Methodenartikel

Isolatietest voor één vezel voor de beoordeling van oxidatieve myovezelgedrag

551 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70637

⸱

31 maart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Health Promotion Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Immunology, Graduate School of Medicine, Juntendo University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie van intacte enkele spiervezels uit de oxidatieve soleus en het vestigen van sterk gezuiverde myoblastculturen afkomstig van deze vezels. De geoptimaliseerde procedure levert betrouwbaar ongeveer 300–500 intacte myovezels per muis op, waardoor downstream moleculaire en cellulaire analyses mogelijk zijn.

Samenvatting

Skeletspieren bestaan uit meerkernige myovezels waarvan de integriteit en functie essentieel zijn voor beweging en algehele gezondheid. Bij neuromusculaire aandoeningen kunnen spiergroepen verschillend worden getroffen tussen ziektetypen en stadia, waardoor het belangrijk is om levensvatbare enkele vezels uit representatieve spieren te isoleren voor mechanistische studies. Het doel van dit protocol is om een betrouwbare methode te bieden om een hoge opbrengst van intacte enkele myovezels te isoleren van de musculine soleus (SOL) spier, die moeilijk te dissociëren is vanwege vezellengte en kwetsbaarheid. Door de concentratie en de verteringstijd van collagenase te optimaliseren, minimaliseert het protocol vezelverlies en behoudt het de levensvatbaarheid tijdens dissociatie. De geoptimaliseerde workflow vermindert aanzienlijk de restweefselhechting aan geïsoleerde vezels, waardoor de overdracht van niet-vezelcellen wordt beperkt en kruiscelbesmetting wordt geminimaliseerd. Deze techniek is geschikt voor enkelvezelanalyses evenals satellietcelisolatie en daaropvolgende expansie onder omstandigheden met minimale besmetting. Met deze geoptimaliseerde workflow verkrijgen we routinematig ~300–500 intacte, SOL-afgeleide enkele myovezels die efficiënt kunnen worden geïmproviseerd en bovendien een hoogwaardige satellietcelpopulatie opleveren met minimale fibroblastenbesmetting. Met behulp van vergelijkende analyses met Extensor Digitorum Longus (EDL) spier benadrukken we het belang van een op maat gemaakte, spierspecifieke benadering voor het evalueren van therapieën in neuromusculaire ziekteonderzoek, waardoor potentiële farmaceutische interventies binnen kleine, afstembare experimentele vensters kunnen worden getest.

Inleiding

Skeletspieren vormen het meest voorkomende weefsel in het menselijk lichaam en vormen ongeveer 40–50% van de totale lichaamsmassa1. Skeletspieren dienen als een energiereservoir in de vorm van glycogeen. Tijdens koude blootstelling levert het warmte via thermogenese en zorgt het vooral voor voortbeweging. Skeletspieren bestaan uit multinucleaire, post-mitotische myovezels. Om spiergroei en herstel te ondersteunen, worden nieuwe myonuclei gegenereerd door de stamcel van onze skeletspier, de satellietcel (SC). SC's bevinden zich aan de rand van postnatale skeletspiervezels 2,3,4. SC's worden geïdentificeerd door de transcriptiefactor Pax7, die zowel in rustende als geactiveerde toestand 3,5 wordt uitgedrukt. Bij een blessure of hypertrofische stimulatie activeren en upreguleren SC's MyoD, gaan het myogene programma binnen, vermenigvuldigen zich en fuseren uiteindelijk met bestaande of nieuw gevormde myovezels om de spierfunctie 6,7,8 te herstellen. SC's zijn heterogeen in hun stamvorm, embryologische oorsprong (somitisch versus niet-somitisch), stadium van postnatale groei (jong versus oud) en spiersamenstelling (snel versus langzame vezels)9,10,11.

Afhankelijk van het lichaamsgebied wordt skeletspier afgestemd op de energetische en functionele eisen van dat gebied. Deze heterogeniteit in spiervezels is mogelijk vanwege hun contractiliteit en oxidatieve capaciteit. Spiervezels bestaan namelijk uit langzaam trekkende oxidatieve vezels (type I en IIa genoemd) en snel samentrekkende glycolytische vezels (bij knaagdieren IIb IIx genoemd). Dit prachtige, functionele mozaïek van vezeltypes stelt ons in staat vrij te bewegen in ons dagelijks leven. Zo zijn houdingsspieren zoals de soleus (SOL) en de erector spinae in een staat van chronische, laag-niveau activatie en bevatten daardoor een hoog aandeel langzaam oxiderende type-I en type-IIa spiervezels. Daarentegen bestaan korte maar snel werkende spieren zoals de extensor digitorum longus (EDL) voornamelijk uit glycolytische type-IIx en type-IIb vezels. De vezelsamenstelling is echter niet vast; Spiervezels zijn eerder dynamische structuren die in staat zijn om van snel naar langzaam te verschuiven en omgekeerd, afhankelijk van de functionele eisen die aan hen worden gesteld. Het verschil in contractiliteit van vezeltype is mogelijk door het gehalte van myosine-eiwit. Dit is het belangrijkste eiwit binnen skeletspieren, bestaande uit isoformen van myosine lichte en zware ketens 12,14.

Binnen een sarcomer (de kleinste functionele eenheid van de spier die kracht genereert) werken myosinekoppen en actine samen tot een structuur die bekend staat als een kruisbrug. Door hydrolyse van ATP wordt energie vrijgegeven door de cyclus van de myosine- en actine-interacties 15,16. De Myosine heavy chain (MyHC) is de meest geschikte marker voor vezeltypeidentificatie12,13. Afhankelijk van de isoform van MyHC die tot expressie komt, zal de snelheid van spiercontractiliteit variëren. Zoals vermeld zijn type-I vezels langzame oxidatieve vezels, in tegenstelling tot type-II vezels. Type-I dominante spiergroepen bevatten een hogere hoeveelheid oxidatieve enzymen, zijn rijker aan mitochondriën en hebben een dicht capillair netwerk om de spier te doorbloeden(denk aan een marathonloper). Type-I vezels worden gecodeerd door het MYH7-gen 13,19. Type-II vezels zijn snel vermoeibaar, bevatten een hoog percentage glycolytische enzymen en hebben een grotere maximale snelheid van verkorting, waardoor ze ideaal zijn voor korte kracht- of bewegingsuitbarstingen (denk aan powerlifter). Type-II vezels voor type-IIa, IIx en IIb (bij knaagdieren) worden gecodeerd door respectievelijk de genen MYH2, MYH1 en MYH4,20,21. Het is dan ook niet verrassend dat elke pathofysiologische belediging die spierintegriteit beïnvloedt, de samenstelling van het vezeltype verandert en leidt tot schadelijke effecten op de spierfunctie, wat mogelijk de kwaliteit van leven verlaagt. In feite beginnen veel spierdystrofieën ofwel in de satellietcel (satellietcel-opathieën) of in de spiervezel (afgeleid van motorneuron of spierweefsel), en kunnen ze een verschuiving in vezeltypesamenstellingveroorzaken 22,23,24,25. Zo tonen studies over ruggenmergletsel, bedrust en ruimtevaart (microzwaartekracht) aan dat langdurige inactiviteit houdingsspieren kan aanzetten om te verschuiven van een langzame naar een snelle vezelfenotype 26,27,28,29,30. Omgekeerd worden bij Duchenne spierdystrofie, zowel in menselijke als bij muismodellen (MDX), snelle glycolytische vezels in grotere mate en met een grotere ernst beïnvloed dan hun langzamere tegenhangers 31,32,33,34. Evenzo wordt bij facioscapulohumerale spierdystrofie (FSHD) een snelle naar langzame twitch-overgang waargenomen met een groter aandeel type-I vezels, samen met lagere krachtproductie in type-II vezels 24,35,36.

Het blijft onduidelijk waarom bepaalde spiervezeltypen selectief worden aangetast of gespaard worden bij verschillende ziekten. Het feit dat deze patronen niet-willekeurig zijn, onderstreept het belang van het ontleden van de onderliggende mechanismen, waarvoor single-fiber isolatie is uitgegroeid tot een krachtige en veelgebruikte techniek. Sinds de eerste introductie in het midden van de jaren tachtig door Bischoff37 is dit onmisbare hulpmiddel inderdaad voortdurend verfijnd en aangepast, waardoor steeds nauwkeuriger onderzoek naar spierbiologiemogelijk is. Belangrijk is dat isolatie van enkelvezels SC's zo dicht mogelijk bij hun fysiologische niche houdt, waardoor hun moleculaire activiteit voldoende gecontroleerd kan worden. Hoewel spiergroepen zoals die van de flexor digitorum brevis (FDB) en EDLrelatief eenvoudig kunnen worden verwijderd, blijft de SOL-spier een van de moeilijkste spieren om een rijke populatie intacte vezels uit te halen. Dit komt door de stijfheid, lange vezellengte en de gevoeligheid voor schade. Om dit aan te pakken, is in de huidige studie een techniek geoptimaliseerd die robuust een hoogwaardige, levensvatbare populatie vezels levert uit de berucht moeilijk te isoleren SOL-spier. In combinatie met EDL-vezelisolatie maakt deze aanpak het mogelijk vezels en afgeleide cellen (satellietcellen, myoblasten en myotubes) te kweken uit verschillende spiergroepen. Cruciaal is dat dit platform systematisch onderzoek mogelijk maakt van de moleculaire factoren die verschillend kunnen bijdragen aan diverse spierpathologieën mogelijk en een krachtig middel biedt om farmaceutische interventies te testen op een manier die spiertype-specifieke responsen kan onthullen en uiteindelijk de ontwikkeling van effectieve behandelingen voor skeletspierziekten kan ondersteunen.

Protocol

Alle dieren werden gehuisvest in de dierenfaciliteit van de Tokyo Metropolitan University (vergunningnummers: A4-4, A5-9, A6-7, A7-018). Alle dieren werden onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden gehouden. De in deze studie toegepaste dierenbehandeling en experimentele procedures volgden strikt de richtlijnen van de Veiligheids- en Ethische Commissie van de Metropolitan Universiteit van Tokio.

1. Bereiding van reagensen

  1. Draag de hele tijd handschoenen. In een 25 mL centrifugebuis bereid 0,5% collagenase type I-oplossing in het Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMAX met 1% penicilline-streptomycine-amphotericine B-suspensie (AB). Nadat collagenase goed is opgelost (tik lichtjes op de buis indien nodig), steriliseer de oplossing door te filteren door een 0,22 μm laag-eiwitbindingsfilter.
    OPMERKING: 2,5 mL collagenaseoplossing is genoeg voor twee soleus (één muis).
  2. Bereid 10 mL 5% rundserumalbumine (BSA) voor in fosfaatgeborrelde zoutoplossing (PBS). Hitte-inactiveren bij 60 °C gedurende 30 minuten, en daarna filteren door een 0,22 μm laag-eiwitbindingsfilter.
    OPMERKING: De 5% BSA in PBS-oplossing kan tot 10 dagen worden bewaard bij 4 °C.

2. Dissectie van de soleusspieren

  1. Inrichtingsapparatuur voor spierdissectie (Figuur 1A).
  2. Verdoof C57BL/6 muizen door intraperitoneale injectie van een drievoudig anesthesiummengsel (0,5 mL/g lichaamsgewicht) met 1 mg/mL medetomidinehydrochloride, 5 mg/mL midazolam en 5 mg/mL butorphanoltartraat, en euthanasen de muizen vervolgens door cervicale dislocatie.
  3. Maak opeenvolgende huidincisies op de achterpoot en pel de huid weg. Verwijder de oppervlaktefascia.
  4. Scheid de plantaris (PLA) pees van de bundels gastrocnemius (GAS) en soleus (SOL) pees. Verwijder de PLA voorzichtig door aan de pees te trekken (Figuur 1B).
  5. Knip de bundels van de GAS- en SOL-pees door en leg de spieren bloot aan de zijde. Steek een pin in de opening tussen de proximale pees van de GAS en SOL (Figuur 1C).
  6. Schuif de naald voorzichtig naar het distale uiteinde om SOL- en GAS-spieren te scheiden (Figuur 1D).
  7. Knip de peesbundels van de GAS-zijde af (Figuur 1E).
  8. Laat de SOL rusten op de GAS. Pas zorgvuldig de positie van de SOL aan om de proximale pees bloot te leggen en knip deze met een microschaar (Figuur 1F).
  9. Plaats de SOL op de dissectietafel en verwijder de resterende pees (Figuur 1G).
    OPMERKING: Deze stap is optioneel; de resterende pees heeft geen invloed op de uitkomst.

3. Spijsvertering van de soleusspieren

  1. Breng de intacte soleus over in een 25 mL centrifugebuis met de bereide 0,5% collagenase-oplossing. Incubeer bij 37 °C gedurende 130 minuten.
    OPMERKING: Elke 15–20 minuten kan men het monster handmatig bewegen om vezels iets te scheiden en de collagenaseactiviteit te ondersteunen.

4. Isolatie van enkele vezels onder een stereomicroscoop

  1. Snijd twee Pasteur-pipetten om één met een brede boring en één met een smalle opening te maken (Figuur 2A). Steriliseer en glad onder vlammen de gaten om spierschade tijdens de traditie te voorkomen.
  2. Om vezeladhesie tijdens isolatie te voorkomen, bedek Pasteur-pipetten en drie petrischaaltjes van 50 mm met 5% BSA/PBS.
    OPMERKING: Een stereomicroscoop (Figuur 2B) werd gebruikt tijdens de isolatiestappen.
  3. Na de spiervertering gooi je de overtollige collagenaseoplossing weg en plaats je de soleus in het eerste gerecht met DMEM en 1% AB (Figuur 2C).
  4. Spoel met de breedboring Pasteur-pipet voorzichtig op en neer om de vezels te dissociëren (Figuur 2D).
  5. Met de smalboring Pasteur-pipet wordt intacte enkele vezels langs de lengte van de spiervezel naar de tweede schaal overgebracht. Maak hier gebruik van de gelegenheid om vuil en/of gekrompen vezels te verwijderen (Figuur 2E,F).
  6. Breng hoogwaardige (volledige lengte/intacte) enkele vezels over naar een derde schaal om zuiverheid te garanderen met de smallbore Pasteur-pipet (Figuur 2G,H).
  7. Verzamel de vezels in een met BSA gecoate 25 mL centrifugebuis. Roer de suspensie voorzichtig en laat het dan 5 minuten op kamertemperatuur staan zodat de vezels naar de bodem van de buis kunnen neerslaan.
  8. Met de smalle Pasteur-pipet verwijder je het supernatant zorgvuldig en verwijder je eventueel achtergebleven vuil. Laat ongeveer 500 μL van de DMEM achter met 1% AB-oplossing. Dit neerslag bevat een sterk gezuiverde populatie van enkele spiervezels (Figuur 2G,H).
    OPMERKING: Deze techniek kan > 300 enkele vezels opleveren, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor eiwit- en mRNA-extractie en daaropvolgende analyse.

5. Vestiging van sterk gezuiverde myoblastculturen uit soleusvezels

  1. Verdun de Matrigel Matrix tot 0,1 mg/mL en gebruik dit om een kweekschaal van 100 mm te bedekken. Incubeer de schaal op 37 °C gedurende 30–60 minuten totdat de coating gelijkmatig polymeriseert.
  2. Voeg een gelijke hoeveelheid Accutase toe aan de suspensie van de spiervezels en incubeer op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 10 mL groeimedium toe (bestaande uit glucosevrij DMEM met 30% foetaal rundserum, 1% GlutaMAX, 1% kip-embryo extract, CEE, 1% AB en 0,01 μg/mL basische fibroblast groeifactor, bFGF)44.
    OPMERKING: Een gelijke hoeveelheid Accutase in dit geval is de 500 μL zoals beschreven in Sectie 4.8. Accutase bevordert de zachte dissociatie van spiervezels en helpt satellietcellen vrij te geven, wat de latere uitbreiding van de myoblastcultuur ondersteunt.
  3. Breng de 10 mL Accutase-behandelde spiervezelsuspensie over in een matrigel-gecoate schaal. Ongeveer 4 enkele vezels/cm2 worden toegevoegd aan een kweekschaal van 100 mm. Zorg ervoor dat de vezels gelijkmatig verspreid zijn over het kweekgerecht.
  4. Na 3 dagen in kweekmedium kunnen myoblastkolonies worden waargenomen. Vervang het groeimedium dagelijks totdat myoblasten de benodigde populatie bereiken. Normaal gesproken zijn myoblastculturen op dag 6 voldoende samenvloeiend voor de experimentele fase (Figuur 3A).
  5. Verwijder myoblasten van hun oorspronkelijke kweekschotel met trypsine en breng het monster 2 minuten uit bij 37 °C. Met een hemocytometer telt u de cellen en zaden op basis van de putgrootte en de celconfluentie die nodig is voor myogene progressie.
    OPMERKING: Voor een schotel van 100 mm voeg je 1 ml trypsine toe.

Resultaten

Onze techniek toont aan dat geïsoleerde vezels van de soleus (SOL) en extensor digitorum longus (EDL) spieren efficiënt immuungelabeld kunnen worden tegen Pax7 (Figuur 3B). Deze geïsoleerde vezels kunnen 3 dagen worden bewaard in een drijvend kweekmedium (bestaande uit DMEM + GlutaMAX met 10% paardenserum, 1% AB, 0,5% CEE), gevolgd door immunolabeling (Figuur 3B). Het bewaren van drijvende vezels langer dan 4 dagen wordt niet aanbevolen. Onder de beschreven drijvende vezelcondities hebben myovezels de neiging zich na deze tijd samen te voegen, waardoor de latere immunolabeling-analyse in gevaar komt.

De gepresenteerde techniek kan verder worden gebruikt voor immunoblotting in het myogene programma (Figuur 3C). Inderdaad, SOL- en EDL-afgeleide myoblasten werden geplateerd in 24-wellplaten bij ongeveer 70% confluentie. De cellen werden ofwel één dag in groeimedium gehouden (myoblasten) of werden twee of vier dagen gestimuleerd om te differentiëren (respectievelijk vroegvormende en gedifferentieerde myotubes). Vijf μg eiwit werd geladen voor immunoblottinganalyse.

MyHC I-expressie werd vrijwel specifiek tot expressie gebracht in SOL-afgeleide spiervezels, met minimale expressie in myotubes en verwaarloosbaar in myoblasten (Figuur 3C). MyHC II werd tot expressie gebracht in zowel SOL- als EDL-spiervezels. Deze uitdrukking weerspiegelt de SOL, die voornamelijk bestaat uit type-I en IIa, terwijl de EDL voornamelijk bestaat uit IIx- en IIb-vezels. Myoblasten drukten MyHC II niet tot expressie, maar de expressie ervan nam geleidelijk toe tijdens differentiatie. De oxidatief-gerelateerde eiwitten PGC-1α en COXIV toonden de verwachte hogere expressie in SOL-afgeleide vezels. Ook werd een hogere expressie van GLUT4 gedetecteerd in geïsoleerde SOL-vezels vergeleken met EDL-vezels. Een probleem waar skeletspierbiologen mee te maken kunnen krijgen, is dat veelgebruikte huishoudelijke eiwitten en belastingscontroles, zoals α-tubuline, β-actine, GAPDH en totale eiwitkleuringen, waaronder Ponceau S, niet stabiel blijven tussen myoblasten, myotubes en geïsoleerde spiervezels, waarbij elk een duidelijke variabiliteit vertoont. De signaalintensiteit van α-tubuline en β-actine was het hoogst in myotubes, terwijl de kleuring van Ponceau S relatief zwak was in myoblasten. Daarentegen vertoonde GAPDH een sterkere expressie in EDL-spiervezels. Toch kan afhankelijk van het experimentele doel een van deze huishoudelijke eiwitten nog steeds toepasbaar zijn; alternatieve kunnen normalisatiefactoren zoals hitteschokeiwit 70 (HSP70) worden onderzocht.

Figuur 1
Figuur 1. Dissectie van de spier soleus. (A) Benodigde apparatuur voor dissectie. 1: microschaar, 2: fijne pincet, 3: ontledende schaar, en 4: dissectiepinnen. (B) De PLA-pees werd afgesneden uit GAS- en SOL-peesbundels (gele pijl). De distale PLA (witte pijl) pees werd met een tang opgetild. (C) Een dissectiepen werd ingebracht in de ruimte tussen de proximale pees van de SOL (rode pijl) en GAS (groene pijl). (D) SOL werd gescheiden van GAS met een dissectiepen. (E) GAS- en SOL-peesbundels werden vervolgens aan de GAS-zijde doorgesneden. (V) SOL proximale pees werd vervolgens met een microschaar doorgesneden. (G) Extra distale peesbundels werden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Isolatie van soleusvezels. (A) Apparatuur die nodig is voor isolatie. 1: smalboring en 2: breedboring Pasteur-pipetten. (B) Stereomicroscoop gebruikt voor isolatie. (C) Collagenase-verteerde soleus werd overgedragen aan DMEM met 1% AB. (D) Soleusvezels losgekoppeld van de spier na de eerste 10 spoelsessies. (E) Enkele vezels overgebracht naar de tweede schaal. (F) Afbeelding toont schone vezels verwijderd van puin en gekrompen vezels. (G) Vuilvrije enkele vezels overgebracht naar de derde schaal. (H) Intacte enkele vezels duidelijk zichtbaar. Schaalbalk = 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Uitbreiding van celkweek en analyse van EDL- en SOL-afgeleide monsters. (A) Na 6 dagen na isolatie tonen de kweekmonsters van het proliferatiemedium een zuivere myoblastcultuur verkregen uit geïsoleerde soleusvezels. Schaalbalk = 100 μm. (B) SOL- en EDL-afgeleide enkele vezels tonen onmiddellijk of 3 dagen na isolatie satellietcellen die immuno-gelabeld zijn voor Pax7 (groen). De afwezigheid van MyoD (rood) bevestigt dat satellietcellen zich nog niet hebben gecommitteerd aan myogene activatie. Vezels werden gekleurd met DAPI (blauw). De cellen werden vervolgens waargenomen door een fluorescentiemicroscoop. Schubstaaf = 20 μm. (C) 5 μg eiwit werd gebruikt voor immunoblotting van myoblasten, myotubes en van myovezel afgeleide monsters. Immunoblottingpanelen tonen expressie van MyHC I, MyHC II, PGC-1α, COX IV, GLUT4, α-tubuline, β-actine en GAPDH werden gebruikt als huishoudelijke en normaliserende doelen. Ponceau S-kleuring werd gebruikt als totale controle voor eiwitbelasting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De eerste sleutel om een groot aantal spiervezels van de soleus (SOL) te isoleren, is het behouden van de structurele integriteit van de spier tijdens dissectie. Als het epimysium van de SOL wordt afgescheurd of als de spier krachtig wordt getrokken, vooral langs de lengteas, tijdens de dissectie, zal de isolatieopbrengst ernstig worden aangetast. Deze dissectiefouten zijn meestal achteraf gemakkelijk te identificeren. Na de collagenase-vertering wordt de spier inderdaad gelijkmatig gekrompen en vormt een witte, compacte massa. Onder zulke omstandigheden kan slechts een zeer klein aantal levensvatbare vezels worden gedissocieerd.

De tweede beslissende factor voor succesvolle soleusisolatie is de efficiëntie van de type I collagenase-vertering. Wanneer collagenase optimaal werkt, kunnen ongeveer 100–200 soleusvezels worden verkregen tijdens de eerste 10 spoelsessies. Daarentegen, wanneer de vertering suboptimaal is, kunnen er zelfs na de eerste 20 spoelingen minder dan 50 vezels vrijkomen. Om een hogere vezelopbrengst te verkrijgen, zijn grondiger spoelen en extra spoelcycli nodig. Omdat SOL-vezels echter uitzonderlijk fragiel zijn, leidt dit vaak tot krimp van vezels tijdens het spoelen.

Voor het vestigen van een zuivere, door SOL afgeleide primaire myoblastcultuur speelt de collagenase-vertering opnieuw een cruciale rol. Wanneer de vertering efficiënt is, blijven er minder vezels aan het resterende weefsel gehecht en zorgt het overbrengen van de vezels naar kweekmedium tot minimale fibroblastbesmetting. Daarentegen, wanneer de SOL slecht wordt verteerd, blijven gedissocieerde vezels aan restweefsel vastzitten, waardoor de myoblastcultuur besmet raakt met fibroblasten. Onderzoekers moeten zoeken naar de typische tekenen van fibroblastbesmetting in de gezaaide celmonsters; deze omvatten een veel grotere celgrootte en uitgebreide cytoskeletuitsteeksels, vergeleken met de veel kleinere, spilvormige satellietcellen in vastzittende matrigel-gecoate schotel. Mocht er besmetting optreden, dan kunnen onderzoekers cellen onderwerpen aan pre-plating-stappen zoals elders beschreven45. Kort worden SC's na isolatie 3 dagen gekweekt, daarna trypsiniseerd en kort voorgeserveerd op met collageen bedekte gerechten. Tijdens 15–30 minuten incubatie hechten fibroblasten terwijl SC's blijven hangen en worden overgebracht naar verse matrigel-gecoate platen.

Zoals hierboven vermeld en in overeenstemming met onze ervaring, zijn SOL-vezels langer en kwetsbaarder dan de vezels van de extensor digitorum longus (EDL) en flexor digitorum brevis (FDB). Dit maakt het overbrengen van vezels met Pasteur-pipetten lastig. Het is essentieel om vezels langs hun longitudinale as te aspireren in plaats van ze uit het midden te trekken; anders vouwen en krimpen de vezels onder de spanning. Naast de beslissende factoren die direct bepalen of vezelisolatie slaagt, zijn enkele extra technische stappen essentieel om de opbrengst van soleusvezels te verbeteren. Een daarvan is om alle Pasteur-pipetten, schalen en verzamelbuizen te coaten met 5% BSA. Dit voorkomt dat vers gedissocieerde spiervezels aan oppervlakken hechten, waardoor vouwen en krimpen van de vezels worden voorkomen. Het wordt aanbevolen om bij elke geïsoleerde spiermonsters nieuwe met warmte gesteriliseerde, BSA-gecoate Pasteur-pipetten te bereiden. Onderzoekers zouden ook een set Pasteur-pipetten kunnen voorbereiden voor langdurig gebruik. Zo ja, steriliseer dan elke keer met warmte en breng voor gebruik een verse coating aan met BSA.

Het conventionele protocol voor isolatie van enkele spiervezels was primair geoptimaliseerd voor glycolytische spieren zoals FDB en EDL37. Oxidatieve spieren, zoals de SOL, zijn echter structureel verschillend. Transcriptomische analyses hebben aangetoond dat extracellulaire matrix (ECM)-gerelateerde genexpressie verschilt tussen de SOL en EDL46, inclusief genen zoals dystrofine, een cytoskeletal linkerproteïne van skeletspier44. Daardoor is de standaardvoorwaarde voor EDL-spiervertering met 0,2% (2 mg/mL) collagenase gedurende 60–90 minuten niet optimaal voor SOL-spieren, wat resulteert in compacte vezelbundels of gekrompen vezels na de vertering. In deze studie hebben we verschillende belangrijke stappen geoptimaliseerd om het protocol aan te passen voor oxidatieve SOL-spieren. Door de concentratie van type I collagenase aan te passen naar 0,5% (5 mg/mL), de incubatietijd te verlengen tot 130 minuten en mechanische spanning tijdens het spoelen te minimaliseren, kunnen consequent 300–500 intacte vezels van een enkele muis worden verkregen. In vergelijking met EDL blijven het aantal vezels en het rendement van SOL-monsters lager (de EDL kan > 500 vezels opleveren); desalniettemin zijn het vezelgetal en, belangrijker nog, de hoge kwaliteit van onze SOL-afgeleide vezels robuust en geschikt voor downstreamtoepassingen zoals immunolabeling en immunoblotting. Hoewel onze immunoblottingresultaten bestonden uit samengevoegde enkelvezelmonsters, kan de techniek die in dit rapport wordt gepresenteerd betrouwbaar intacte individuele vezels extraheren, waardoor ze geschikt zijn voor downstream-toepassingen zoals immunoblotting, proteomics en RNA-sequencing47 bij single-fiber resolutie. Onderzoekers in het veld kunnen deze techniek gebruiken om metabole en contractiele verschillen tussen oxidatieve en glycolytische spiervezels te bestuderen.

Al met al biedt dit protocol een reproduceerbare en toegankelijke methode om intacte oxidatieve vezels uit de soleusspier te isoleren, waarmee het de toolkit voor het onderzoeken van typespecifieke fysiologie en moleculaire mechanismen van spiervezels uitbreidt.

Openbaarmakingen

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door de oprichting van universitaire fellowships voor de creatie van wetenschaps- en technologieinnovatie (JST, subsidie nr. JPMJFS2139 aan T.H.) en subsidies van de Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI 23H00457 toegekend aan N.L.F., 20J12849 aan Y.Mi., 24K22254 aan Y. Ma). Deze studie werd ook ondersteund door de Tokyo Metropolitan Government Advanced Research Grant [R2-2] aan Y.Ma., N.L.F., en het TMU strategisch onderzoeksfonds voor innovatief onderzoeksproject [R3] aan N.L.F. Dank aan Yasuro Furuichi voor zijn advies en nuttige opmerkingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Basic fibroblast growth factorPeprotech450-33
Bovine serum albuminSigmaA9418
Butorphanol tartrateMeiji Yakuka Co., Ltd711-12Productnaam: Vetorphale-injectie
Chicken Embryo ExtractUS BiologicalC3999
Collagenase type IWorthingtonM9B2717
DAPISigma-AldrichD9542
Fetal bovine serumGibco10437-028
Glucose-free DMEMGibcoA14430-01
GlutaMAXGibco10569
High-glucose DMEM+GlutaMAXGibco10569-010
Horse serumLife technology16050-130
Low-protein binding filterMilliporeSLGVR33RB
MatrigelCorning354230
Medetomidine hydrochlorideKyoritsu Seiyaku Co., Ltd8816Productnaam: Dorbene-injectie
MidazolamMaruishi Pharmaceutical Co., Ltd4987211762100Productnaam: Dormicum-injectie
Penicillin-streptomycin-amphotericin B suspensieWako161-23181
Ponceau S-kleuroplossingSigma-Aldrich24-3875-5
Trypsin-EDTA (0,25%), fenolroodGibco25200056
Apparatuur
Centrifugebuizen (25 mL)IWAKI2362-025
FluorescentiemicroscoopKeyenceBZ-X810
PasteurpipettenIWAKI5 3/4 IK-PAS-5P
StereomicroscoopLeicaM165C
Steriline schotels (100 mm)Thermo Scientific3020-100In het manuscript vermeld als petrischaal
Antilichamen voor immunolabeling
Geit anti-muis (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-327231:400
Geit anti-konijn (H+L), Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-110121:400
Muis Anti-Myosine Zwaar KettingR&D SystemsMAB44701:400
Muis Anti-Pax7DSHBAB-5284281:100
Konijn Anti-MyoDSanta Cruz Biotechnologysc-7601:100
Antilichamen voor immunoblotted
HRP-geconjugeerd Anti-muis IgGCytivaNA9311:1000/ paardenbloedperoxide
HRP-geconjugeerd Anti-Konijn IgGCytivaNA9341:1000/ paardenbloedperoxide
Muis Anti-MyHC ISigmaM84211:1000/ Myosine Zwaar Ketting I
Muis Anti-MyHC IISigmaM42761:1000/ Myosine Zwaar Ketting II
Muis Anti-PGC-1αSanta Cruz Biotechnologysc-5173801:1000/ Pparg co-activator 1 alpha
Muis Anti-α-tubulineCell Signaling Technology#38731:1000/ Alpha tubuline
Konijn Anti-COXIVCell Signaling Technology#48501:1000/ Cytochroom c oxidase IV
Konijn Anti-GAPDHCell Signaling Technology#22181:10000/ Glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase
Konijn Anti-GLUT4Cell Signaling Technology#22131:1000/ Glucose Transporter 4
Konijn Anti-β-actinProteintech20536-1-AP1:2000/ Nonmuscle Beta-actin

Referenties

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18–88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
  2. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  3. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: The stem cell that came in from the cold. J Histochem Cytochem. 54 (11), 1177-1191 (2006).
  4. Zammit, P. S., et al. Pax7 and myogenic progression in skeletal muscle satellite cells. J Cell Sci. 119 (9), 1824-1832 (2006).
  5. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  6. Günther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  7. Gnocchi, V. F., White, R. B., Ono, Y., Ellis, J. A., Zammit, P. S. Further characterisation of the molecular signature of quiescent and activated mouse muscle satellite cells. PLoS One. 4 (4), e5205(2009).
  8. Halevy, O., et al. Pattern of Pax7 expression during myogenesis in the posthatch chicken establishes a model for satellite cell differentiation and renewal. Dev Dyn. 231 (3), 489-502 (2004).
  9. Biressi, S., Rando, T. A. Heterogeneity in the muscle satellite cell population. Semin Cell Dev Biol. 21 (8), 845-854 (2010).
  10. Zammit, P. S. All muscle satellite cells are equal, but are some more equal than others. J Cell Sci. 121 (18), 2975-2982 (2008).
  11. Ortuste Quiroga, H. P., Fujimaki, S., Ono, Y. Pax7 reporter mouse models: A pocket guide for satellite cell research. Eur J Transl Myol. 33 (4), (2023).
  12. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  13. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  14. Ahmetov, I. I., Vinogradova, O. L., Williams, A. G. Gene polymorphisms and fiber-type composition of human skeletal muscle. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 22 (4), 292-303 (2012).
  15. Guth, L., Samaha, F. J. Qualitative differences between actomyosin ATPase of slow and fast mammalian muscle. Exp Neurol. 25 (1), 138-152 (1969).
  16. Aguilera-Alcala, N., Morales-Reyes, Z., Martin-Lopez, B., Moleon, M., Sanchez-Zapata, J. A. Role of scavengers in providing non-material contributions to people. Ecol Indic. 117, 11(2020).
  17. Sullivan, S. M., Pittman, R. N. Relationship between mitochondrial volume density and capillarity in hamster muscles. Am J Physiol. 252 (1), H149-H155 (1987).
  18. Fujita, N., et al. Changes in lipid metabolism and capillary density of the skeletal muscle following low-intensity exercise training in a rat model of obesity with hyperinsulinemia. PLoS One. 13 (5), e0196895(2018).
  19. Narusawa, M., et al. Slow myosin in developing rat skeletal muscle. J Cell Biol. 104 (3), 447-459 (1987).
  20. Faerman, A., Shani, M. The expression of the regulatory myosin light chain 2 gene during mouse embryogenesis. Development. 118 (3), 919-929 (1993).
  21. Denardi, C., et al. Type 2x-myosin heavy chain is coded by a muscle fiber type-specific and developmentally regulated gene. J Cell Biol. 123 (4), 823-835 (1993).
  22. Ciciliot, S., Rossi, A. C., Dyar, K. A., Blaauw, B., Schiaffino, S. Muscle type and fiber type specificity in muscle wasting. Int J Biochem Cell Biol. 45 (10), 2191-2199 (2013).
  23. Talbot, J., Maves, L. Skeletal muscle fiber type: Using insights from muscle developmental biology to dissect targets for susceptibility and resistance to muscle disease. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (4), 518-534 (2016).
  24. Celegato, B., et al. Parallel protein and transcript profiles of FSHD patient muscles correlate to the D4Z4 arrangement and reveal a common impairment of slow to fast fibre differentiation and a general deregulation of MyoD-dependent genes. Proteomics. 6 (19), 5303-5321 (2006).
  25. Ganassi, M., Muntoni, F., Zammit, P. S. Defining and identifying satellite cell-opathies within muscular dystrophies and myopathies. Exp Cell Res. 411 (1), 112906(2022).
  26. Gallagher, P., et al. Effects of 84-days of bedrest and resistance training on single muscle fibre myosin heavy chain distribution in human vastus lateralis and soleus muscles. Acta Physiol Scand. 185 (1), 61-69 (2005).
  27. Grimby, G., Broberg, C., Krotkiewska, I., Krotkiewski, M. Muscle fiber composition in patients with traumatic cord lesion. Scand J Rehabil Med. 8 (1), 37-42 (1976).
  28. Shenkman, B. S. From slow to fast: Hypogravity-induced remodeling of muscle fiber myosin phenotype. Acta Naturae. 8 (4), 47-59 (2016).
  29. Ohira, T., Kawano, F., Goto, K., Ohira, Y. Responses of skeletal muscles to gravitational unloading and/or reloading. J Physiol Sci. 65 (4), 293-310 (2015).
  30. Higashino, K., et al. Early changes in muscle atrophy and muscle fiber type conversion after spinal cord transection and peripheral nerve transection in rats. J Neuroeng Rehabil. 10, 46(2013).
  31. Webster, C., Silberstein, L., Hays, A. P., Blau, H. M. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell. 52 (4), 503-513 (1988).
  32. Pedemonte, M., Sandri, C., Schiaffino, S., Minetti, C. Early decrease of IIx myosin heavy chain transcripts in Duchenne muscular dystrophy. Biochem Biophys Res Commun. 255 (2), 466-469 (1999).
  33. Rafael, J. A., et al. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum Mol Genet. 9 (9), 1357-1367 (2000).
  34. Kotelnikova, E., et al. Novel approach to meta-analysis of microarray datasets reveals muscle remodeling-related drug targets and biomarkers in Duchenne muscular dystrophy. PLoS Comput Biol. 8 (2), e1002365(2012).
  35. Banerji, C. R. S., Zammit, P. S. Pathomechanisms and biomarkers in facioscapulohumeral muscular dystrophy: Roles of DUX4 and Pax7. EMBO Mol Med. 13 (8), e13695(2021).
  36. Lassche, S., et al. Sarcomeric dysfunction contributes to muscle weakness in facioscapulohumeral muscular dystrophy. Neurology. 80 (8), 733-737 (2013).
  37. Bischoff, R. Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture. Dev Biol. 115 (1), 129-139 (1986).
  38. Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (10), 773-779 (1995).
  39. Collins, C. A., Zammit, P. S. Isolation and grafting of single muscle fibres. Methods Mol Biol. 482, 319-330 (2009).
  40. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system—a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  41. Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells. Methods Mol Biol. 946, 431-468 (2013).
  42. Smith, L. R., Meyer, G. A. Skeletal muscle explants: Ex-vivo models to study cellular behavior in a complex tissue environment. Connect Tissue Res. 61 (3-4), 248-261 (2020).
  43. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skeletal Muscle. 8 (1), 14(2018).
  44. Omairi, S., et al. Regulation of the dystrophin-associated glycoprotein complex composition by the metabolic properties of muscle fibres. Sci Rep. 9 (1), 2770(2019).
  45. Moyle, L. A., Zammit, P. S. Isolation, culture and immunostaining of skeletal muscle fibres to study myogenic progression in satellite cells. Methods Mol Biol. 1210, 63-78 (2014).
  46. Hettige, P., Tahir, U., Nishikawa, K. C., Gage, M. J. Comparative analysis of the transcriptomes of EDL, psoas, and soleus muscles from mice. BMC Genomics. 21 (1), 808(2020).
  47. Blackburn, D. M., Lazure, F., Soleimani, V. D. RNA sequencing of single myofibers from Mus musculus. Bio Protoc. 10 (4), e3525(2020).

Herprints en machtigingen

Tags

Skeletspierintegriteit van myofibrillencollagenase-verteringisolatie van satellietcellensoleusspierspierdissociatieneuromusculaire aandoeningenimmunolabeling
Isolatietest voor één vezel voor de beoordeling van oxidatieve myovezelgedrag
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.