk afkoelen tot kamertemperatuur. Was de dia's drie keer met PBS gedurende 5 minuten per stuk
   4. Incubeer de secties in een 3% waterstofperoxide (H2O2) methanoloplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om endogene peroxidaseactiviteit te blokkeren. Was de dia's drie keer met PBS gedurende 5 minuten.
   5. Breng een 5% geitenserumblokkerende oplossing aan op de secties. Incubeer 60 minuten op kamertemperatuur om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren.
   6. Gooi de blokkeringsoplossing weg zonder te wassen. Breng de specifieke primaire antistofwerkoplossing toe (Transient Receptor Potential Vanilloid 4 (TRPV4) bij 1:100, Caspase-3 bij 1:200, of Collageen Type II Alpha 1 (COL2A1) bij 1:150 verdunning).
   7. Incubeer de secties met het primaire antilichaam in een bevochtigde kamer bij 4 °C gedurende een nacht gedurende 12–16 uur.
   8. Pas de secties de volgende dag 30 minuten in evenwicht op kamertemperatuur, en was daarna drie keer met PBS gedurende 5 minuten. Breng een mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd geiten-antikonijn of anti-muis IgG secundair antilichaam toe (1:500 verdunning).
   9. Incubeer de secties met het secundaire antilichaam 60 minuten bij kamertemperatuur. Was de dia's drie keer met PBS gedurende 5 minuten.
   10. Breng een 3,3'-diaminobenzidine (DAB) chromogeenoplossing aan en incubeer in het donker 3–5 minuten bij kamertemperatuur. Stop de reactie onmiddellijk met gedeïoniseerd water wanneer er een helder bruin signaal verschijnt onder microscopische observatie.
   11. Contrastkleur de secties 5 minuten met een hematoxyline-oplossing. Spoel 10 minuten onder stromend water zodat de vlek blauw kan worden.
   12. Differentieer de secties met een alcoholoplossing van 1% zuur gedurende 30 seconden. Spoel de slides 5 minuten af onder stromend water.
   13. Dehydrateer de secties snel door een gegradueerde ethanolreeks en verwijder het weefsel twee keer in xyleen gedurende elk 10 minuten.
   14. Bevestig de slides met neutrale balsem en bedek ze met optische hars coverslips. Laat de gemonteerde slides op kamertemperatuur drogen.
6. IHC-besturing en beeldanalyse
   1. Stel een negatieve controle op door het primaire antilichaam tijdens de kleuringsprocedure te vervangen door PBS. Neem een bekende positieve kraakbeensectie toe als positieve controle om de effectiviteit van antistoffen te verifiëren.
   2. Maak de afbeeldingen van de gekleurde sectie met een hele dia-scanner op 40× en 100× vergroting.
      OPMERKING: Voer alle histologische evaluaties onafhankelijk uit door ten minste twee geblindeerde waarnemers om subjectieve bias te verminderen.

6. Statistische Analyse

1. Dataverwerking en algemene tests
   1. Voer alle gegevensverzameling en analyse uit onder geblindeerde omstandigheden om experimentele bias te minimaliseren.
   2. Analyseer de continue variabelen tussen de vier experimentele groepen met behulp van een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) om de totale verschillen te testen.
   3. Pas de Kruskal-Wallis H-test toe op alle variabelen die niet voldoen aan de noodzakelijke parametrische aannames.
2. Post hoc testen en significantiedrempels
   1. Voer post-hoc paargewijze vergelijkingen uit met behulp van de Tukey-test om specifieke groepsverschillen te identificeren als de initiële ANOVA statistische significantie aangeeft.
   2. Vertrouw uitsluitend op de Tukey-test om het foutpercentage per gezin te controleren. Combineer dit niet met extra meervoudige vergelijkingscorrectiemethoden.
   3. Definieer statistische significantie uniform als p < 0,05

Resultaten

Ganganalyse
Gangcyclusparameters: De swing/stand-verhouding—gedefinieerd als de verhouding van de duur van de niet-dragende swingfase tot de gewichtsdragende standfase van een enkele pas—werd geëvalueerd om de balans tussen gewichtdraging en voortstuwing weer te geven. Vergeleken met de controlegroep (2,10 ± 0,06) vertoonden muizen die een intra-articulaire injectie van collagenase kregen (1,45 ± 0,05) of te veel inspanning ondergingen (1,68 ± 0,05) significant lagere...

Discussie

In deze studie ontwikkelden we een nieuw muismodel van KOA dat de effecten van overmatige belasting op het gewricht nabootst door intraarticulaire injectie van collagenase te combineren met vermoeidheidsopwekkende training op wielen. Deze bevindingen bevestigen opnieuw het idee dat KOA voortkomt uit de wisselwerking van biologische en mechanische factoren. Het begrijpen en identificeren van deze factoren biedt veelbelovend vermogen om individuele behandelplannen en preventieve strategieë...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4% Paraformaldehyde fixatief	Beyotime	P0099
Azijnzuur	Sinopharm	631-61-8
DigiGait beeldvormingssysteem voor muizen	RWD Life Science	MSI-DIG-MS
EDTA-oplossing	Procell	PB180320
Inbeddingscassette	Leica	IP C
Ethanol	Sinopharm	64-17-5
Fast green-kleurstof	Leyan	1085995
Haarverwijderingscrème	Veet	G20161330
Hematoxyline	Adamas	61753A
Hogesnelheids gekoelde centrifuge	Hermle	Z366K
Incubator	TAITEC	M-210FN
Inhalatie-anesthesieapparaat	Ranger	RZ-Viking
Isofluraan	Webio	w100
Microtoom	Ted Pella	10180-220
Roterende vermoeidheidsapparatuur voor muizen	Beijing Zhishu Duobao Biological Technology	YLS-10B
Neutrale balsem	Sinopharm	96949-21-2
Safranine O-kleurstof	Bioss	S0062
Semi-automatisch weefsel-inbeddingscentrum	Thermo Fisher	HistoStar
Glijplaat voor dia's	Electron Microscopy Sciences	XH-2002
Weefselzwemwaterbad	BIOBASE	BT-I
Type II collageenase	Sigma-Aldrich	C4-22-1G
Diascanner	Leica	Aperio VERSA
XYleen	Sinopharm	1330-20-7