Groene synthese van goud- en zilvernanodeeltjes met behulp van plantextracten, schimmelfiltraten en bacterieculturen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft reproduceerbare groene synthesemethoden voor het vervaardigen van goud- en zilverdeeltjes met behulp van plantaardige extracten, schimmelfiltraten en bacteriële culturen, gevolgd door nanodeeltjesbevestiging via ultraviolet-zichtbare spectroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie.

Samenvatting

Groene synthese van metaalnanodeeltjes (NP's) met behulp van biologische systemen biedt een duurzaam alternatief voor conventionele chemische fabricagemethoden. Dit protocol biedt reproduceerbare experimentele en analytische procedures voor de synthese van goud (Au) en zilver (Ag) NP's met behulp van bacteriële culturen, schimmelfiltraten en plantenbladextracten als reducerende en stabiliserende middelen. AgNP's werden gesynthetiseerd met extracten van Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera en Earliella sp., met karakteristieke ultraviolet-zichtbare (UV–Vis) absorptiebanden tussen 405 en 425 nm die NP-vorming bevestigden. Er werd een design-of-experiment-benadering geïmplementeerd om de invloed van omgevingsfactoren, waaronder zuurstofcondities, pH, Au-concentratie, celconcentratie, type elektrondonor en temperatuur, op de synthese van AuNP's door Shewanella oneidensis en Cupriavidus metallidurans te evalueren. Onder ideale omstandigheden (0,2 mM Au en pH 5) produceerde S. oneidensis voornamelijk bolvormige AuNP's met een gemiddelde grootte van 43,6 ± 11,0 nm en een karakteristieke absorptiepiek van 520 nm. NP-vorming en morfologie werden bevestigd met UV–Vis-spectroscopie en transmissie-elektronenmicroscopie. Deze workflow biedt een reproduceerbaar platform voor biogene NP-synthese en ondersteunt toepassingen in biosensing, bioremediatie en antimicrobiële technologieën.

Inleiding

Metalen nanodeeltjes (NP's) bezitten unieke fysisch-chemische eigenschappen die verband houden met hun grote oppervlakte, waaronder kenmerkend elektronisch, magnetisch en katalytisch gedrag, evenals hoge reactiviteit. Deze eigenschappen hebben hun toepassing in meerdere vakgebieden bevorderd, waaronder geneeskunde voor ziektediagnose en medicijnafgifte ^1,2,3,4,5,6, cosmetica voor zonnebrandformuleringen⁷, elektronica voor transistors en zonnecellen⁸, milieutechniek voor waterzuivering ^2,9,10, en landbouw voor meststoffen en pesticiden^11,12. De voortdurende uitbreiding van NP-aanvragen over disciplines heen blijkt uit het toenemende aantal gerelateerde publicaties dat de afgelopen jaren is gerapporteerd:^13,14.

Synthetische methoden voor metalen NP's maken nauwkeurige controle mogelijk over belangrijke kenmerken zoals deeltjesgrootte, morfologie en stabiliteit, waardoor het syntheseproces een cruciale factor is voor NP-prestaties. Conventionele chemische synthesemethoden zijn uitgebreid geoptimaliseerd; ze bevatten echter vaak giftige reagentia, een hoog energieverbruik en verhoogde productiekosten^{van 14,15}. Deze beperkingen hebben de ontwikkeling van groenere en duurzamere alternatieven gestimuleerd. Groene synthesebenaderingen maken gebruik van biologische systemen zoals plantenextracten ^16,17, micro-organismen waaronder schimmels en bacteriën 18, en algen¹⁹ als natuurlijke reducerende en stabiliserende middelen. Tijdens deze processen worden metaalzouten gereduceerd tot nulvalente vormen, waardoor NP's ontstaan via milieuvriendelijke en kosteneffectieve routes. Daarnaast zijn biologisch gesynthetiseerde NP's vaak biocompatibel, wat hun gebruik in medische, agrarische en milieutoepassingen vergemakkelijkt ^8,14.

De keuze van een geschikte biologische route voor NP-synthese hangt af van de beoogde toepassing, evenals de beschikbare infrastructuur en operationele vereisten. Plantaardige synthese wordt over het algemeen geprefereerd voor snelle en goedkope productie van NP omdat dit minimale steriele behandeling vereist; echter, variabiliteit in de samenstelling van het extract kan de reproduceerbaarheid^{beïnvloeden 20,21}. Schimmelgemedieerde synthese kan hoge NP-opbrengsten en extracellulaire enzymen leveren die NP-stabilisatie en downstream verwerking verbeteren, hoewel deze aanpak langere kweekperiodes en gecontroleerde groeicondities vereist²². Daarentegen maken bacteriële systemen instelbare synthese mogelijk onder gedefinieerde metabole omstandigheden en snelle biomassaproductie, waardoor ze geschikt zijn voor mechanistische studies en NP-gerelateerde toepassingen²². Bacteriële synthese vereist echter vaak strikte aseptische omgang, gecontroleerde bioreactoromstandigheden en extra downstreamverwerking wanneer intracellulaire NP's worden teruggevonden^21,22.

Ondanks de genoemde voordelen blijven groene synthesemethoden uitdagingen ondervinden die samenhangen met reproduceerbaarheid en standaardisatie. Bovendien blijven gedetailleerde visuele stap-voor-stap protocollen voor de groene synthese van metalen NP's beperkt tot²³, wat de mogelijkheid van onderzoekers beperkt om bestaande methodologieën succesvol te reproduceren en toe te passen. Het doel van dit werk is het presenteren van reproduceerbare groene syntheseprotocollen voor goud (Au) en zilver (Ag) NP's met behulp van plantaardige extracten, schimmelfiltraten en bacteriële culturen. Specifiek werden waterige extracten van Psidium guayaquilensis en Acanthophora spicifera, extracellulaire schimmelfiltraten van Earliella sp., en bacteriële systemen met Shewanella oneidensis en Cupriavidus metallidurans gebruikt voor de NP-synthese. De gepresenteerde protocollen leggen de nadruk op kritieke stappen in de voorbereiding van biologische extracten, NP-synthese en voorlopige NP-karakterisering. Daarnaast integreert de workflow het ontwerp van experimenten, gestandaardiseerde voorbereidingsprocedures en in-line karakterisering om reproduceerbare en optimaliseerbare biogene NP-synthese te ondersteunen.

Protocol

Het onderzoek werd uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van de Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL, Ecuador). De plant-, algen- en schimmelbiomassa die in deze studie werd gebruikt, werd verzameld uit toegankelijke omgevingen en betrof geen beschermde soorten of beperkte gebieden. Volgens institutionele en nationale regelgeving waren er geen specifieke vergunningen vereist voor het verzamelen van vrij beschikbare biomassa onder deze voorwaarden. Zie Figuur 1 voor de geïntegreerde experimentele workflow die wordt gebruikt voor groene synthese van AgNP's en AuNP's met behulp van plantaardige, alge, schimmel- en bacteriële biologische systemen.

Figuur 1: Geïntegreerde workflow voor groene synthese van zilver (ag) en goud (Au) nanodeeltjes (NP's) met behulp van biologische systemen. Schema van de experimentele workflow voor de groene synthese van AgNP's en AuNP's met behulp van plantaardige, alge-, schimmel- en bacteriële systemen. De workflow illustreert de keuze van biologische bronnen, de bereiding van extracten of biomassa, reactie met metaalvoorlopers (AgNO₃ of HAuCl₄), reactiecondities en NP-vorming. De biologische systemen omvatten Psidium guayaquilensis bladextract, Acanthophora spicifera algextract, Earliella sp. extracellulair filtraat en Shewanella oneidensis MR-1 bacteriële culturen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Volg alle veiligheidsrichtlijnen van institutionele laboratoriums bij het hanteren van chemicaliën en biologische materialen. Raadpleeg veiligheidsgegevensbladen voor alle reagentia vóór gebruik.

1. Synthese van AgNP's met behulp van P. guayaquilensis-bladeren

1. Bladcollectie
   1. Verzamel verse bladeren van P. guayaquilensis tijdens het droge seizoen in Guayaquil, provincie Guayas, Ecuador (2°10′Z, 80°0′W).
      OPMERKING: Voucherexemplaren van deze endemische soort zijn gedeponeerd bij het GUAY Herbarium, Faculteit Natuurwetenschappen, Universiteit van Guayaquil, Ecuador, en bij het New York Botanical Garden (NYBG) STEERE HERBARIUM, New York, VS. Meer informatie is beschikbaar op: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. Bereiding van bladextract
   1. Was het verse plantmateriaal grondig met gedestilleerd water.
      OPMERKING: Zorg voor volledige verwijdering van oppervlakkige onzuiverheden.
   2. Droog de bladeren in een bakdroger met geforceerde luchtstroom bij 40°C.
      OPMERKING: Lage droogtemperaturen minimaliseren de afbraak van thermolabile organische verbindingen die betrokken zijn bij de Ag^+- reductie.
   3. Maal het gedroogde materiaal met een handmolen om een fijn poeder te verkrijgen.
   4. Suspendeer 10 g poedervormig materiaal in 200 ml gedestilleerd water.
   5. Verwarm de suspensie tot 70°C onder continu roeren gedurende 1 uur.
   6. Laat het extract afkoelen tot kamertemperatuur (RT, ~28°C).
   7. Filter het extract onder vacuüm met kwalitatief filterpapier (Graad 1, poriegrootte 11 μm, diameter 110 mm).
      OPMERKING: Verwijder alle vaste resten uit het plantmateriaal.
   8. Bewaar het gefilterde extract bij 4°C in amberkleurige flessen tot verder gebruik.
3. Fabricage van fytogene AgNP's met bladextracten
   OPMERKING: Tijdens optimalisatie-experimenten varieer je één parameter per assay terwijl de resterende parameters constant blijven. Evalueer de concentratie zilvernitraat (AgNO₃) (1–5 mM), extractfractie (10%–50% v/v), reactietijd (0,5–1 uur) en temperatuur (25°C–80°C). Optimaliseer syntheseparameters met behulp van responsoppervlaktemethodologie gebaseerd op een centrale samengestelde DoE. Bestudeer elke factor op vijf niveaus (-α, -1, 0, +1 en +α). Gebruik de golflengte van de oppervlakteplasmonresonantie (SPR) piek (λ_SPR), die correleert met de NP-grootte, als responsvariabele²⁴. Het experimentele ontwerp bestaat uit 16 factoriale punten, 8 axiale punten en 5 centraalpuntreplicata, wat resulteert in in totaal 29 experimenten.
   1. Bereid AgNO-3-oplossingen voor door de juiste massa van AgNO-3 op te lossen in gedestilleerd water om concentraties tussen 1 en 5 mM te verkrijgen.
      VOORZICHTIG: AgNO₃ is corrosief en een sterk oxiderend middel dat huid- en oogirritatie kan veroorzaken. Draag passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en oogbescherming. Vermijd blootstelling aan licht en voer afval met landbouw af volgens de veiligheidsrichtlijnen van de institution.
   2. Meng de AgNO_3-oplossing met het plantextract om extractfracties tussen 10% en 50% (v/v) te verkrijgen.
   3. Verhit en roer het reactiemengsel op de gekozen temperatuur (25°C–80°C) voor de gewenste reactietijd (0,5–1 uur).
   4. Laat het reactiemengsel 24 uur op RT staan.
   5. Centrifugeer het bruine reactiemengsel op 1660 × g gedurende 15 minuten bij RT. Gooi het supernatant weg en verzamel de vaste fractie.
   6. Droog de teruggewonnen NP's in een oven op 60°C.

2. Synthese van AgNP's met behulp van A. spicifera alge-extracten

1. Algencollectie
   1. Verzamel A. spicifera-algen in Valdivia, provincie Santa Elena, Ecuador (1°57′23.91′′Z, 80°43′51.33′W).
2. Bereiding van algextract
   1. Bereid het algenextract voor door de procedure te volgen die in stap 1.2 is beschreven. Vervang de bladeren van de plant door biomassa van A. spicifera-algen .
3. Fabricage van fycogene AgNP's met alge-extracten
   OPMERKING: Voer een reeks van 12 experimenten uit door één parameter tegelijk te variëren terwijl de resterende parameters constant blijven. Evalueer de AgNO_{3-concentratie} (1–5 mM), extractfractie (5%–25% v/v), reactietijd (1–4 uur) en temperatuur (25°C–70°C).
   1. Bereid de AgNO_{3-oplossingen} en algenextract voor zoals beschreven in stappen 1.3.1 en 2.2.
   2. Meng de AgNO-3-oplossing met het algextract om een extractfractie van 5%–25% (v/v) te verkrijgen. Verhit en roer het reactiemengsel op de gekozen temperatuur (25°C–70°C) voor de gewenste reactietijd (1–4 uur).
   3. Laat de oplossing 24 uur afkoelen tot RT. Verzamel de vaste fractie na centrifugatie en droog deze in een oven zoals beschreven in stappen 1.3.5 en 1.3.6.

3. Synthese van AgNP's met behulp van Earliella sp.

1. Cultuurverzameling en onderhoud
   1. Actief groeiende myceliale fragmenten van Earliella sp. overbrengen op aardappel dextrose agarplaten.
      OPMERKING: De schimmelstam die in deze studie werd gebruikt, werd geïsoleerd uit milieumonsters die op de campus van ESPOL, Ecuador, zijn verzameld. Het isolaat werd taxonomisch geïdentificeerd op basis van morfologische kenmerken en bewaard in de kweekcollectie van het Biotechnologisch Onderzoekscentrum van Ecuador (CIBE, ESPOL) onder de interne code E2. Omdat deze stam wordt bewaard in een institutionele collectie en niet is gedeponeerd in een internationaal depot, is er geen RRID- of extern toegangsnummer beschikbaar.
   2. Breng de platen 48 uur uit bij 28°C.
   3. Breng een myceliaal fragment over in aardappeldextrosebouillon en broed de cultuur onder constante beweging op 150 toeren per minuut gedurende 5 dagen.
      OPMERKING: Deze stap bevordert de productie van biomassa en de secretie van extracellulaire metabolieten.
   4. Filter de schimmelcultuur door steriel filterpapier om de myceliale biomassa te scheiden van de extracellulaire bouillon. Verzamel het filtraat voor de volgende NP-synthese.
      OPMERKING: De extracellulaire bouillon bevat biomoleculen die fungeren als reducerende en stabiliserende middelen tijdens de AgNP-synthese.
2. Fabricage van mycogene AgNP's
   OPMERKING: Genereer 14 experimentele voorwaarden door per assay één parameter te variëren, terwijl de volumeverhoudingen tussen de schimmelbouillon en de AgNO_3-oplossing constant worden gehandhaafd. Evalueer de AgNO_{3-concentratie} (1–10 mM), pH (4–10 aangepast met HCl of NaOH), reactietijd (1–4 uur) en temperatuur (25°C–70°C).
   VOORZICHTIG: zoutzuur (HCl) en natriumhydroxide (NaOH) zijn zeer corrosief. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en voer de pH-aanpassingen langzaam uit onder continu roeren om spetteren en lokale oververhitting te voorkomen. Gebruik 1 M zuur of basen tijdens de pH-instelling.
   1. Meng de schimmelachtige extracellulaire bouillon met een_{AgNO3-oplossing} bij de gewenste concentratie (1–10 mM) met een volumeverhouding tussen 2,5% en 10% (v/v) om een eindreactievolume van 50 mL te verkrijgen. Pas het uiteindelijke reactievolume aan volgens de geteste experimentele conditie.
   2. Roer het reactiemengsel op de gekozen temperatuur (25°C–70°C) voor de gewenste reactietijd (1–4 uur). Laat de oplossing 24 uur afkoelen tot RT. Verzamel de vaste fractie na centrifugatie en droog deze in een oven zoals beschreven in stappen 1.3.5 en 1.3.6.

4. Synthese van AuNP's met behulp van C. metallidurans en S. oneidensis

1. Cultuurverzameling en onderhoud
   1. Inoculeer bevroren celvoorraden die in 20% glycerol zijn bewaard bij −80°C van C. metallidurans CH34 of S. oneidensis MR-1 op tryptische sojaagarplaten onder aerobe omstandigheden. Breng de platen uit bij 28°C gedurende 24 uur.
   2. Selecteer een individuele kolonie van elke plaat en inoculeer deze in 250 ml tryptische sojabouillon onder aerobe omstandigheden. Incubeer de cultuur bij 28°C in een roterende shaker die werkt op 120 tpm.
   3. Oogst de cellen in de stationaire fase na 72 uur incubatie, wanneer de optische dichtheid bij 610 nm (OD₆₁₀) ongeveer 1 bereikt. Centrifugeer de culturen op 10.000 × g gedurende 10 minuten bij ~20°C.
   4. Was de verzamelde pellets twee keer met steriele 0,9% (met v) NaCl-oplossing. Concentreer de gewassen cellen op een OD_610-waarde van ongeveer 7.
   5. Genereer anoxische geconcentreerde celvoorraden door de suspenties te ontgassen en de headspace te vullen met N_2-gas .
2. Fabricage van bacteriogene AuNP's
   OPMERKING: Gebruik een fractioneel-factoriële matrix om de invloed van omgevingsfactoren op AuNP-synthese te evalueren²⁵. Bouw de matrix op met 7 factoren op 2 niveaus die volgens eerdere studies zijn geselecteerd^26,27. Rangschik de experimenten in een orthogonale matrix en randomiseer de volgorde van experimenten om trial-combinatiebias te minimaliseren. De resulterende experimentele volgorde wordt gepresenteerd in Tabel 1.
   1. Los goudchloridetrihydraat (HAuCl₄) op in gedeïoniseerd water om een bouillonoplossing te maken bij 5 g L⁻¹.
      VOORZICHTIG: HAuCl₄ is giftig en een sterk oxiderend middel. Behandel alle oplossingen in een gecertificeerde chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, waaronder een labjas, handschoenen en veiligheidsbril. Vermijd contact met organisch materiaal en voer afval af volgens institutionele protocollen voor gevaarlijk afval.
   2. Bereid de experimentele reactoren voor door de voorraadoplossing te verdunnen tot de streefwaarde in 0,9% (w/v) NaCl-oplossing en de pH aan te passen volgens de experimentele omstandigheden in Tabel 1.
   3. Doeer 50 mL van de voorbereide metalen oplossing in schone 120 mL serumflessen. Sluit elke fles onmiddellijk af met een butylrubberen stop.
   4. Zet de stop vast met een aluminium krimpafdichting en een handkrimp. Steriliseer de verzegelde serumflessen door te autoclaveren bij 121°C gedurende 21 minuten.
   5. Laat de flessen afkoelen tot RT en inspecteer elke fles visueel op neerslag.
      OPMERKING: Gooi alle flessen met zichtbare neerslag weg en bereid vervangende reactoren voor.
   6. Vestiging van anoxische aandoeningen
      1. Verbind elke gesteriliseerde serumfles met een gasmanifoldsysteem uitgerust met een hoogzuivere stikstofbron (N₂) en een vacuümpomp.
      2. Genereer een anoxische headspace door 21 opeenvolgende purgecycli uit te voeren voor elke reactor die anoxische omstandigheden vereist volgens Tabel 1. Breng tijdens elke cyclus vacuüm aan, gevolgd door stikstofopvulling gedurende ongeveer 30 seconden totdat de interne druk terugkeert naar ongeveer atmosferische druk (~1 atm).
         OPMERKING: Directe verificatie van anoxische aandoeningen is niet vereist; echter, headspace-gasanalyse, zoals gaschromatografie, kan worden gebruikt om de verwijdering van zuurstof te bevestigen wanneer dat nodig is.
         VOORZICHTIG: Stikstofgas kan zuurstof verdringen en een verstikkingsgevaar vormen in afgesloten ruimtes. Zorg voor voldoende laboratoriumventilatie en controleer de veilige gasleidingverbindingen vóór gebruik.
      3. Houd de reactoren na de laatste spoelcyclus onder een lichte positieve N_2-druk .
      4. Label de reactoren van 1–8 volgens de experimentele volgorde. Label bijvoorbeeld de vijfde experimentele voorwaarde als R5.
   7. Toevoeging van elektronendonoren en inoculatie
      1. Injecteer het benodigde volume steriele anoxische vloeibare elektronendonoroplossing, zoals natriumlactaat, in de vloeibare fase van de aangewezen reactoren volgens Tabel 1 met behulp van een steriele spuit en naald.
      2. Injecteer het benodigde volume gasvormige elektronendonor, zoals_H2, in de aangewezen reactorheadspace met behulp van een gasdichte spuit.
      3. Inoculeer alle biotische reactoren door aseptisch het benodigde volume geconcentreerde anoxische microbiële voorraadcultuur in de vloeibare fase te injecteren.
         OPMERKING: Bewaar geconcentreerde voorraadculturen bij 4°C vóór de inoculatie om de cellevensvatbaarheid te behouden.
   8. Opzet van controleexperimenten
      1. Bereid een abiotische controle voor door alle stappen te volgen die in stap 4.2 zijn beschreven, terwijl het microbieel inoculum wordt vervangen door een gelijkwaardig volume steriel anoxisch kweekmedium of buffer.
      2. Bereid een controle tegen gedode cellen voor door alle stappen te volgen zoals beschreven in Stap 4.2 met een inoculum dat gesteriliseerd is door autoclaven.
         OPMERKING: Gebruik de controles om rekening te houden met abiotische metaalreductie en biosorptie. Bereid de controle over gedode cellen voor door levensvatbare celvoorraden te autoklaveren bij 121°C gedurende 21 minuten om de bijdrage van actieve microbiële mechanismen te evalueren.
   9. Incubatie en Reactietijd
      1. Plaats alle serumflessen in temperatuurgecontroleerde broedmachines.
      2. Pas de incubatietemperatuur aan volgens de experimentele omstandigheden die in Tabel 1 zijn gespecificeerd.
      3. Plaats de incubators op roterende shakerplatforms en incubeer de reactoren op 120 rpm.
      4. Laat de reacties 72 uur doorgaan.
         OPMERKING: Pauzeer het experiment na de incubatie en bewaar de serumflessen bij 4°C tot de monsterverwerking.
         OPMERKING: Kwantificeer eventueel restopgelost metaal na NP-biosynthese met inductief gekoppelde plasma optische emissiespectroscopie om de efficiëntie van metaalverwijdering te evalueren en NP-vorming te onderscheiden van residuele opgeloste stoffen.
3. Replicatie van optimale omstandigheden
   1. Identificeer de reactorconditie die samenhangt met de maximale metaalverwijdering na primaire screening en data-analyse.
   2. Repliceer de geselecteerde optimale conditie in drie onafhankelijke reactorflessen om reproduceerbaarheid te bevestigen.
   3. Voer de voorbereidings-, reactoropstelling en incubatieprocedures uit voor de triplicate verificatie-experimenten volgens stappen 4.1 en 4.2.
      OPMERKING: Na voltooiing van de experimenten wordt alle opgeloste oplossingen tijdelijk opgeslagen en gelabeld als waterig afval totdat ze worden verwijderd door gecertificeerde afvalbeheerbedrijven volgens de nationale Organische Milieucode en de technische richtlijnen van de instellingen.

Reactor / Bacteriën	Temperatuur (°C)	Sfeer	Elektronendonor	Optische dichtheid (OD610)	pH	[Goud] (mM)
1 / CMC	37	N2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	N2	C3H5O3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / SOM	37	N2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H5O3−	1	5	2
7 / SOM	28	N2	C3H5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

Tabel 1: Fractioneel factorieel experimenteel ontwerp gebruikt voor bacteriogene AuNP-synthese. Deze tabel vat de experimentele voorwaarden samen die zijn geëvalueerd voor AuNP-synthese met behulp van S. oneidensis MR-1 (SOM) of C. metallidurans CH34 (CMC). Variabelen waren onder andere incubatietemperatuur, headspace-atmosfeer, elektronendonor, inoculum optische dichtheid (OD₆₁₀), oplossings-pH en initiële Au³⁺ concentratie.

5. Karakterisering van AgNP's en AuNP's

OPMERKING: Gebruik ultraviolet-zichtbare (UV–Vis) spectroscopie als toegankelijke methode om NP-vorming te bevestigen via oppervlakteplasmonresonantie. Gebruik transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om NP-morfologie en -grootte direct te evalueren. Aanvullende fysisch-chemische karakterisering kan worden uitgevoerd met complementaire technieken zoals dynamische lichtverstrooiing (DLS), röntgendiffractie (XRD), Fouriertransformatie infrarood (FTIR) spectroscopie en energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDS) om de grootteverdeling, kristalliniteit, oppervlaktechemie en elementaire samenstelling te evalueren wanneer een meer uitgebreide karakterisering vereist is^28,29.

1. UV–Vis spectroscopie
   1. Instrumentopstelling
      1. Zet de UV–Vis spectrofotometer aan en laat het instrument minstens 15 minuten opwarmen om signaalstabiliteit te waarborgen.
      2. Selecteer spectrale scanmodus en configureer het golflengtebereik van 300 tot 800 nm met een data-interval van 1 nm.
2. Monstervoorbereiding
   1. Verzamel aliquots van vers gesynthetiseerde AgNP- of AuNP-ophangingen. Verdun de monsters indien nodig met gedestilleerd water om de absorptiewaarden binnen het lineaire detectiebereik te behouden.
3. UV–Vis-meting van NP's
   1. Voer de basiscorrectie uit met gedestilleerd water als blanke oplossing.
   2. Breng het voorbereide monster over in een cuvet, plaats de cuvette in de monsterhouder en registreer het UV-Vis-spectrum over het bereik van 300–800 nm.
   3. Identificeer de SPR-band die overeenkomt met de NP-vorming.
      OPMERKING: AgNP's vertonen doorgaans SPR-banden tussen 405 en 425 nm, terwijl AuNP's doorgaans SPR-banden tussen 520 en 550 nm vertonen.
4. Transmissie-elektronenmicroscopie
   OPMERKING: Analyseer NP-morfologie en grootte met TEM die werkt op 80 kV en is uitgerust met een hoge-resolutie digitale camera.
   1. Breng 1,5 mL NP-suspensie over in een centrifugebuis en centrifugeer op 5000 × g gedurende 5 minuten bij RT.
   2. Gooi het supernatant weg en houd het pelletje vast.
   3. Voeg 1 ml fixatieoplossing met 4% paraformaldehyde en 5% glutaraldehyde, bereid in 0,1 M cacodylaatbuffer, toe aan de pellet. Incubeer het monster 25 uur bij RT. Was de pellet vervolgens een nacht met 0,1 M natriumcacodylaatbuffer.
   4. Centrifugeer het monster op 5000 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
   5. Voeg 1 ml 1% (w/v) osmiumtetroxide (OsO₄) toe, bereid in een 0,1 M natriumcacodylaatbuffer voor binding gedurende 3 uur.
      VOORZICHTIG: OsO₄ is zeer giftig en volatiel. Behandel alle oplossingen uitsluitend in een gecertificeerde chemische dampkap terwijl je passende persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, waaronder een labjas, handschoenen en veiligheidsbril.
   6. Centrifugeer het monster op 5000 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
   7. Dehydrateer het monster met een gegradueerde ethanolreeks. Voeg 50% ethanol toe en incubeer 15 minuten. Herhaal de procedure achtereenvolgens met 70% en 90%. Volledige uitdroging met drie opeenvolgende incubaties in absolute ethanol gedurende 30 minuten per incubatie.
   8. Zet de pellet in epoxyhars bij RT volgens de instructies van de fabrikant.
   9. Bereid halfdunne secties voor (~1 μm) en kleur de secties met toluidineblauw voor voorlopige observatie.
   10. Snijd ultradunne secties (~60 nm) met een diamantmes en kleur de secties met uranylacetaat gevolgd door loodcitraat.
   11. Monter de secties op TEM-roosters en laad ze in de transmissie-elektronenmicroscoop.
   12. Verkrijg TEM-beelden om NP-morfologie en grootte te evalueren.

Resultaten

AgNP's werden succesvol gesynthetiseerd via groene en biosynthetische routes met verschillende biologische reducerende middelen, en ideale synthesecondities werden voor elke methode vastgesteld. In de groene synthese, gemedieerd door P. guayaquilensis bladextract, bestonden de optimale omstandigheden uit een AgNO_{3-concentratie} van 5 mM, een extract-tot-metaaloplossingsverhouding van 25% (v/v), een reactietemperatuur van 80°C en een roertijd van 60 minuten gevolgd door...

Discussie

Bij het vergelijken van de geëvalueerde syntheseroutes op basis van haalbaarheid, NP-groottecontrole, operationele kosten, reproduceerbaarheid en algehele procesefficiëntie, toonde plantgemedieerde synthese met P. guayaquilensis-bladextract de gunstigste balans tussen de onderzochte AgNP-synthesemethoden. Dit protocol bood verbeterde controle over de NP-grootte door systematische optimalisatie en directe microscopische karakterisering, terwijl het onder milde omstandigheden werk...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Absolute ethanol	Merck	E7023	TEM dehydratatiereeks
Aluminum crimp seals	Dwk Wheaton	224178-01	Voor serumflessen
Amber glass bottles	Duran	2180154	Lichtbeschermde opslag
ATR-FTIR spectrofotometer	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectraalbereik: 300–3600 cm-1
Autoclaaf	Yamato	SM300	Sterilisatie bij 121 °C
Butylrubber stoppen	Dwk Kimble	73827-21	Gasdicht afsluiten
Centrifuge	BIOBASE	BKC-TH20RL	Centrifuge op het werkblad
Chloroaurinezuur trihydraat (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Goudprecursor
Diamantmes	Aurion	Dyatom 45	Ultradun TEM-slijpen
Gedestilleerd of gedeïoniseerd water	Methrom	N/A	Oplossingsbereiding
Epoxyhars (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	TEM-beddingsmedium
Filterpapier, kwalitatief Grade 1	Merck Whatman	WHA1001110	Poriëngrootte: 11 µm; diameter: 110 mm
Fouriertransformatie-infraroodspectrofotometer (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectraalbereik: 300–3600 cm-1
Gasverdeelsysteem	Op maat gemaakt	N/A	Voor purge-cycli
Gasdicht spuitje	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldehyde	VWR	219859510	5% glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	20% stockbewaring
Handcrimper	Biomed	USYGQ-20Z	Crimpverbinding van serumflessen
Handmolen/kever	Corona	L10000	Gronden van plantenbiomassa
Zoutzuur (HCl)	Merck	320331	pH-aanpassing
Waterstof (H2) gas	Linde	Industrieel niveau	Elektronendoorgevende gas
ICP-OES-systeem	Varian	Vista-MPX	Metaalkwantificering
Incubator	Memmert	SM 400	Temperatuurgestuurde incubatie
Laboratoriumoven	Barnstead	M100	Nanodeeltjes drogen
Loodcitraat	Merck	7398	TEM-kleuring
Salpeterzuur (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Zuur reagens
Stikstof (N2) gas	Linde	Industrieel niveau	Anoxieke omstandigheden
Osmiumtetroxide (OsO4)	Merck	201030	TEM-fixatie
Paraformaldehyde	VWR	101176-014	5% glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer
Aardappeldextroseagar (PDA)	Merck	110130	Schimmelkweek
Aardappeldextrosebouillon (PDB)	Merck	P6685	Microbiologisch medium
Roterende shaker	JoanLab	OS-20Pro	Incubatie bij gecontroleerde agitatie
Serumflessen (120 mL)	Wheaton	223748	Borosilicaatglas
Zilvernitraat (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	ACS reagens, ≥99,0%
Natriumcacodylaatbuffer	VWR	11650	5% glutaraldehyde, 4% paraformaldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer
Natriumchloride (NaCl)	Carl Roth	3957.1	0,9% wasoplossing
Natriumhydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	pH-aanpassing
Natriumlactaat	Sigma-Aldrich	L7022	Elektronendoorgevende/koolstofbron
Steriele spuiten en naalden	BD	Diverse	Steriele vloeistofverwerking
Roerplaat met hotplate	Biologix	01-310X	Verwarmen en agiteren
Toluidineblauw	EMS	DcU-10	Kleuring van semidunne secties
Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Uitgerust met digitale hoge resolutiecamera
Schaaldager met geforceerde luchtstroom	Handgemaakt	N/A	Biomassa drogen bij 40 °C
Tryptische soja-agar (TSA)	Oxoid	CM01301	Microbiologisch medium
Tryptische sojabouilion (TSB)	Carl Roth	X938.1	Microbiologisch medium
Uraanacetaat	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	TEM-kleuring
UV–Vis spectrofotometer	Thermo Scientific	Genesys 10S	UV–Vis spectraalanalyse
Vacuümpomp	KNF of gelijkwaardig	N 820 G	Voor anoxieke omstandigheden
Biologische materialen
Biologisch materiaal	Bron	Identifier	Opmerkingen/beschrijving
Acanthophora spicifera	Lokale verzameling	N/A	Mariene algenbiomassa
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	Bacteriestammetje
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	Instituut voor schimmelcollecties
Psidium guayaquilensis	Lokale verzameling	N/A	Wilde plantenbiomassa
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	Cultuurcollectiestam