Een driedimensionaal kweekmodel dat de ontwikkeling van de menselijke secundaire tot antrale follikel in vitro ondersteunt

Samenvatting

Deze studie stelde een driedimensionaal (3D) kweekmodel vast dat de ontwikkeling van de menselijke follikel van het secundaire naar het antrale stadium in vitro ondersteunt. Dit systeem maakt follikelgroei en antrumvorming mogelijk, terwijl somatische moleculaire kenmerken van cellen behouden blijven, en vormt een cruciaal model voor onderzoek naar de menselijke folliculogenese.

Samenvatting

Humane ovariumfolliculogenese is een complex, streng gereguleerd proces dat moeilijk direct in vivo te bestuderen is. Hoewel in vitro modellen essentieel zijn voor mechanistisch onderzoek, blijven bestaande systemen suboptimaal omdat ze de ruimtelijk-temporele dynamiek van follikelontwikkeling niet kunnen recapituleren. Deze studie presenteert een 3D-kweekmodel dat de ontwikkeling van de menselijke follikel ondersteunt van het secundaire naar het antrale stadium. Dit model herhaalt met succes belangrijke morfologische gebeurtenissen in vivo , waaronder aanhoudende follikelgroei, een duidelijke diameter expansiefase vanaf dag 10 en de vorming van de antrale holte rond dag 20. Belangrijk is dat deze ontwikkelingsprogressie culmineerde in het succesvol terughalen van levensvatbare eicellen in het kiemblaasje (GV)-stadium. Bovendien toonde immunofluorescentieanalyse duidelijke expressiepatronen van gonadotropinereceptoren in somatische cellen, wat overeenkomt met de identiteit van granulosa en theca-cellen. Binnenste granulosa-achtige cellen vertoonden een hoge follikelstimulerende hormoonreceptor (FSHR), terwijl de buitenste theca-achtige cellen een hoge expressie van de luteïniserende hormoonreceptor (LHR) vertoonden. Dit model biedt een waardevol platform voor het bestuderen van de menselijke folliculogenese en voortplantingstoxicologie en biedt een referentie voor het optimaliseren van in vitro follikelkweeksystemen voor de ontwikkeling van het secundaire tot antrale stadium.

Inleiding

Het fysiologische proces van de ontwikkeling van de eierstokfollikels, van het primordiale tot het preovulatoire stadium, is fundamenteel voor vrouwelijke vruchtbaarheid¹. Dit proces omvat een sterk gecoördineerde reeks gebeurtenissen, waaronder oocytgroei/rijping en granulosacelproliferatie/differentiatie². Verstoringen in deze ingewikkelde mechanismen vormen een belangrijke oorzaak van onvruchtbaarheid en eierstokstoornissen. Een gedetailleerd begrip van de regulerende netwerken die ten grondslag liggen aan folliculogenese — waaronder paracriene signalering, oocyt-somatische celinteracties en extracellulaire matrixdynamiek — is daarom van cruciaal pathofysiologisch belang. Echter, direct onderzoek naar de menselijke folliculogenese in vivo blijft beperkt door ethische en praktische beperkingen, wat de noodzaak van betrouwbare in vitro modellen om deze mechanismen te verduidelijken drijft. Ondanks vooruitgang blijft er een kritisch gebrek aan een langetermijnkweekmodel dat de ontwikkeling van menselijke follikels ondersteunt, met name van het secundaire tot het antrale stadium.

Hoewel de menselijke follikelcultuur in tweedimensionale (2D) of driedimensionale (3D) matrices een geavanceerd begrip heeft van vroege follikelontwikkeling ^3,4, blijven dergelijke systemen beperkt in het ondersteunen van progressie naar latere stadia. Het is opmerkelijk dat het bereiken van humane folliculogenese in vitro tot latere ontwikkelingsstadia bijzonder uitdagend blijft vanwege hun grotere follikelgrootte en de verlengde rijpingstijd. Zelfs onder het beperkte aantal menselijke in vitro follikelkweeksystemen die met succes MII-oocyten hebben opgeleverd, blijven de rijpingspercentages laag (maximaal ongeveer 20^%). Misschien is een fundamentelere uitdaging de recapitulatie van de secundaire naar antrale overgang, een kritische en structureel complexe fase die nog niet adequaat in vitro is gemodelleerd.

Deze studie stelde een 3D-kweekmodel vast dat de in vitro ontwikkeling ondersteunt van menselijke secundaire follikels tot antrale follikels met duidelijke holtestructuren. Dit model biedt een fundamenteel platform voor verder onderzoek naar de regulerende mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van menselijke follikels en dient als referentie voor toekomstige optimalisatie van follikelkweeksystemen gericht op secundaire tot antrale ontwikkeling.

Protocol

Dit studieprotocol werd beoordeeld en goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Derde Ziekenhuis van de Universiteit van Peking (Goedkeuring nr. M2024151). Alle wettelijke voogden van minderjarigen die aan het onderzoek deelnemen, hebben het formulier voor geïnformeerde toestemming ondertekend.

Weefselbron
Het humane ovariummergelweefsel dat in dit protocol wordt gebruikt, is verkregen van vier pediatrische patiënten met de diagnose ovariumteratoom (leeftijd 2, 6, 13 en 16 jaar) die eierstokweefsel doneerden voor onderzoeksdoeleinden (Tabel 1). De ovariumcortex werd gebruikt voor cryopreservatiestudies van eierstokweefsel, terwijl het resterende medullaire weefsel werd gebruikt voor in vitro follikelkweek in deze studie. In totaal werden 33 secundaire follikels geïsoleerd, waarvan 16 follikels aan de controlegroep en 17 aan de 3D-kweekgroep werden toegewezen.

Bereiding van reagens
Het transportmedium bestond uit Leibovitz' L-15 medium, aangevuld met 10% serumsubstitutiesupplement, en werd opgeslagen bij 4 °C. De volledige verteringsoplossing werd bereid door MEMα aan te vullen met 0,04 mg/mL Liberase DH, 10 IU/mL DNase I en 100 IE/mL penicilline-streptomycine en opgeslagen bij -20 °C. De digestiestopoplossing werd DPBS aangevuld met 10% serumvervanger en bewaard bij 4 °C. Het complete groeimedium werd bereid door MEMα te suppleten met 10% serumvervangersupplement, 1% insuline-transferrine-selenium, 50 μg/mL L-ascorbinezuur, 2 mM natriumpyruvaat en 100 IU/mL penicilline-streptomycine. Het medium werd opgeslagen bij 4 °C. Recombinant humaan follikelstimulerend hormoon (FSH) werd toegevoegd aan een uiteindelijke concentratie van 100 mIU/mL bij kweekstart, zoals beschreven in een eerdere studie¹⁰. Bij visuele detectie van vroege antrumvorming (rond dag 20) werd recombinant humaan luteïniserend hormoon (LH) aangevuld met een uiteindelijke concentratie van 10 mIU/mL tijdens mediumwisselingen. De vaste kweekmatrix werd bereid door 70% (v/v) basalmembraanmatrix te mengen met 30% (v/v) ijskoud volledig groeimedium en werd tijdens alle behandelingsstappen op ijs gehouden.

Weefselvertering en isolatie van secundaire follikels
Eierstokweefsel werd in transportmedium geplaatst en naar het laboratorium gebracht bij 4 °C. Onder steriele omstandigheden werd de ovariummedulla met een scalpel ontleed. Het weefsel werd in dunne stukken gesneden (~3 × 3 × 1 mm) en verder gehakt in kleine fragmenten (~0,5 × 0,5 × 1 mm) met een weefselhaker, waardoor het weefsel overal vochtig bleef. Het gehakte weefsel werd overgebracht naar een schaaltje van 35 mm, en een voorverwarmde volledige verteringsoplossing werd toegevoegd met 2 ml per 100 mg weefsel. De incubatie vond plaats bij 37 °C gedurende 45–80 minuten (gemiddelde: 60 ± 15 minuten), met voorzichtig mengen elke 10 minuten. De spijsvertering werd beëindigd toen microscopisch onderzoek losmaking van de stromale matrix en het vrijkomen van individuele follikels aantoonde (Figuur 1). Gezonde secundaire follikels (diameter 100–200 μm, met ≥ 2 granulosa-cellagen en een zichtbare oocyt) werden geselecteerd onder een stereomicroscoop met een glazen mondgestuurde pipet (binnendiameter 200 μm) en tweemaal gewassen met voorverwarmd volledig groeimedium.

3D-embedding en langdurige cultuur
Een celkweekinzet werd in een 35 mm schaal geplaatst, bevochtigd met 2 mL complete groeimedium en voorgebalanceerd in een broedmachine (37 °C, 5% CO₂) gedurende 2 uur. Geselecteerde secundaire follikels werden in de insert geplaatst en 's nachts onder dezelfde omstandigheden voorgekweekt. Aan het einde van de pre-kweek werden follikels in de controlegroep direct binnen de insert gekweekt (2D-kweek). Daarentegen werden follikels die voor de 3D-cultuurgroep waren aangewezen voorbereid voor inbedding in een groeifactor-gereduceerde basaalmembraanmatrix (totaal eiwit 8~12 mg/mL). De matrix werd ontdooid op ijs en gemengd met 30% (v/v) ijskoud volledig groeimedium. Druppels van 40 μL van het mengsel werden in een schaal van 35 mm geplaatst (maximaal zes druppels per schaal), om een uniforme gellaag van ongeveer 1,5 mm hoog te vormen. Vervolgens werd één secundaire follikel in elke druppel overgebracht met een glazen mondgestuurde pipet, zorgvuldig geplaatst in het midden tot het bovenste derde deel van de druppel om te voorkomen dat deze zou zinken. De schaal werd 30 minuten in een broedmachine geplaatst (37 °C, 5% CO₂) om gelatie mogelijk te maken. Na het stollen werd 2 mL volledig groeimedium voorzichtig aan het gerecht toegevoegd om langdurige kweek te starten.

Cultuuronderhoud en monitoring
Elke 48 uur werd een mediumwissel van 50% uitgevoerd met vers volledig groeimedium (met FSH). De follikels werden dagelijks onder een stereomicroscoop geobserveerd en hun diameters en morfologische kenmerken werden geregistreerd. Bij visuele detectie van vroege antrumvorming (rond dag 20) werd recombinant menselijk LH aan het medium toegevoegd tijdens latere veranderingen. De kweek werd tot 30 dagen gehandhaafd of totdat de follikels het antrale stadium bereikten (diameter > 400 μm met een duidelijk afgebakende vloeistofgevulde holte).

Post-cultuurceldissociatie
Aan het einde van de kweek werden de antrale follikels overgebracht naar een schaaltje met verse DPBS en mechanisch gedissocieerd met een steriele 29-gauge spuit. De geïsoleerde cumulus-oocytcomplexen (COCs) werden overgebracht naar een aparte schaal voor verdere analyse. De resterende granulosa en thecacel-suspension werden overgebracht naar een nieuwe 35 mm schotel met 2 mL voorverwarmd volledig groeimedium, zachtjes gedraaid voor gelijkmatige verdeling, en geïncubeerd gedurende 48 uur (37 °C, 5% CO₂).

Immunofluorescentieanalyse
Na de kweek werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de monsters drie keer gewassen met PBS, permeabiliseerd met 0,5% Triton X-100 gedurende 20 minuten, en vervolgens 's nachts geblokkeerd bij 4 °C met 1% BSA in PBS. Cellen werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antistoffen. De primaire gebruikte antilichamen waren anti-FSHR (konijn, 1:200) en anti-LHR (muis, 1:100). Na de incubatie werden de cellen drie keer gedurende 15 minuten gewassen met PBS die 1% BSA bevatte. Vervolgens werden ze 2 uur lang geïncubeerd met fluorescerende secundaire antilichamen (anti-konijn en anti-muis, 1:200) bij kamertemperatuur in het donker. Ten slotte ondergingen de cellen drie laatste wasbeurten, elk van 20 minuten. De kernen werden 5 minuten bij kamertemperatuur met DAPI gekleurd. Daarna werden de monsters drie keer gedurende 5 minuten gewassen met PBS die 1% BSA bevatte. De beeldvorming werd uitgevoerd met een Operetta CLS high-content imaging systeem in confocale modus. Fluorescentiesignalen werden vastgelegd met de volgende kanalen: DAPI (405 nm), Alexa Fluor 488 (LHR) en Alexa Fluor 647 (FSHR), met consistente belichtingsinstellingen over alle monsters.

Statistische analyse
Vergelijkingen van de follikeldiameter tussen de controlegroep en de 3D-kweekgroep op dag 5, 10 en 15 werden uitgevoerd met behulp van een onafhankelijke t-test van monsters. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Een statistische analyse van de follikeldiameter werd niet uitgevoerd na dag 15, omdat bijna alle follikels in de controlegroep na dag 15 niet overleefden. Dit resulteerde in een onvoldoende steekproefgrootte, waardoor betrouwbare en betekenisvolle groepsvergelijkingen onmogelijk werden. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism (versie 9.0).

Resultaten

Ontwikkeling van een 3D-kweekmodel dat de groei van de menselijke follikel tot het antrale stadium ondersteunt.
Een grote uitdaging in het onderzoek naar eierstokfollikels is het ontwikkelen van een in vitro kweeksysteem dat de volledige follikelontwikkeling ondersteunt, waarbij antrale holtevorming een belangrijke mijlpaal is. Daarom heeft deze studie een 3D-kweekmodel voor menselijke follikels in vitro vastgesteld (Figuur 2

Discussie

Het succesvolle onderhoud van de menselijke ovariumfollikels in vitro door de overgang van secundair naar antral vertegenwoordigt een belangrijke technische vooruitgang. In deze studie maakte een 3D-kweeksysteem dat passende biofysische ondersteuning en stadia-specifieke hormonale signalen bood, deze progressie mogelijk. Deze resultaten komen overeen met recent bewijs dat de noodzaak van 3D-kweeksystemen onderstreept om weefselfysiologie te recapituleren. Hoewel conventionele 2D...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anti-FSHR	HuaBio	ER1909-08
Anti-LHR	Santa Cruz	sc-293165
Anti-mouse(secundair)	Abcam	AB150113
Anti-rabbit(secundair)	Abcam	AB205718
Basmambraan matrix voor organoïdcultuur	MCE	K6004
BSA	Sigma	A1933
Celcultuur inzet	Millipore	PICMORG50
Kweekschaal	Corning	430165
DAPI	Beyotime	C1006
DNase I	Thermo	EN0525
DPBS	Gibco	14190144
FSH	Merck	F4021
Incubator	Thermo	Heracell 3111
Insulin-Transferrine-Selenium	Gibco	41400045
L-Ascorbic acid	MCE	HY-B0166
Leibovitz's L-15 medium	Gibco	11415064
LH	Merck	L6420
Liberase DH	Roche	5401054001
McIlwain weefselsnijder	Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.	MP10180-220
MEMα	Gibco	41061029
Paraformaldehyde	Solarbio	P1110
PBS	Gibco	10010023
Penicilline-Streptomycine	Gibco	15140122
Serumvervangende supplement	FUJiFILM Irvine	90194
Natriumpyrovaat	Gibco	11360070
Stereomicroscoop	Nikon	SMZ1270
Het hoge-inhoud beeldvormingssysteem	PerkinElmer	Operetta CLS
Triton X-100	Sigma	X100