Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een combinatoriaal muismodel van circadiane verstoring en dieetstress voor het onderzoeken van levensstijlversnelde verouderingspathofysiologie

254 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/70866

⸱

28 april 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chinese Materia Medica, Chengde Medical University, 2School of Pharmacy, Hebei Medical University, 3State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 4College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei University of Chinese Medicine, 5The Second Clinical Medical College, Heilongjiang University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om een muismodel op te stellen van een verstoord circadiaans ritme plus een vetrijk, suikerrijk (HFHS) dieet, dat ongezonde levensstijlen nabootst en stofwisselingsstoornissen en verouderingsfenotypes veroorzaakt.

Samenvatting

Het doel van dit protocol is het opzetten van een gestandaardiseerd muismodel dat de multifactoriele schade veroorzaakt door moderne, ongezonde levensstijlen reproduceert. Daartoe hebben we een nieuw C57BL/6J-model ontwikkeld dat gerandomiseerde circadiane ritmeverstoring combineert met een vetrijk, suikerrijk (HFHS) dieet, met single-factor HFHS en circadiane verstoringsgroepen als controlegroepen. In vergelijking met de controles toonde het samengestelde model ernstigere metabole aandoeningen, waaronder verhoogd lichaamsgewicht, verhoogde nuchtere glucose- en lipidespiegels, en duidelijke leversteatose, evenals duidelijke cognitieve en motorische beperkingen. Het samengestelde model vertoonde ook een meer significante versnelde veroudering, zoals bevestigd door de frailty-index en de verkleuring van hematoxyline en eosine (HE). Dit geïntegreerde model bootst betrouwbaar levensstijlgerelateerde metabolisch-cognitieve achteruitgang en voortijdige veroudering na. Dit stapsgewijze reproduceerbare protocol ondersteunt mechanistische studies naar levensstijlgemedieerde veroudering en de evaluatie van gerichte therapeutische strategieën.

Inleiding

Versnelde moderne levensstijlen stellen bevolkingen steeds meer bloot aan ritmeverstorend gedrag en obesogene diëten, met overtuigend bewijs dat deze factoren koppelt aan systemische functionele achteruitgang en pathogenese van chronische ziekten1. Epidemiologische gegevens tonen opvallende comorbiditeiten: ploegendienstmedewerkers vertonen een hoge prevalentie van markers voor het metabool syndroom, terwijl langdurige inname van een dieet met veel vet en suiker sterk geassocieerd is met een verhoogd risico op dementie 2,3. Deze beledigingen komen samen om multi-orgaanpathologie te stimuleren—metabole disfunctie valt vaak samen met versnelde cognitieve achteruitgang en cardiovasculaire remodeling, wat bidirectionele crosstalk tussen perifere en centrale achteruitgang aantoont. Ondanks erkende klinische synergieën blijven gestandaardiseerde preklinische modellen die de geïntegreerde pathofysiologie van leefstijl-geïnduceerde orgaanachteruitgang vastleggen onderontwikkeld.

Op moleculair niveau veroorzaakt chronische circadiane misalignment een pathologische cascade die ontstaat in de suprachiasmatische kern, waardoor glutamaterge signalering naar de paraventriculaire hypothalamus wordt verstoord en de pulsatiliteit van corticotropine-releasing hormonen wordt afgestompt. Dit verstoort de negatieve feedback van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) alsnegatieve feedback 4, wat leidt tot desensibilisatie van de glucocorticoïde receptoren en een aanhoudende cortisolverhoging. Daardoor activeren van hepatische gluconeogenese en suppressie van de insulinereceptor substraat-1 in skeletspieren stimuleren samen perifere insulineresistentie, waarmee een metabole basis wordt gelegd voor hyperglykemie en dyslipidemie 5,6. Tegelijkertijd doordringen, verzadigde vetzuren in de voeding de aangetaste bloed-hersenbarrière via downregulatie van endotheliale tight junction-eiwitten 7,8, waardoor microgliale TLR4/NF-κB-signaal wordt geactiveerd. Dit veroorzaakt TNF-α/IL-1β-gemedieerde neuro-ontsteking9. Het belangrijkste punt is dat deze twee ongezonde leefstijlfactoren niet onafhankelijk van elkaar werken, maar juist synergetisch. Er blijft echter een aanzienlijk gebrek aan systematisch onderzoek naar hun gecombineerde blootstelling in de huidige literatuur. Daarom is het zinvol om modelleringsstudies uit te voeren waarin circadiane ritmestoorzaken worden geïntegreerd met vet- en suikerrijke diëten als samengestelde factoren.

Ondanks hun nut bij het bestuderen van geïsoleerde verouderingsmechanismen, slagen huidige muismodellen er niet in de geïntegreerde pathofysiologie van door levensstijl veroorzaakte achteruitgang te reproduceren. Natuurlijke veroudering vertoont uitgesproken variabiliteit tussen individuen en vereist langdurige tijdslijnen die onverenigbaar zijn met experimentele efficiëntie. Farmacologische middelen zoals doxorubicine veroorzaken voornamelijk DNA-schade en acute veroudering zonder chronische metabole disregulatie te repliceren10. Genetisch gemodificeerde modellen richten zich op enkele moleculaire routes, waarbij systemische neuro-endocrine-metabole kruisspraak11,12 wordt genegeerd. D-galactose toediening, hoewel het oxidatieve stress induceert, bootst onvoldoende de impact van circadiane verstoring op de ritmeste van glucocorticoïde of dieet-lipide-gemedieerde neuro-inflammatie13. Cruciaal is dat single-factor interventies geen synergetische multi-orgaanafdalingspatronen kunnen vastleggen die klinisch worden waargenomen. Deze translationele kloof vereist een geavanceerd combinatorisch platform dat tegelijkertijd chronische circadiane verstoring en obesogene voedingsstressfactoren integreert om onderling afhankelijke neurodegeneratie, hartstoornissen en metabole stoornissen trouw te versnellen.

Om dit probleem aan te pakken, hebben we een C57BL/6J-muismodel ontwikkeld dat stochastische circadiane verstoring combineert met een vet- en suikerrijk dieet om synergetische hedendaagse leefstijlbeledigingen te recongamen. Het onderwerpen van muizen aan roterende lichtschema's in combinatie met aanhoudend obesogene voeding veroorzaakte significant verergerde metabole destress, waaronder verhoogde vetheid, nuchtere hyperglykemie en dyslipidemie. Cognitieve beoordelingen toonden uitgesproken tekorten in ruimtelijk en herkenningsgeheugen aan, terwijl locomotorische tests een verminderde uithoudingsvermogen aangaven. Cruciaal is dat longitudinale kwantificering van de kwetsbaarheidsindex een versnelde ophoping van leeftijdsgerelateerde tekorten aantoonde. Ons dual-challenge-paradigma recapituleert dus op robuuste wijze veelzijdige versnelde veroudering, waarmee het een gevalideerd nieuw platform biedt om levensstijlgedreven pathofysiologie te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dieronderzoek van het Hebei Yiling Farmaceutisch Onderzoeksinstituut (Goedkeuringsnummer: N2024043). Tweeëndertig mannelijke C57BL/6J-muizen van 8 maanden oud (zie Materiaaltabel) werden gehuisvest in een specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) dierenfaciliteit die verbonden is aan het New Drug Evaluation Center, Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute. De opgroeiomgeving werd gehandhaafd onder gestandaardiseerde omstandigheden: de omgevingstemperatuur varieerde van 20–26 °C, de relatieve luchtvochtigheid werd geregeld op 40%–70%, en er werd een 12-uur licht/12-uur donkercyclus ingevoerd. De muizen hadden vrije toegang tot een standaard laboratoriumdieet van knaagdieren en gesteriliseerd drinkwater.

1. Opzet van een combinatorisch muismodel van circadiaanse verstoring en dieetstress (Figuur 1)

OPMERKING: Dieren die onverwacht tijdens het experiment overleden, ernstig gewichtsverlies vertoonden of de modelleringsprocedure niet voltooiden, werden uitgesloten van de eindanalyse. Het aanvankelijke aantal dieren was 8 per groep, en de uiteindelijke geldige steekproefgrootte was 5 per groep.

  1. Bereid een dieet met veel vet/suiker (HFHS) voor (zie Materiaaltabel) en een onafhankelijke kamer uitgerust met een programmeerbare timer voor flexibele licht-donker cyclusregeling vóór het experiment.
    OPMERKING: Bewaar het dieet bij 4 °C of -20 °C om oxidatie te voorkomen; Breng het op kamertemperatuur voordat je het gebruikt om condensatie te voorkomen dat het de samenstelling beïnvloedt.
  2. Dieradaptatie en willekeurige groepering
    1. Houd alle muizen van 8 maanden onder standaardomstandigheden voor een adaptieve voedingsperiode van 7 dagen voordat het experiment begint.
    2. Verdeel muizen willekeurig in vier groepen op basis van lichaamsgewicht (n = 8 per groep) na de aanpassingsperiode: controlegroep, gecombineerde stressmodel (model)groep, HFHS-groep en circadiane ritmeverstoring (CR) stressgroep.
  3. Voer een 8-maandelijkse interventie toe van het HFHS-dieet gecombineerd met verstoring van het circadiane ritme aan de groep van het gecombineerde stressmodel. Voed de HFHS-groep met een HFHS-dieet alleen voor dezelfde duur.
  4. Laat de CR-groep alleen al blootstellen aan circadiane ritmeverstoring. Geef de controlegroep gedurende het hele experiment een standaard onderhoudsdieet. Bied gratis toegang tot drinkwater voor alle dieren.
    OPMERKING: De 8-maanden interventie kan tijdelijk worden gepauzeerd (bijvoorbeeld voor routinematige gezondheidscontroles van muizen) zonder dat het experimentele resultaat wordt beïnvloed, en de interventie kan worden hervat nadat de controle is afgerond.
  5. Protocol voor circadiane ritmestoordrijving (Figuur 2A,B)
    1. Gebruik een programmeerbare timer (zie Materiaaltabel) om flexibel de wekelijkse licht-donkercyclus te regelen. Pas vier verschillende lichtregimes toe: snelle licht-donker schakeling (afwisselend licht en donker elke 7 minuten gedurende 2 opeenvolgende uren per dag), omgekeerde licht-donker cyclus (licht uit om 8:00 en aan om 20:00 uur per dag), constant licht (24-uur verlichting) en constant donker (24 uur donker).
    2. Genereer aan het begin van elke week een willekeurige reeks met statistische software (R-taal, met een vaste willekeurige seed). Wijs de vier lichtmodi willekeurig toe aan elke dag van de week om ervoor te zorgen dat elke modus 1–2 dagen achter elkaar wordt toegepast.
  6. Geef de muizen het HFHS-dieet ad libitum en houd wekelijks de voedselinname in de gaten. De gedetailleerde samenstelling van het HFHS-dieet wordt weergegeven in Tabel 1.
    OPMERKING: Het inspecteren van de voedselvoorziening is vereist om ondervoeding of voedseltekort te voorkomen.
  7. Weeg muizen wekelijks op een vast tijdstip (9:00 uur op donderdag) met een elektronisch saldo tijdens de interventieperiode van 8 maanden. Noteer alle gegevens over het lichaamsgewicht in detail.
    OPMERKING: Voer het weegproces snel uit (elke sessie in minder dan 30 seconden afgerond) om stress en verstoring van het circadiane ritme te minimaliseren.

2. Nieuwe objectherkenning

  1. Plaats de muizen een dag voor de training in een testbox van 60 cm × 60 cm × 40 cm en laat ze 5 minuten vrij verkennen om te wennen aan de testomgeving.
    OPMERKING: Verwijder na elke proef de ontlasting en urine uit de doos. Veeg de doos af met 75% ethanol om restgeuren te verwijderen.
  2. Plaats twee identieke cilinders (A en B) respectievelijk in de linkerbeneden- en rechterbenedenhoek van de testbox. Zet elke muis in de doos met de rug van de objecten en laat de muis 5 minuten vrij verkennen.
    1. Wissel willekeurig de links-rechts posities van de twee cilinders af tussen de proefpersonen om positionele bias te voorkomen.
    2. Na de 5-minuten durende verkenningstraining wordt het experiment tot 23 uur gepauzeerd en de daaropvolgende nieuwe objectvervangingsstap (stap 2.3) binnen 24 uur na training voltooid om de geldigheid van de herkenningstest te waarborgen.
  3. Vervang object A linksonder door een nieuwe kubus (object C) 24 uur na training. Activeer de bovencamera. Plaats de muis in de doos en registreer het gedrag gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Gebruik een nieuw object dat qua grootte vergelijkbaar is met de bekende objecten, maar duidelijk verschilt in materiaal, kleur of textuur, zodat de muis de nieuwigheid ervan kan herkennen.
  4. Analyseer de video's met behulp van het videotrackingsysteem (zie Materiaaltabel).
    1. Definieer verkenning als de muis die zijn snuit richt op of binnen 2 cm van een object. Noteer de tijd die je besteedt aan het verkennen van het bekende object (TB) en het nieuwe object (TC).
    2. Bereken een herkenningsindex volgens de volgende formule: Herkenningsindex = TC / (TB + TC) × 100%.
      OPMERKING: Houd de analist blind voor de experimentele groepen om subjectieve bias te voorkomen; Sluit niet-verkennend gedrag zoals klimmen of knagen systematisch uit uit de verkenningstijdregistraties.

3. Gripsterktetest

  1. Meet de gripsterkte van de voorpoot van de muizen met een gripsterktemeter14 (zie Materiaaltabel). Draai de krachtmeter 90 graden verticaal en bevestig hem stevig op een metalen standaard voor elke testsessie om volledige immobilisatie van het systeem te garanderen.
  2. Houd de muis voorzichtig vast bij de staartbasis. Laat de voorpoten de stang natuurlijk vastgrijpen. Zet de meter op nul nadat de meting stabiel is, en trek dan de staart horizontaal naar achteren met een constante, trage snelheid totdat de muis zijn greep loslaat.
  3. Noteer de maximale piekkracht (kgf) op het moment van loslaten als de gripsterkte. Voer drie opeenvolgende proeven per muis per dag uit. Gebruik het gemiddelde van drie metingen voor verdere analyse.
    OPMERKING: Houd de treksnelheid uniform en laag genoeg zodat de muis volledige weerstand kan genereren tegen de trek.
  4. Sluit elke proef uit als een van de volgende situaties zich voordoet: de muis gebruikt slechts één voorpoot, de achterpoten raken de stang of dragen bij aan grip, de muis draait zijn lichaam tijdens het trekken, of de stang wordt losgelaten zonder actieve weerstand.
    OPMERKING: Meld ambigu of uitschieters voor beoordeling. Herhaal de metingen wanneer nodig.

4. Kwetsbaarheidsindex (FI)

OPMERKING: Kalibreer alle apparatuurparameters op gestandaardiseerde instellingen vóór de test. Beperk de totale beoordelingstijd per muis tot minder dan 30 minuten om vermoeidheidsgeïnduceerde fenotypische veranderingen te voorkomen. Voer alle tests uit binnen een vast ochtendtijdvenster (9:00–12:00 uur) om de effecten van het circadiane ritme te minimaliseren.

  1. Vasten de muizen 12 uur met vrije toegang tot water voorafgaand aan de tests om de acute effecten van voedselinname op fysiologische metingen te minimaliseren.
  2. Breng de muizen 30 minuten voor de beoordeling naar de testomgeving om ze te laten acclimatiëren en stressgerelateerde interferentie te verminderen.
  3. Sluit muizen met ernstige pathologische aandoeningen zoals tumoren, infecties of ledemaatafwijkingen uit om verstorende effecten op kwetsbaarheidsbeoordeling te voorkomen.
  4. Evalueer de kwetsbaarheidsindex op basis van 31 fenotypische tekortindicatoren over vijf domeinen: motorische functie, voedingsstatus, sensorische functie, spontane activiteit en gedrag, en fysiologische defecten15,16.
    OPMERKING: De specifieke 31 beoordelingsitems bestrijken vijf domeinen, waaronder: motorische functie (7 items zoals verminderde gripkracht, abnormale loopstijl en verminderd klimvermogen), voedingsstatus (6 items zoals gewichtsverlies, verlaagde lichaamsconditiescore en verminderde voedselinname), zintuiglijke functie (5 items zoals visuele beperking, gehoorverlies en tactiele dofheid), spontane activiteit en gedrag (7 items zoals verminderde spontane activiteit, verminderd verzorgingsgedrag en minder verkennend gedrag), en fysiologische defecten (6 zaken zoals oogafwijkingen, oorafwijkingen en huidafwijkingen). Alle items hanteren een binaire scoringsmethode (0 = geen defect, 1 = met defect), en de uiteindelijke kwetsbaarheidsindex = totaal aantal defecte items / 31.
  5. Wijs twee onderzoekers toe die blind zijn voor de experimentele groepen om alle evaluaties onafhankelijk uit te voeren.
  6. Beoordeel elke indicator op 0 (geen tekort) of 1 (tekort) volgens vooraf gedefinieerde criteria die gripsterkte, loopsnelheid, verandering in lichaamsgewicht, vachtconditie, sensorische respons, spontane activiteit en fysieke afwijkingen omvatten.

5. Nuchtere bloedsuikerwaardering

OPMERKING: Snelle muizen gedurende 12 uur met vrije toegang tot water om acute voedingsgerelateerde effecten op de bloedsuiker te minimaliseren. Voer metingen uit tussen 9:00 uur en 12:00 uur om circadiane fluctuaties te verminderen. Kalibreer de glucometer met een standaard glucoseoplossing vóór het experiment voor consistentie tussen batches.

  1. Bind de muizen voorzichtig vast en desinfecteer de staartpunten met 75% ethanol. Maak een incisie van 1–2 mm in de staartaren met een steriele wegwerplancet. Gooi de eerste druppel bloed weg om vervuiling met weefsel en vloeistof te voorkomen.
  2. Verzamel een kleine hoeveelheid capillair bloed en analyseer deze onmiddellijk met een draagbare glucometer (zie Materiaaltabel) met compatibele teststrips zelf. Test elk monster in duplicaat om de nauwkeurigheid van de data te waarborgen.

6. Bloedlipidendetectie omvatte het totale cholesterol (TC)

OPMERKING: Sluit monsters met ernstige hemolyse of troebelheid uit van de analyse. Herhaalde metingen met een variatiecoëfficiënt > 10% tussen driedubbele exemplaren.

  1. Plaats het verzamelde bloed in niet-anticoagulante buizen. Laat het natuurlijk stollen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Centrifugemonsters op 1000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om het serum te scheiden.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de centrifuge goed in balans is voordat je hem in gebruik neemt, en sluit het veiligheidsdeksel stevig.
  2. Aspireer voorzichtig de bovenste serumlaag, aliquot deze en bewaar onmiddellijk bij -80 °C om lipidevergifting te voorkomen.
    OPMERKING: Na serum-aliquotering en opslag bij -80 °C kan het experiment enkele dagen tot weken worden gepauzeerd; De daaropvolgende totale cholesteroldetectie (stap 6.3) kan worden uitgevoerd wanneer de testkit en apparatuur klaar zijn, zodat het serum niet herhaaldelijk wordt bevroren en ontdooid.
  3. Meet het totale cholesterolgehalte van het serum met een commerciële TC-testkit van Greiss (zie Tabel van Materiaal) volgens de instructies van de fabrikant. Test elk monster in drievoud en voer standaard referentiemonsters gelijktijdig uit voor kalibratie.

7. Hematoxyline-eosine-kleuring (HE-kleuring)

  1. Narcose muizen met natriumpentobarbital (20 mg/kg) na gedragstests.
  2. Verzamel bloed via de retro-orbitale veneuze plexus. Ontleed weefsels en fix 4% paraformaldehyde gedurende 48 uur.
    OPMERKING: Na weefselfixatie in 4% paraformaldehyde gedurende 48 uur kan het experiment worden gepauzeerd; Vaste weefsels kunnen tot 1 week worden opgeslagen in 4% paraformaldehyde bij 4 °C voordat men doorgaat met de dehydratiestap (stap 7.3).
  3. Gedroogde weefsels fixeerde met een geautomatiseerde verwerker die een gegradueerde ethanolserie gebruikte (60%, 70%, 90% ethanol voor 1 uur elk; 95%, 100% ethanol voor 2 uur elk).
    VOORZICHTIG: Ethanol is een brandbare vloeistof met een laag vlampunt. Blijf tijdens opslag en gebruik uit de buurt van open vlammen, warmtebronnen en vonken. Gebruik in een goed geventileerde ruimte, draag niet-statische handschoenen en een labjas. Vermijd grote opslag in het experimentele gebied; Bewaar in een speciale kast met brandbare vloeistoffen.
  4. Maak gedehydrateerd weefsel 2 uur schoon in xyleen, en infiltreer vervolgens met paraffine bij 60 °C gedurende 3 uur (zie Materiaaltabel). Inbed weefsels die georiënteerd zijn op standaard anatomische vlakken.
    OPMERKING: De clearingtijd mag niet overdreven lang zijn om brosheid van het weefsel te voorkomen; Houd een constante paraffinetemperatuur tijdens de infiltratie om kristallisatie te voorkomen. Na paraffine-inbedding kunnen de ingebedde weefselblokken enkele maanden bij kamertemperatuur worden bewaard, en kan de sectiestap (stap 7.5) worden uitgevoerd wanneer dat nodig is.
  5. Zodra paraffineblokken volledig zijn gestold, snijd je 4 μm doorlopende secties met een paraffinesnijder (zie Materiaaltabel), breng je over op poly-L-lysine gecoate glaas, droog je aan de lucht bij kamertemperatuur en sluit je af voor opslag.
    OPMERKING: Na het monteren van secties en het aan de lucht drogen kunnen de dia's tot 1 maand op kamertemperatuur in een stofvrije omgeving worden bewaard voordat ze doorgaan met de kleuringsstap (stap 7.6).
  6. Beits secties met een automatisch kleursysteem (zie Materiaaltabel).
    1. Deparaffineer in xyleen I en xyleen II (elk 10 min).
    2. Hydrateer via een dalende ethanolreeks (100%, 95%, 80%, 2 minuten elk), en spoel daarna af met gedestilleerd water.
    3. Kleur met hematoxyline gedurende 3–8 minuten totdat de kernen duidelijk zichtbaar zijn, spoel onder stromend water om blauwvorming te bevorderen, en contrastkleur met eosine gedurende 1–3 minuten om een adequate cytoplasmatische roze kleuring te bereiken.
  7. Gedroogde gekleurde secties in absolute alcohol, clear in xyleen, en monteer met neutrale balsem voor analyse van de dia-scanner (zie Materiaaltabel).

8. Oil Red O-kleuring

  1. Leg verse leverweefsels in een verbinding met optimale snijtemperatuur (OTC) (zie Materiaaltabel) binnen 30 minuten na verzameling.
    OPMERKING: Na het inbedden van verse leverweefsels in een vrij verkrijgbare verbinding kunnen de ingebedde weefsels tot 1 maand bij -80 °C worden bewaard vóór het snijden (stap 8.3), waarbij herhaald bevriezen en ontdooien wordt vermeden.
  2. Plaats ingesloten weefsels in een cryostaat en laat ze volledig bevriezen voordat je ze in secties plaatst.
  3. Stel de cryostattemperatuur in op -22 °C en snijd volledig bevroren weefselblokken in opeenvolgende secties van 8 μm dik.
  4. Breng secties direct over op ongecoate glazen schuilen en maak ze voorzichtig glad om een strakke hechting tussen secties en schuilen te garanderen.
  5. Bevestig slides met neutrale formaline op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Direct na fixatie spoel je secties 5 seconden af met 60% isopropanol.
  6. Plaats voorbehandelde secties in een vochtigheidskamer, voeg Oil Red O-kleuroplossing toe (zie Materiaaltabel) en incubeer 20 minuten.
  7. Na de kleuring differentieer je secties met 60% isopropanol totdat de grenzen van de lipidendruppel en het interstitiële weefsel duidelijk te onderscheiden zijn.
    OPMERKING: Houd de secties tijdens differentiatie nauwlettend in de gaten om overdifferentiatie te voorkomen, wat vervaagde kleuring veroorzaakt.
  8. Onderzoek gedifferentieerde gekleurde secties onder een lichtmicroscoop om histopathologische veranderingen gerelateerd aan leverlipidenafzetting te observeren.
    OPMERKING: Na kleuring en differentiatie kunnen secties tot 3 dagen bij 4 °C worden bewaard vóór microscopisch onderzoek, zodat het kleuringseffect niet wordt aangetast.

9. Statistische analyse

  1. Druk alle experimentele gegevens uit als gemiddelde ±± standaardfout van het gemiddelde (SEM)
  2. Pas de Shapiro-Wilk-test toe om te verifiëren of de gegevens voldoen aan een normale verdeling. Voer de Levene-test uit om homogeniteit van variantie tussen groepen te evalueren als normaliteit wordt bevestigd.
    OPMERKING: Pas niet-parametrische tests direct uit als de data niet voldoet aan de normaliteitsaanname.
  3. Gebruik eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) om de statistische significantie van de totale verschillen tussen meerdere groepen te testen, en voer paargewijze vergelijkingen uit met behulp van de Fisher's least significant difference (LSD) test.
    OPMERKING: Gebruik in plaats daarvan Welch ANOVA wanneer de varianties heterogeen zijn.
  4. Gebruik een tweezijdige Student's t-test voor vergelijkingen tussen twee onafhankelijke steekproefgroepen.
  5. Definieer statistische significantie als een tweezijdige p-waarde < 0,05. Voer alle statistische analyses uit met behulp van statistische analysesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Synergetische verergering van de metabole pathologie in dual-exposure cohorten
Longitudinale lichaamsgewichtsmonitoring toonde duidelijke groeitrajecten tussen cohorten. De modelgroep en de HFHS-groep vertoonden een versnelde gewichtstoename vergeleken met zowel de controle- als de CR-groep. Opmerkelijk is dat de CR-groep een bescheiden versnelling vertoonde ten opzichte van Control (Figuur 3A). Verder bewijs van metabole disfunctie werd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hedendaags onderzoek heeft ondubbelzinnig bevestigd dat circadiaanse verstoring en een vetrijk, suikerrijk dieet twee onafhankelijke oorzaken zijn van systemische functionele achteruitgang van het organisme. Onze gegevens tonen aan dat de pathologische schade veroorzaakt door de gecombineerde werking van deze twee factoren veel ernstiger is dan het eenvoudige additieve effect van een van beide op zich. In vergelijking met de single-factor interventiegroepen toonde de samengestelde modelg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Science and Technology Program Project van Hebei (246W2501D, 252W7716D), S&T Program van Hebei (24462501D) en Yanzhao Golden Platform (A20240022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ANY-mazeScienceSA225
Accu-Chek Active BloedglucosemeterZwitserland, Roche Diagnosticsaccu check active
C75BL/6J muizenBEIJING HFK BIOSCIENCE CO.,LTDNo.110324241101250228
GrijpsterktemeterVS, Columbus Instruments1027CSM-E54
Dieet met veel vet en hoge sucroseChina, Xietong Biotechnology Co., Ltd.XT303
HistoCore MULTICUT - Semi-Automatische Roterende MicrotomeDuitsland, LeicaRM2245
Oil Red O oplossingChina, Wuhan Servicebio Technology Co., Ltd.G1260
Optimale snijtemperatuurcompoundJapan, Sakura4583
Programmeerbaar TimerstopcontactChina, GONEOGND-1
Tissue Tech Prisma PlusJapan, Sakura20B2X00014000034
Tissue-Tek TEC 6 InbeddingsmoduleJapan, SakuraM01-021E-02
Totaal Cholesterol (TC) Assay KitChina, Suzhou Grace Biotechnology Co., Ltd.G0909W

Referenties

  1. Wang, F., et al. Meta-analysis on night shift work and risk of metabolic syndrome. Obes Rev. 15, 709-720 (2014).
  2. Zhang, S., et al. Associations of sugar intake, high-sugar dietary pattern, and the risk of dementia: a prospective cohort study of 210,832 participants. BMC Med. 22, 298 (2024).
  3. Yeomans, M. R., Armitage, R., Atkinson, R., Francis, H., Stevenson, R. J. Habitual intake of fat and sugar is associated with poorer memory and greater impulsivity in humans. PLoS One. 18, e0290308 (2023).
  4. Sharma, V. K., Singh, T. G. Chronic stress and diabetes mellitus: Interwoven pathologies. Curr Diabetes Rev. 16, 546-556 (2020).
  5. Kaikaew, K., Steenbergen, J., van Dijk, T. H., Grefhorst, A., Visser, J. A. Sex difference in corticosterone-induced insulin resistance in mice. Endocrinology. 160, 2367-2387 (2019).
  6. Guillaume-Gentil, C., Assimacopoulos-Jeannet, F., Jeanrenaud, B. Involvement of non-esterified fatty acid oxidation in glucocorticoid-induced peripheral insulin resistance in vivo in rats. Diabetologia. 36, 899-906 (1993).
  7. Gori, M., et al. Palmitic acid affects intestinal epithelial barrier integrity and permeability in vitro. Antioxidants (Basel). 9 (5), 417 (2020).
  8. Dong, Q., et al. Effects of Tremella fuciformis polysaccharides on intestinal barrier and its functional mechanism. Mycosystema. 44 (03), 104-113 (2025).
  9. Velloso, L. A., Folli, F., Saad, M. J. TLR4 at the crossroads of nutrients, gut microbiota, and metabolic inflammation. Endocr Rev. 36, 245-271 (2015).
  10. Marques, M., et al. Doxorubicin induces a senescent phenotype in murine and human astrocytes. J Neurochem. 169, e70177 (2025).
  11. Krüger, P., et al. Inflammation and fibrosis in progeria: Organ-specific responses in an HGPS mouse model. Int J Mol Sci. 25 (17), 9323 (2024).
  12. Cristòfol, R., et al. Neurons from senescence-accelerated SAMP8 mice are protected against frailty by the sirtuin 1 promoting agents melatonin and resveratrol. J Pineal Res. 52, 271-281 (2012).
  13. Azman, K. F., Safdar, A., Zakaria, R. D-galactose-induced liver aging model: Its underlying mechanisms and potential therapeutic interventions. Exp Gerontol. 150, 111372 (2021).
  14. Takeshita, H., et al. Modified forelimb grip strength test detects aging-associated physiological decline in skeletal muscle function in male mice. Sci Rep. 7, 42323 (2017).
  15. Whitehead, J. C., et al. A clinical frailty index in aging mice: comparisons with frailty index data in humans. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, 621-632 (2014).
  16. Feridooni, H. A., Sun, M. H., Rockwood, K., Howlett, S. E. Reliability of a frailty index based on the clinical assessment of health deficits in male C57BL/6J mice. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 70, 686-693 (2015).
  17. Zhang, Y., Chu, J. M., Wong, G. T. Cerebral glutamate regulation and receptor changes in perioperative neuroinflammation and cognitive dysfunction. Biomolecules. 12 (4), 597 (2022).
  18. Fujiwara, M., Ferdousi, F., Isoda, H. Investigation into molecular brain aging in senescence-accelerated mouse (SAM) model employing whole transcriptomic analysis in search of potential molecular targets for therapeutic interventions. Int J Mol Sci. 24 (18), 13867 (2023).
  19. Ong, J., et al. Senescence accelerated mouse-prone 8: a model of neuroinflammation and aging with features of sporadic Alzheimer's disease. Stem Cells. 43 (2), sxae091 (2025).
  20. Linders, A. N., et al. A review of the pathophysiological mechanisms of doxorubicin-induced cardiotoxicity and aging. NPJ Aging. 10, 9 (2024).
  21. Sadigh-Eteghad, S., et al. D-galactose-induced brain ageing model: A systematic review and meta-analysis on cognitive outcomes and oxidative stress indices. PLoS One. 12, e0184122 (2017).
  22. Kohsaka, A., et al. High-fat diet disrupts behavioral and molecular circadian rhythms in mice. Cell Metab. 6, 414-421 (2007).
  23. Morris, C. J., Purvis, T. E., Hu, K., Scheer, F. A. Circadian misalignment increases cardiovascular disease risk factors in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E1402-E1411 (2016).
  24. Latimer, M. N., Rhoads, M. K., Reynolds, L. D., Pollock, D. M. Chronic circadian stress impairs blood pressure and sodium homeostasis in a diet- and sex-specific manner. Am J Physiol Renal Physiol. 330, F186-F198 (2026).
  25. Joo, J., et al. The acute effects of time-of-day-dependent high fat feeding on whole body metabolic flexibility in mice. Int J Obes (Lond). 40, 1444-1451 (2016).
  26. Pati, P., et al. Time-restricted feeding reduces cardiovascular disease risk in obese mice. JCI Insight. 10 (4), e160257 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Vetrijk dieetsuikerrijk dieetmetabole stoornissencognitieve beperkinghepatische steatosefragiliteitsindex
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.