Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
De studie omvatte het toedienen van methylnitrosourea aan C57BL/6-muizen om netvliesschade te veroorzaken, gevolgd door behandeling met ALDH2-activatoren en -remmers naast SIRT1- en endoplasmatische reticulumstress (ERS) modulatoren. Het protocol had als doel de beschermende effecten van deze behandelingen op retinale degeneratie en hun invloed op de aldehydestofwisseling te onderzoeken.
Deze studie onderzocht de beschermende effecten van activatie van aldehydedehydrogenase 2 (ALDH2) (via Alda-1), ALDH2-remming (via Daidzin) en de modulatie van sirtuin 1 (SIRT1) en endoplasmatische reticulumstress (ERS) op door methyl-nitrosourea (MNU)-geïnduceerde retinale schade bij C57BL/6-muizen. Tweeënzeventig muizen werden willekeurig toegewezen aan acht groepen, waaronder een controlegroep, een MNU-only groep en diverse combinatiegroepen van behandelingen. Muizen werden toegediend met intraperitoneale injecties van agonisten en remmers gericht op respectievelijk de ALDH2-SIRT1-ERS-as. Lichaamsgewicht, netvlieslaagdikte en biomarkers van aldehydemetabolisme werden op de tweede en vierde dag na de behandeling beoordeeld. Toediening van MNU induceerde retinale degeneratie, wat resulteerde in aanzienlijk gewichtsverlies in alle groepen behalve de controlegroep. Behandeling met Alda-1 verminderde netvliesbeschadiging, terwijl Daidzin het verergerde. Farmacologische remming van SIRT1 (via EX-527) verminderde de beschermende effecten van Alda-1, en ERS-inductie (via TUN) maakte de voordelen bijna volledig ongedaan. Omgekeerd verminderde activatie van SIRT1 (via SRT1720) de bijwerkingen van Daidzin, terwijl remming van ERS (via 4-PBA) de impact van Daidzin gedeeltelijk verlichtte. Bovendien verhoogde MNU de niveaus van aldehydemetabolismemarkers (malondialdehyde [MDA] en 4-hydroxy-2-nonenal [4-HNE]), waarbij Alda-1 deze niveaus verlaagde en Daidzin deze niveaus verhoogde. Daarnaast heeft farmacologische modulatie van de SIRT1/ERS-routes ingegrepen in de regulerende effecten van Alda-1 en Daidzin op het aldehydemetabolisme. Over het algemeen beschermde ALDH2-activatie de netvliesstructuur en reguleerde het aldehydemetabolisme, wat de cruciale rol van de ALDH2-SIRT1/ERS-signaalas bij het beperken van retinale degeneratie benadrukte.
Netvliesdegeneratie, een van de belangrijkste oorzaken van blindheid wereldwijd, omvat aandoeningen zoals retinitis pigmentosa (RP), leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD) en diabetische retinopathie (DR), die samen miljoenen individuen treffen en aanzienlijke sociaaleconomische lasten opleggen 1,2,3. Er is echter momenteel een gebrek aan zeer effectieve farmacologische therapieën om de progressie van deze verblindende netvliesziekten in de klinische praktijk te stoppen. De pathogenese van retinale degeneratie is multifactorieel en omvat oxidatieve stress, chronische ontsteking en endoplasmatische reticulumstress (ERS), wat de homeostase van netvliescellen verstoort. Deze stressfactoren worden vaak veroorzaakt door interne metabole ontregeling (bijv. mitochondriale disfunctie), wat uiteindelijk leidt tot apoptose en onomkeerbare netvliesbeschadiging4. Methyl-nitrosourea (MNU), een krachtig DNA-alkylerend middel, is uitgegroeid tot een veelgebruikte chemische inducer voor het modelleren van retinale degeneratie5. Het door MNU geïnduceerde netvliesziektemodel dient als een waardevol instrument voor het onderzoeken van ziektemechanismen en het evalueren van potentiële therapeutische interventies. Mechanistisch induceert MNU oxidatieve stress door reactieve zuurstofsoorten (ROS) te genereren en de redoxbalans te verstoren, waardoor fotoreceptormembranen en organellen beschadigd raken. Dit kan ook de aldehydestofwisseling beïnvloeden, waardoor de ontgifting van lipideperoxidatie wordt belemmerd. De daaropvolgende ophoping van giftige aldehyden kan oxidatieve schade verergeren, waardoor fotoreceptorapoptose6 wordt versterkt.
Aldehydedehydrogenase 2 (ALDH2), een mitochondriaal NAD+-afhankelijk enzym, speelt een cruciale rol bij het ontgiften van giftige aldehyden zoals 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) en malondialdehyde (MDA) door ze om te zetten in minder reactieve carbonzuren, waardoor oxidatieve schadewordt voorkomen. Robuuste ALDH2-activiteit is cruciaal voor het behouden van de redoxhomeostase, en een verminderde ALDH2-functie is in verband gebracht met versnelde veroudering en neurodegeneratieve pathologieën8. Farmacologische activatie van ALDH2, met name via de klein-molecuul agonist Alda-1, is aangetoond cytoprotectieve effecten te hebben in verschillende modellen 9,10. Sirtuin 1 (SIRT1), een nicotinamide-adeninedinucleotide + (NAD+)-afhankelijke deacetylase, reguleert stressreacties en energiemetabolisme door transcriptiefactoren te moduleren, waaronder p53 en Nuclear factor kappa B (NF-κB)11. SIRT1-activatie heeft veelbelovend gebleken in het bevorderen van mitochondriale functie en celoverleving, waarbij studies de upregulatie ervan koppelen aan verminderde oxidatieve schade en ontsteking bij retinale degeneratie12. Endoplasmatische reticulumstress (ERS), veroorzaakt door de ophoping van verkeerd gevouwen eiwitten, activeert de ongevouwen eiwitrespons (UPR), die onder chronische stress een pro-apoptotische cascade kan worden. ERS is in verband gebracht met retinale degeneratie, wat bijdraagt aan fotoreceptorapoptose13. Ondanks deze bevindingen is de specifieke wisselwerking tussen ALDH2, SIRT1 en ERS in de context van het door MNU geïnduceerde netvliesdegeneratiemodel nog slecht begrepen. Daarnaast vereisen de gecoördineerde rollen van deze onderling verbonden paden verder systematisch onderzoek.
Daarom was de huidige studie bedoeld om de effecten te onderzoeken van belangrijke componenten van de ALDH2-SIRT1-ERS-as—ALDH2 (via Alda-1 of Daidzin), SIRT1 (via SRT1720 of EX527) en ERS (via 4-PBA of TUN)—op door MNU veroorzaakte netvliesschade bij C57BL/6-muizen. Met behulp van histopathologische en biochemische analyses onderzochten we hoe het richten op deze as de overleving van fotoreceptoren en aldehydemetabolisme beïnvloedde. We stelden de hypothese op dat gecoördineerde activatie van ALDH2, versterking van SIRT1 en onderdrukking van ERS synergetisch door MNU-geïnduceerde retinale degeneratie zou verminderen, waardoor een rechtvaardiging zou worden gegeven om deze as aan te pakken bij retinale degeneratieve ziekten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Ethische verklaring
Alle experimentele protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door het Experimental Animal Care and Use Committee van het Fuzong Clinical Medical College van de Fujian Medical University en uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek.
Dieren en groepstoewijzing
In totaal werden 72 mannelijke C57BL/6 muizen (8–10 weken oud, lichaamsgewicht 20–25 g) verkregen van de gecertificeerde leverancier, volgens de nationale normen voor laboratoriumdierenfok. De muizen werden gehuisvest in individueel geventileerde kooien onder gestandaardiseerde omgevingsomstandigheden, waaronder een licht/donker-cyclus van 12 uur, gecontroleerde temperatuur (22 ± 2 °C) en relatieve luchtvochtigheid (50% ± 10%), met ad libitum toegang tot voedsel en water. Om de modulerende effecten van ALDH2, SIRT1 en ERS-routes op door MNU veroorzaakte netvliesschade te onderzoeken, werden de muizen willekeurig verdeeld over acht experimentele groepen (n = 9 per groep; n = 5 voor de tweede daggroep; n = 4 voor de groep op de vierde dag) met behulp van een computergegenereerde randomisatiesequentie om selectiebias te minimaliseren. De grafische samenvatting van de studie werd weergegeven in Figuur 1.
Bereiding en behandelingsschema's voor reagentia
De experimentele reagentia die in deze studie werden gebruikt, werden vermeld in de Materiaallijst, met gedetailleerde informatie over bereiding en dosering als volgt. (1) MNU (50 mg/kg): 100 mg MNU werd opgelost in 2 mL normale zoutoplossing om een oplossing van 50 mg/mL te bereiden. Vervolgens werd 1,4 mL van deze oplossing verdund met 5,6 mL normale zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg/mL voor dierlijke toediening. (2) Alda-1 (10 mg/kg): 50 mg Alda-1-poeder werd opgelost in 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) om een 50 mg/mL oplossing te bereiden, die werd verdund met 24 mL normale zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg/mL. (3) Daidzin (10 mg/kg): 50 mg Daidzinpoeder werd opgelost in 1 mL DMSO om een 50 mg/mL oplossing te bereiden, die vervolgens werd verdund met 24 mL normale zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg/mL. (4) EX-527 (10 mg/kg): 5 mg EX-527-poeder werd opgelost in 0,1 mL DMSO om een 50 mg/mL oplossing te bereiden, die werd verdund met 2,4 mL normale zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg/mL. (5) SRT1720 (10 mg/kg): 5 mg SRT1720 poeder werd opgelost in 0,1 mL DMSO en goed gemengd. Vervolgens werden 400 μL PEG300, 50 μL Tween-80 en 450 μL normale zoutoplossing toegevoegd om een werkoplossing van 2 mg/mL te bereiden. (6) TUN (10 mg/kg): 5 mg TUN-poeder werd opgelost in 0,1 mL DMSO om een oplossing van 50 mg/mL te bereiden, die vervolgens werd verdund met 2,4 mL normale zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 mg/mL. (7) 4-fenylbutyraat (4-PBA; 10 mg/kg): 2 mg 4-PBA-poeder werd opgelost in 1 mL normale zoutoplossing om een oplossing van 2 mg/mL te bereiden. Alle bovengenoemde toedieningsvolumes bedroegen 5 × M milliliter (waarbij M = dierlijk lichaamsgewicht in kg). Daarna werden de muizen verdeeld in acht groepen met de volgende behandelprotocollen:
Controlegroep: Een enkele intraperitoneale injectie van normale zoutoplossing.
MNU-groep: Een enkele intraperitoneale injectie van MNU.
MNU + Alda-1 groep: Intraperitoneale injectie van Alda-1, gevolgd door één toediening van MNU 2 uur later. Alda-1 werd vervolgens eenmaal dagelijks intraperitoneaal toegediend.
MNU + Daidzin-groep: intraperitoneale injectie van Daidzin, gevolgd door een enkele toediening van MNU-injectie 2 uur later. Daidzin werd vervolgens eenmaal per dag intraperitoneaal toegediend.
MNU + Alda-1 + EX-527 groep: Intraperitoneale injectie van Alda-1, gevolgd door EX-527 injectie 1 uur later, en MNU-injectie 1 uur daarna (enkele toediening). Alda-1 werd vervolgens eenmaal dagelijks intraperitoneaal toegediend.
MNU + Alda-1 + TUN-groep: Intraperitoneale injectie van Alda-1, gevolgd door TUN-injectie 1 uur later, en MNU-injectie 1 uur daarna. Alda-1 werd vervolgens eenmaal dagelijks intraperitoneaal toegediend.
MNU + Daidzin + SRT1720 groep: Intraperitoneale injectie van Daidzin, gevolgd door SRT1720 injectie 1 uur later, en MNU-injectie 1 uur daarna. Daidzin werd vervolgens eenmaal per dag intraperitoneaal toegediend.
MNU + Daidzin + 4-PBA groep: Intraperitoneale injectie van Daidzin, gevolgd door 4-PBA injectie 1 uur later, en MNU injectie 1 uur daarna. Daidzin werd vervolgens eenmaal per dag intraperitoneaal toegediend.
Lichaamsgewichtmonitoring
Systemische toxiciteit en behandelingsgerelateerde fysiologische effecten werden gemonitord door dagelijks het lichaamsgewicht van elke muis te registreren gedurende vier opeenvolgende dagen na toediening van de MNU. Gewichten werden gemeten met een precisie-digitale weegschaal met een nauwkeurigheid van ±0,1 g, en er werden gegevens gedocumenteerd om trends in gewichtsverlies of -toename tussen groepen te volgen, wat diende als indirecte indicatoren van behandelingstolerantie en systemische stress.
Netvlieshistopathologie onderzoek
Op de momenten van de tweede en vierde dag na het experiment werden muizen geëuthanaseerd door cervicale dislocatie na anesthesie met intraperitoneale (i.p.) injectie van natriumpentobarbital in een dosis van 50–60 mg/kg lichaamsgewicht, strikt volgens de institutionele richtlijnen voor euthanasie. De ogen, met name de linkeroog, werden onmiddellijk geënucleeerd. Voorafgaand aan de enucleatie werd een kleine incisie gemaakt in de nasale limbus om de oriëntatie aan te geven. De bollen werden vervolgens 24 uur lang ondergedompeld in 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgeborsterde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) bij 4 °C voor fixatie. De gefixeerde ogen werden vervolgens gedehydrateerd via een gegradueerde ethanolreeks (70%, 80%, 95% en 100%), gezuiverd in xyleen en ingebed in paraffineblokken voor histologische verwerking. Tijdens het inbedden werd de oriëntatie gestandaardiseerd door de gemarkeerde neuszijde naar beneden te plaatsen.
Seriële secties (5 μm dik) werden voorbereid met behulp van een roterend microtoom door de oogzenuwkop (ONH) om representatieve bemonstering van het centrale netvliesgebied te waarborgen. Specifiek werden secties van het bovenste aspect naar het gemarkeerde neuspunt gesneden, zodat alle secties door de ONH gingen. Secties werden vervolgens gemonteerd op positief geladen glazen schuilbanen. Hematoxyline- en eosinekleuring (HE) werd uitgevoerd volgens standaardprotocollen. De netvliesmorfologie werd geëvalueerd met lichtmicroscopie bij 400× vergroting. Metingen werden systematisch verricht vanaf het temporale netvlies op vooraf bepaalde afstanden van de ONH: 200, 400, 600, 800, 1000 en 1200 μm. Op elke locatie werden de totale netvliesdikte, de binnenste en buitenste segment (IS/OS) lengte, de dikte van de buitenste kernlaag (ONL), de dikte van de buitenste plexiforme laag (OPL) en de binnenste kernlaag (INL) gemeten.
Om objectiviteit te waarborgen en meetvooroordeel te minimaliseren, werd een rigoureus kwaliteitscontroleprotocol geïmplementeerd. Specifiek werd elk van de acht experimentele groepen onderverdeeld in vijf of vier subgroepen (bijv. Subgroep 1, 2, 3, 4, 5). Vijf of vier onafhankelijke waarnemers, blind voor groepstoewijzingen, kregen de opdracht om dezelfde overeenkomstige subgroep te meten over alle experimentele groepen (bijv. Waarnemer A mat altijd Subgroep 1 van elke groep). Bij elk meetpunt werden drie metingen genomen binnen een bereik van ~5 μm (bijvoorbeeld bij 200 μm, 195 μm en 205 μm) en gemiddeld om technische fouten te minimaliseren. Kwantitatieve metingen werden uitgevoerd met ImageJ-software (versie 1.54g), en de gemiddelde dikte voor elk punt werd berekend om reproduceerbaarheid te waarborgen.
Aldehydemetabolismemarkers
Om oxidatieve stress en aldehydemetabolisme te beoordelen, werden serummonsters geanalyseerd op MDA- en 4-HNE-niveaus, die belangrijke biomarkers zijn voor lipideperoxidatie en aldehydestress. Specifiek werden alle muizen verdoofd via intraperitoneale (i.p.) injectie van natriumpentobarbital in een dosis van 50–60 mg/kg lichaamsgewicht. Nadat de muizen diep waren verdoofd, werd de euthanasie uitgevoerd door een cervicale ontwrichting. Direct na euthanasie werden de oogbollen geïnnucleeerd en werd er snel retrobulbair bloed verzameld. De monsters mochten 30 minuten bij kamertemperatuur stollen, gevolgd door centrifugatie bij 3.000 × g gedurende 10 minuten. De serumfractie werd zorgvuldig overgebracht naar enzymvrije microcentrifugebuizen en opgeslagen bij -80 °C tot verdere analyse. De serum MDA-niveaus werden gemeten met commercieel verkrijgbare enzym-gekoppelde immunosorbent-assay (ELISA) kits volgens de protocollen van de fabrikant. Kort gezegd werden standaarden en monsters toegevoegd aan voorgecoate microplaten, geïncubeerd met specifieke primaire antilichamen, gewassen om ongebonden materialen te verwijderen, en gereageerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen. Daarna werd het tetramethylbenzidine (TMB) substraat toegevoegd en de reactie werd beëindigd met zwavelzuur. Optische dichtheid (OD) waarden werden uitgelezen op 450 nm met een microplaatlezer, en MDA/4-HNE concentraties werden bepaald door de OD-waarden te vergelijken met standaardcurves die werden gegenereerd met bekende concentraties van de analyten.
Statistische analyse
Alle gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout (SE). Gezien de kleine steekproefgrootte (n = 5 voor de groep op de tweede dag; n = 4 op de groep op de vierde dag), werden de statistische methoden van de Bootstrap-test toegepast. Specifiek werd de Bootstrap-resamplingmethode (1.000 iteraties met vervanging) gebruikt om 95% betrouwbaarheidsintervallen (BI) voor groepsgemiddelden te schatten en om verschillen tussen groepen te vergelijken. Voor elke uitkomst (bijv. gewicht, netvliesdikte, MDA/4-HNE-niveaus) werden Bootstrap-monsters uit de oorspronkelijke dataset gehaald en werd het gemiddelde berekend voor elke herbemonstering. De 95% BI werd afgeleid van het 2,5een 97,5epercentiel van de bootstrap-verdeling. De significantie werd indirect beoordeeld via de volgende benadering door het betrouwbaarheidsinterval te onderzoeken. Als de CI van de Bootstrap-resultaten geen nul bevatte, gaf dit doorgaans aan dat het verschil significant was (ervan uitgaande dat de gemiddelden tussen twee of meer groepen werden vergeleken). Figuren werden gegenereerd met de Graphpad-software (versie 5.01).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Veranderingen in lichaamsgewicht
Voor het experiment waren er geen significante verschillen in lichaamsgewicht tussen de groepen. Op de tweede dag na het experiment, behalve de controlegroep, die een toename van het lichaamsgewicht liet zien van 17,0 ± 0,5 g naar 17,4 ± 0,4 g, daalde het lichaamsgewicht van muizen in alle andere groepen significant. Specifiek daalden de muizen van de MNU-groep van 17,4 ± 0,3 g naar 16,2 ± 0,2 g, MNU + Alda-1 groep van 17,3 ± 0,3 g naa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Eerdere studies suggereerden dat ALDH2-agonisten beschermende effecten konden bieden tegen door MNU geïnduceerde retinale degeneratie14. De interventie-effecten van de inhibitor, samen met mogelijke downstreamroutes zoals SIRT1 en ERS, waren echter nog niet in detail onderzocht. Er zijn studies die de betrokkenheid van SIRT1 en ERS in modellen van netvliesdegeneratie aantonen, waaronder licht-geïnduceerde retinale degeneratie en genetisch gemodificeerde muizen met...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben geen mogelijke belangenconflicten verklaard met betrekking tot het onderzoek, het auteurschap of de publicatie van dit artikel.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 82301245), de Joint Funds for the Innovation in Science and Technology, provincie Fujian (nr. 2024Y9653), de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (nr. 2024J011148), en de Postdoctoral Science Foundation van het Fuzhou Algemeen Ziekenhuis (subsidienummer: 48678).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4HNE Kit | Elabscience,China | E-EL-0128 | Voor het meten van 4HNE-niveaus in serum |
| 4-Fenylboterzuur (4-PBA) | MCE, US | HY-A0281 | Reagens voor ERS-remming |
| Alda-1 | MCE, US | HY-18936 | ALDH2-activator voor onderzoek |
| Daidzin | MCE, US | HY-N0018 | ALDH2-remmer voor onderzoek |
| Fluoresceïne-natrium | Guangzhou | N/A | Wordt gebruikt voor verkregen met behulp van een fluoresceïne angiografiesysteem. De angiografische beelden werden geanalyseerd op het voorkomen van lekkage, niet-geperfundeerde gebieden of veranderingen in de morfologie van de retinale vaten. |
| ImageJ-software | National Institutes of Health, USA | Versie 1.53t | |
| MDA Kit | Beyotime, China | S0131S | Voor het meten van MDA-niveaus in serum |
| N-Nitroso-N-methylureum (MNU) | MCE, US | HY-34758 | DNA alkyleringsmiddel voor het induceren van retinale degeneratie |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | 30525-89-4 | Wordt gebruikt voor secties van retinaweefsel |
| Precisie digitale weegschaal | Elektronische weegschaal, China | SF-400 | CAPACITY: 5000 g ´ 1 g/177ozX0.10z, gebruikt voor het registreren van het lichaamsgewicht van elke muis |
| Prism | GraphPad | Versie 5.01 | Statistische analysesoftware |
| Roterende microtoom | LEICA, Duitsland | RM2016 | Wordt gebruikt voor de bereiding van retinale secties |
| Selisistat (EX-527) | MCE, US | HY-15452 | SIRT1-remmer voor onderzoek |
| Natriumpentobarbital | Sigma-Aldrich, US | 1.93248 | Wordt gebruikt voor anesthesie voor later onderzoek via intraperitoneale (IP) injectie |
| SRT1720 | MCE, US | HY-10532 | SIRT1-activator voor onderzoek |
| Sumianxin | Jilin Shengda Animal Pharmaceutical Co | N/A | Wordt gebruikt voor anesthesie voor later onderzoek via intraperitoneale (IP) injectie |
| Tunicamycine (TUN) | MCE, US | HY-A0098 | Reagens voor ERS-inductie |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar